七鳃鳗完整的脊髓损伤后恢复运动。然而,一些脊髓投射神经元是很好的再生和其他人都没有。本文说明了技术的外壳海七鳃鳗幼体(最近转化成人),产生完全性脊髓横断和原位杂交准备wholemount大脑和脊髓的。
经过完全性脊髓损伤,海七鳃鳗在第一瘫痪横断以下的水平。然而,它们恢复运动数周之后,与此相伴的propriospinal轴突和从脑干脊髓伸出的轴突的短距离再生(几个毫米)。其中36个大型识别脊髓投射神经元,有些是很好的再生等是坏的再生。这些神经元可最容易在wholemount CNS制剂来鉴定。为了了解在有利于神经元内在机制或在脊椎动物中枢神经系统损伤后抑制轴突再生,我们确定好坏再生器之间的差异的基因表达,以及如何表达由脊髓横断影响。本文阐述了在淡水舱的技术外壳幼虫和近期改造成海七鳃鳗,产下的显微视觉完全性脊髓横断,并准备BR泉和脊髓wholemounts用于原位杂交。简要地,将动物保持在16 °C和麻醉的1%苯佐卡因的七鳃鳗铃声。脊髓经由背侧入横断与虹膜切除术剪刀和该动物被允许在淡水罐在23℃下进行恢复。用于原位杂交,将动物再次麻醉,并在大脑和脊髓经由背侧的方法除去。
在哺乳动物脊髓损伤(SCI)是一种破坏性的条件,导致的损伤部位以下功能永久性丧失,因为受伤的轴突不需要通过创伤区再生和重新连接到适当的目标。相反,哺乳动物,七鳃鳗恢复完全性脊髓损伤后运动。1有趣的是,七鳃鳗有一套36脊髓投射神经元是单独识别整个安装,因为他们的大尺寸2,3( 图1)脑准备。所有这些脊髓投射神经元是由一个高层次的脊髓完全横断金黄地鼠。我们的组和其他的以前的研究已经表明,即使在功能恢复脊髓损伤后某些神经元表现出非常低的再生能力的存在(它们被认为是“坏的蓄热室”),而其他通常通过损伤部位再生的轴突(他们被认为是“GOOD再生“)。2,3这种特性使得七鳃鳗有趣脊椎动物模型来研究在好的和坏的再生脊髓投射神经元,这反过来会导致神经元的企图的固有再生能力的差异之间基因表达的差异再生的轴突在同一外在环境。1
利用该模型,我们以前曾表明,脊髓投射神经元的轴突与导向分子受体如UNC5 4,5和neogenin,6分别介导netrin诱导和RGM的抑制作用,低蓄热能力秀的表情。此外,通过使用这个方法,我们小组还表明,只有在良好的蓄热表明神经丝的表达的恢复的损伤后和在再生过程。最近,布希和摩根7表明,免疫荧光,坏再生器显示的increas突触核蛋白的表达主编受伤后,已经涉及了作者这一事实,即“坏再生”脊髓投射神经元脊髓完全横断5,7,8后慢慢死去。因此,一个完整的脊髓损伤的七鳃鳗的模型已经成为一个非常有用的模型,以了解是什么造就了脊髓神经元投射一个“坏再生”切断后。
进行我们的研究,我们在期望的时间点执行一个完整的脊髓横断手术协议和后脑部解剖损伤后原位杂交执行wholemount。在本方法的文章中,我们提出了一个详细的协议为完全性脊髓损伤手术在七鳃鳗幼体的正常性能,后续维护动物和最终大脑解剖和准备的大脑原位杂交wholemount。一份详细的协议,PErform原位杂交的wholemount在幼虫七鳃鳗的大脑已经被报告过。9另外,该协议用 于脊髓损伤和脑解剖也可用于再加工的大脑用于免疫组化分析或其他组织学方法。
在这里,我们提出了一个详细的协议来执行一个完整的脊髓横断,后脑部解剖幼虫海七鳃鳗。这个程序允许通过全贴脑原位杂交的方法在脊髓损伤后可识别的脊髓神经元投射之间的基因表达差异分析。在该过程中的关键步骤是一个完整的脊髓横断的正确性能,从而可以通过观察stereomicrocope下脊髓的切割端24小时后,轻轻触摸幼虫的口鼻部具有一对被控制和确认钳子,以查看是否有任何移动尾椎到?…
The authors have nothing to disclose.
Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Antón Barreiro-Iglesias was supported by the Fundación Barrié (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Tricaine methane sulfonate | Spectrum | TR108 | Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice |
Scalpel #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
Blades for scalpel: #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Castroviejo scissors #8 | Fine Science Tools | 15002-08 | |
Forceps #4 & #5 | Dumont, Switzerland | Roboz RS4955 | #4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ51 | |
Sylgard | Dow Corning Co. | 184 | |
Insect pins 0.15, 0.20 mm | Austerlitz | No catalogue # | 0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body |
7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps | Fisher Scientific | 03-337-1 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Science (EMS) | 19210 | Dilute to 4% in PBS |