Summary
GABA能突触前抑制是在脊髓电机和脊髓网络感官信号集成的重要功能强大的抑制机制。底层的初级传入去极化可以通过记录背根电位（DRP）来测量。在这里，我们证明在体内录音DRP小鼠的方法。
Abstract
突触前抑制是在脊髓中的最有力的抑制机制之一。底层的生理机制是通过GABA能轴突 - 轴突突触（初级传入去极化）介导的初级传入纤维的去极化。初级传入去极化强度可以通过录音的音量进行电位在背根（背根电位，DRP）进行测量。突触前抑制的病理改变是至关重要的某些疼痛疾病的中央异常处理和电机兴奋的有些失常。在这里，我们描述了记录的DRP的方法体内对小鼠。在麻醉动物，并用吸电极记录过程脊髓背根的编制进行了说明。这种方法允许测量GABA能DRP和由此估计在活小鼠脊髓突触前抑制。与转基因小鼠模型的组合，DRP记录可能本身相比于体外分离脊髓的准备工作， 如同时记录或操纵棘上网络和感应DRP由外周神经刺激的可能性RVE作为一种强大的工具，调查疾病相关的脊髓病理生理学。 在体内录音有几个优点。
Introduction
突触前抑制是在脊髓中的最有力的抑制机制之一。它抑制兴奋性突触后电位（EPSPS）的单突触兴奋运动神经元而不改变突触后膜电位和运动神经元1-3的兴奋性。通过GABA能轴突轴突突触上诱导突触前感觉纤维初级传入去极化（PAD）是底层机制4-7（参见Figure1a）。这些突触含有GABA A和 GABA B-受体（GABA A R和γ-氨基丁酸乙 R）。 GABA A R活动导致的增加，氯电导而引发的PAD由于当地离子分布。这种去极化块的动作电位传播到轴突终末并降低其强度，导致降低的Ca 2 +内流和减少递质释放。 γ-氨基丁酸乙受体的激活并没吨有助于垫，但导致减少的Ca 2 +内流，从而提高突触前抑制的。而GABA A R的激活似乎涉及短期的抑制作用，γ-氨基丁酸乙 R的参与长期调制8-10。除了γ-氨基丁酸，占PAD和突触前抑制的主要部分，其它发射机系统也可能调节和促进这一机制11,12。
在突触前抑制病理变化似乎是至关重要的几种疾病状态，例如外周炎症和神经性疼痛13,14，以及异常的中枢性疼痛的处理15，脊髓损伤16，和中枢神经系统疾病与兴奋马达由有缺陷的GABA能传输17介导的18。因此，推定的突触前抑制是值得研究的实验病理条件下在体内对脊髓水平7的刺激后进行测量。
DRP的第一测量已经报道在猫和青蛙19，并深入研究了猫被埃克尔斯，施密特等人在20世纪70年代初3,4,20,21。而DRP猫22和大鼠23 在体内的记录已被广泛使用，在小鼠中测量已经几乎完全执行在体外分离的脊髓制剂15,24。在这里，我们描述了一种方法， 在体内 ，允许直接测量突触前抑制在完整有机体的记录DRP麻醉小鼠。
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Protocol
在下面的协议中提到的所有实验程序批准了图林根州当局（图林根森Landesamt献给Verbraucherschutz，Reg.-Nr. 02-044/12）。
1。准备实验
- 吸电极的制作
- 使用标准的高硼硅玻璃毛细管用一个微量拉马， 比如一个标准的贴片电极拔微量。
- 制动用金刚石文件到尖端的0.5-1毫米（比背根的直径稍大）直径的电极。
- 热打磨尖，所以它不会损害后根当它被吸入。标准实验室火炬将是合适的。
- 装入玻璃长丝上连接，通过该负压可以应用注射器的电极保持器。
- 溶液的制备
- 注射麻醉小鼠：混合0.75毫升氯胺酮10％，0.24毫升甲苯噻嗪2％第二5毫升0.9％的生理盐水。该溶液的10微升/克体重（BW）将腹膜内注射（IP）。
- 人工脑脊液（ACSF）：稀释在双蒸水中下列盐（毫米）：134氯化钠，氯化钾3，KH 2 PO 4 1.25;硫酸镁4•H 2 O 2;的NaHCO 3 25， 氯化钙 2，D-葡萄糖10。加H 2 O 2至0.003％的最终浓度。始终使用新鲜配制的溶液。
- （ 图2）录像设置的制备
- 该放大器连接到PC接口，用于数字化数据。
- 使用基于PC的程序或模拟定时器触发方波脉冲刺激器和数据采集在PC上的硬盘驱动器。
- 使用连接到标准的玻璃电极持有人作为刺激和记录氯化silverwires。
- 组装3操纵刺激，记录和参比电极周围分别立方米otactic帧为小鼠，以使所有的电极可使用所制备的脊髓以后。
- 连接管及注射器电极持有人是苹果应用负压。
2。总评动物实验和动物准备录制程序
- 利用老鼠根据各自的机构动物护理和使用委员会的指导方针进行的所有实验。深麻醉下确保动物的痛苦最小化执行所有的手术和录音。
- 通过腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的动物（125毫克及每氯胺酮和甲苯噻嗪，克BW 8毫克分别与上述制备的溶液中加入10μl/ g体重）。如果在长期的录音需要，额外注资可制成IP或即时通讯
