Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount<em> In Situ</em> Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei
Summary
Prikken herstellen motoriek na een complete dwarslaesie. Sommige spinale-projecterende neuronen goed regeneratoren en andere niet. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting zeeprik larven (en onlangs omgebouwd volwassenen), het produceren van volledige ruggenmerg doorsnijdingen en het voorbereiden wholemount hersenen en ruggenmerg voor in situ hybridisatie.
Abstract
Na een complete dwarslaesie, zijn zee lampreys eerst onder het niveau van doorsnijding verlamd. Echter, ze herstellen locomotie na enkele weken en dit gepaard met korte afstand regeneratie (enkele mm) van propriospinal axonen en spinale-projecterende axons van de hersenstam. Onder de 36 grote identificeerbare spinale-projecteren van neuronen, sommige zijn goed regenerators en anderen zijn slecht regenerators. Deze neuronen kunnen het gemakkelijkst worden geïdentificeerd wholemount CNS preparaten. Om de neuron-intrinsieke mechanismen bevorderen begrijpen of remmen axon regeneratie na verwonding in de gewervelde CZS, bepalen we de verschillen in genexpressie tussen de goede en slechte regeneratoren en hoe de expressie beïnvloed door ruggenmerg doorsnijding. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting larvale en onlangs omgebouwd volwassen zee prikken in zoet water tanks, de fabricage van volledig ruggenmerg doorsnijdingen onder microscopische visie, en het voorbereiden van brain en het ruggenmerg wholemounts voor in situ hybridisatie. In het kort worden gehouden dieren 16 ° C en verdoofd in 1% benzocaïne in lamprei Ringer. Het ruggenmerg wordt doorsneden met iridectomiescharen via een dorsale benadering en het dier kan herstellen in zoet water tanks bij 23 ° C. Voor in situ hybridisatie, worden de dieren reanesthetized en de hersenen en koord verwijderd via een dorsale benadering.
Introduction
Bij zoogdieren ruggenmergletsel (SCI) is een verwoestende aandoening die leidt tot permanent verlies van de functie onder de plaats van het letsel, omdat gewonde axonen niet regenereren door het trauma zone en opnieuw te verbinden met hun geschikte doelwitten. In tegenstelling tot zoogdieren, lampreys herstellen voortbeweging na volledig ruggenmergletsel. 1 Interessant lampreys een set van 36 ruggenmerg projecteren neuronen die afzonderlijk identificeerbare geheel-mount brain preparaten wegens hun grote omvang 2,3 (figuur 1) . Al deze spinale-projecterende neuronen axotomized door een hoog-niveau volledig ruggenmerg doorsnijding. Eerdere studies van onze groep en anderen hebben aangetoond dat zelfs bij aanwezigheid van functioneel herstel na SCI, sommige neuronen vertonen een zeer lage regeneratieve capaciteit (ze worden beschouwd als "slecht regeneratoren"), terwijl andere gewoonlijk vernieuwt axon door de plaats van letsel (ze worden beschouwd als "good regeneratoren "). 2,3 Deze eigenschap maakt lampreys interessant vertebrate modellen om de verschillen in genexpressie tussen goed en slecht regenerator spinale-projecterende neuronen die op hun beurt leiden tot verschillen in de intrinsieke regeneratieve vermogen van neuronen die proberen te bestuderen regenereren hun axonen in dezelfde extrinsieke milieu. 1
Met behulp van dit model dat we hebben eerder aangetoond dat spinale-projecteren neuronen met lage regeneratieve vermogen tonen uitdrukking van axonale begeleiding molecuul receptoren zoals UNC5 4,5 en neogenin, 6, die de remmende werking van netrine en RGM respectievelijk bemiddelen. Bovendien met deze methode onze fractie is ook gebleken dat alleen de goede regeneratoren tonen een herstel van de expressie van neurofilamenten na het letsel en tijdens het regeneratieproces. Onlangs, Busch en Morgan 7 hebben aangetoond door immunofluorescentie dat de slechte regenerators tonen een Increased expressie van synucleïne na beschadiging, die is verbonden door de auteurs dat de "slechte regenerator" spinal-projecterende neuronen langzaam sterven na volledig ruggenmerg doorsnijding 5,7,8. Dus, de lamprei model van een complete dwarslaesie heeft ontpopt als een zeer bruikbaar model om te begrijpen wat maakt een ruggemerg projecteren neuron een "slechte regenerator" na axotomy.
Om onze studies voeren we volledig ruggenmerg doorsnijding chirurgie protocol en een achterste hersenen dissectie op de gewenste tijdstippen na letsel wholemount voeren in situ hybridisatie. In de huidige methodologische artikel stellen we een gedetailleerd protocol voor de goede uitvoering van een complete dwarslaesie chirurgie in larvale prikken, het verdere onderhoud van de dieren en de uiteindelijke hersenen dissectie en de voorbereiding van de hersenen voor een wholemount in situ hybridisatie. Een gedetailleerd protocol te perform de wholemount in situ hybridisatie in de hersenen van larven prikken is eerder gemeld. 9 Daarnaast heeft dit protocol voor ruggenmergletsel en hersenen dissectie kunnen ook gebruikt dan verwerken de hersenen voor immunohistochemie of andere histologische methoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om een complete ruggenmerg doorsnijding en posterieure hersenen dissectie in larvale zee prikvissen voeren. Deze procedure maakt analyse verschillen in genexpressie tussen identificeerbare ruggenmerg neuronen projecteren ruggenmergschade door geheel-mount in situ hybridisatie brain. De kritische stap in de procedure is het correct uitvoeren van een volledige doorsnijding ruggenmerg, die 24 uur later worden bestuurd door het observeren van de afgesneden einden van het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
| Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
| Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
| 7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |
References
- Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
- Davis, G. R., McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey. J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).
- Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons. J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).
- Shifman, M. I., Selzer, M. E. Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection. Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).
- Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development. J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).
- Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey. Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).
- Busch, D. J., Morgan, J. R. Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury. J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).
- Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys. J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).
- Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults. Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).
- Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin. Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).
- Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys. Neuroscience. 90, 957-965 (1999).