注意：重复肌肉注射0.05-0.1毫升在大腿上部的氯胺酮/甲苯噻嗪溶液已被证明是合适的以保持动物在深麻醉长达3小时。 - 使用上的眼睛兽医药膏，以防止肌肤干燥，同时在麻醉下。
- 固定在动物的头在立体定位框架，并使用加热垫与直肠探头和反射环路在实验过程中，以控制该动物的体温。在立体定位框架中的脊髓固定是没有必要的。
- 开始前的准备，通过小鼠脚趾之间眨眼反射及抽搐检查麻醉深度。反射应予废除。
- 打开沿从上胸椎水平降低腰椎区域用解剖刀将得到一个清晰的操作领域的脊髓上方中线皮肤。不要使用剪刀，使皮肤切口。小心松从下面的组织的皮肤上。在随后的步骤中保持了0.9％的生理盐水湿润的伤口。
- 用手术刀和剪刀切筋，并从腰部椎骨到胸椎水平两侧的结缔组织。 取出棘突和结缔组织休息大约用小钳子椎骨。
- 小心地从腰的水平（L4/L5）在解剖显微镜下钳板开始椎骨开裂。推钳板的尖端在椎骨和脊髓之间的空间，并解除骨片分开。不要伤害硬脑膜，避免压到脊髓。两者都是成功的关键。保持脊髓在整个过程中湿润。进入中旬胸椎水平。
3。分离背根和DRP记录（图2）
- 开启时小心使用细针（30克）与弯曲尖端硬膜。使用学联从现在开始，润燥。
- 使用压力表分离背根尽可能切成两个相邻的根作为远端越好。剧烈分离期间拉动根部影响了实验的成功。
- 降低吸电极下降到了吗RSAL根。添加尽可能多的脑脊液脊髓越好，因为液体有助于在背根吮吸。
- 通过注射器施加负压吸一脊神经后根切断端插入一块玻璃移液管。如果需要的话，用细针将背根的电极开口的前面。
- 如果背根位于干抽吸电极内，加入适量的脑脊液至其尖端而小心抽吸，直到吸液管被充分地充满脑脊液。
- 后脊神经后根被吸入，从脊髓提高电极尖端。要小心，枪头和脊髓短路记录/刺激电极之间没有“水桥”。
- 为同侧相邻根重复步骤3.3-3.6。
- 定位参比电极尽可能接近的背根，并保持它通过应用学联湿润。
- 通过建立该记录的设置，一个根已经选择了刺激，其他记录。提高电压，同时逐步从第二背根记录在电流钳模式下完成。有人可能会注意到一个短向下偏转后面是一个缓慢的，长期的向上偏转代表DRP。
- 调整激励电压，以超强的水平，并记录多次扫描（至少20 - 30次扫描/背根在0.1赫兹，0.3赫兹，3 kHz滤波器）。
- 记录三刺激（100赫兹）短列车，以获取有关DRP的时间依赖性求和信息。
- 切换记录和刺激部位额外的对侧录音。
- 动物并非旨在生存的过程。斩首最后一次录音后牺牲动物，而仍然在深度麻醉（氯胺酮/赛拉嗪，见上面，步骤2.2）。
4。数据分析
- 数据传送到分析程序（ 如适马图，伊戈尔Pro或MATLAB）。
- 计算平均的痕迹FROM 20-30扫描。
- 取的电压偏转（从基线; DRP峰值振幅）的最大振幅进行进一步的分析（ 图3）。
- 后三个脉冲和单脉冲以获得后续的电位随时间的总和的量度计算的DRP峰值幅度之比。
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Representative Results
典型的DRP迹线示于图3。突出刺激伪迹通常后跟一个短的向下偏转。此后缓慢，持久向上偏转，占本DRP是清晰可辨。在录音的一个子集，背根反射是因为在DRP的顶部小幅冲高可见。在正常野生型小鼠，背根反射最常出现时，刺激电压过高。作为背根反射，不能以高的重现性在此制剂引起，它们不用于分析和注意采取减少刺激电压至最低，但仍然超最大强度。为DRP的峰值振幅分析，平均20-30后续的扫描线被使用（ 图3a）。在DRP峰值振幅可以先于刺激伪迹计算相比于基线水平。
在DRP的依赖于时间的总和可以从重复的ST进行分析imulations（3刺激; 100赫兹; 图3b）。峰值幅度是根据单一刺激实验计算。的幅度的后一个和三个刺激在高频率的比值给出的PAD的依赖于时间的总和的估计值。
图1。 PAD的相关性脊髓通路和录像设置示意图。一个 。图中显示了突触前抑制的背根的刺激后脊髓原理途径（3）。初级传入去极化（PAD）是通过激活第一级神经元（1）和连续GABA能抑制由抑制性与IA传入纤维（2）轴突 - 轴突突触池的介导。背根电位（DRP）反映垫，电子传播沿背根并记录其附近进入脊髓（4）：B。数据采集是通过一台个人电脑运行patchmaster软件（1）使用超级8 +8计算机接口完成（2）。从ELC通用放大器的电压信号（7）是数字化的10千赫。刺激是由一个TTL信号控制S88双输出方波脉冲刺激器触发（3）。电压脉冲通过一个抽吸电极施加（4）。记录电极被连接到前置放大器（6）。一氯化银线用于接地（5）。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2。DRP录制现场。 一个 。被麻醉的小鼠的脊髓露出，硬脑膜取出，浸有人工脑脊液。抽吸电极（1：刺激电极; 2：记录电极，），被定位在脊髓。插图显示脊髓（黑色箭头）和背根（蓝色箭头）。背根分离，切割，并且被吸入到电极（1,2），B的前端。包含背根（插图，黄色箭头）的移液管的尖端必须仔细从脊髓表面隆起，以使它们不与周围的流体相接触。拉伸背根和触摸脊髓应避免（在a和b：刺激电极1;记录电极2，参比电极3）。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图3。代表性的成果。一。场均录得连续28痕迹（右图）从一对背根（左图）。所述刺激伪迹（1）之后是一个延长的负电势（2，向上），这反映了DRP。在一些录音，心跳（ECG）被看作是一件神器（右图，红色箭头），但可以明确区分的DRP。迹线与叠加到DRP重叠心电图工件必须被排除在分析之外。 湾重复刺激（3刺激，10赫兹）导致了DRP的一个依赖于时间的总和（横坐标被扩大，以澄清时间总和）。 角 DRP的实施例的记录之前（黑线）以及5分钟后（红线）本地应用程序中的GABA能受体阻滞剂bicucullin（0.5毫米，500微升）的上暴露脊髓。阻塞的地方GABAergic中间神经元导致DRP峰值振幅确认的记录潜在的GABA能原产明显下降（注意偶尔出现的DRP 在体内的录制过程中，有时红色曲线50 Hz正弦波的神器不能被正确甚至阻止接地和屏蔽）。
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Discussion
体内的神经元活动和突触电位外和细胞内电生理记录是在调查中枢神经系统神经元功能和病理生理学的艺术手法状态。脊柱融合是运动功能， 如肢体运动和多式联运感官知觉的关键。突触前抑制是在这个计算过程，确保感官输入适当的反应的一个关键机制。在IA传入纤维的GABA能突触抑制运动神经元通过PAD的激励。背根电位记录在体内揭开了完整的动物直接测量垫的可能性。这种技术可能是用于研究有关的疾病状态，其中异常脊髓抑制是相关的，例如疼痛，脊髓损伤，周围神经损伤或炎症特别的兴趣。与使用转基因小鼠模型的组合，这种技术可以强大到英伟stigate机制相关干扰脊柱的抑制作用。这里的方法克服了使用隔离脊髓制剂在小鼠体内的DRP录音的另一种形式的一定的局限性。因此，途径脊髓上的网络将被保留，也脊髓和脊髓神经元活动的综合分析是可能的。脊髓上活动对PAD的效果可以通过各自的大脑中枢的平行电刺激进行调查。此外，DRP可以通过外周神经的刺激被诱发直接，这可能是相关的周围神经病变或炎症的动物模型。采用适当的麻醉，警惕和温度控制，可以录音生理条件下进行了几个小时的完整的动物。
与此相反，在比较中使用的分离的脊髓制剂， 在体内拍摄的DRP的是在一定程度上限制就浴的控制局部药物应用和灌注所以禄讯。药可局部用于但由于不确定扩散到周围组织中，可变溶液交换，溶液量在记录制剂是不可能的脊髓和记录站点内控制中的药物浓度。当研究表面应用的急性效应，这些限制可以部分通过移液器解决了本地应用程序。
小鼠的脊髓小，压力和扭力高度敏感，并且手术是困难的。因此，制备小鼠脊髓体内电生理需要一些训练。有一定的临界点。至关重要的是，制备过程中的硬脑膜不受损害，并且优选没有或至少非常少的压力施加到脊髓。脊髓必须在整个过程中保持润湿，前后硬脑膜与NaCl和学联开通后，分别。信号对噪声DRP录音的比例可以增加，通过刺激和记录尽可能接近到各自的背根的入口点。录制设置的勤奋接地和屏蔽有助于减少非特异性噪音，解剖显微镜灯应关闭或录制过程中去除。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢曼弗雷德HECKMANN的有益讨论建立方法的过程中。此外，我们感谢克劳迪娅·索默的技术援助和弗兰克·舒伯特支持制作视频。 01EO1002和耶拿大学医院的多学科临床研究中心（IZKF）：这项工作是由德国联邦教育与研究部（BMBF），德国，FKZ支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamine 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30 G Microneedle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Universal amplifier | NPI (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
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