Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Published: July 28, 2014 doi: 10.3791/51516
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, KU Leuven

Summary

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Abstract

Al meer dan 20 jaar, heeft omgekeerde farmacologie bij uitstek de strategie om de activerende liganden van orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) ontdekken geweest. Het begin van een omgekeerde farmacologie assay is de klonering en daaropvolgende transfectie van een GPCR plaats in een cellulair expressiesysteem. De heterologe expressie gebrachte receptor wordt daarna uitgedaagd met een verbinding bibliotheek van kandidaat liganden aan de receptor-activerende ligand (en) te identificeren. Receptor activering kan worden beoordeeld door het meten van veranderingen in de concentratie van second messenger reporter moleculen, zoals calcium of cAMP. De fluorescentie gebaseerde calciummobilisatie test hier beschreven is een vaak gebruikte medium-throughput omgekeerde farmacologie assay. De wees GPCR wordt tijdelijk in humane embryonale nier 293T (HEK293T) cellen en een promiscue Ga-16 construct gecotransfecteerd. Na ligand binding, de activering van de Ga-16 subeenheid induceert het vrijkomen van calcium from het endoplasmatisch reticulum. Vóór ligand screening, worden de receptor tot expressie brengende cellen geladen met een fluorescente calcium indicator Fluo-4 acetoxymethyl. Het fluorescentiesignaal van Fluo-4 verwaarloosbaar in cellen onder rusttoestand, maar kan meer dan 100-voudige op de interactie met calciumionen die vrijkomen na receptoractivering worden geamplificeerd. De beschreven techniek vereist geen tijdrovende instelling van stabiel getransfecteerde cellijnen waarin het getransfecteerde genetisch materiaal wordt geïntegreerd in het genoom van de gastheercel vereisen. In plaats daarvan, een transiënte transfectie, genereren tijdelijke expressie van het doelwitgen, is voldoende om de screening assay. De opstelling laat het midden-throughput screening van honderden verbindingen. Co-transfectie van de promiscue Ga-16 voor koppeling meeste GPCRs, kan de intracellulaire signaalroute te heroriënteren naar het vrijkomen van calcium, ongeacht de natieve signaalweg in endogene settgen. De HEK293T cellen zijn gemakkelijk te hanteren en hebben hun effectiviteit door de jaren heen in receptor ontwezing testen bewezen. Echter, kan optimalisatie van de assay voor specifieke receptoren noodzakelijk blijven.

Introduction

G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn een van de grootste en meest diverse families van alle eiwitten van het celoppervlak. Hun aanwezigheid in vertebraten, invertebraten, planten, gist, schimmels en slijm, en in Protozoa en de vroegste diploblastic Metazoa aangeeft dat GPCRs tot de oudste moleculen gekoppeld signaaltransductie 1. Hun natuurlijke activerende liganden behelzen een scala van externe stimuli zoals peptiden, biogene aminen, geurstoffen, glycoproteïnen, en fotonen 2. Als zodanig zijn deze receptor-ligand signalering ook die een grote verscheidenheid aan fysiologische processen. Het brede spectrum functionele maakt ze bij uitstek geschikt voor de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen die een breed spectrum van menselijke ziekten te dekken. Ongeveer 50-60% van de huidige drug targets worden vertegenwoordigd door GPCR 3,4. Naast hun grote belang in de farmaceutische industrie, GPCRs zijn ook de kijker voor het ontwikkelen van eennieuwe generatie van soortspecifieke insecticiden 5,6 en pesticiden in het algemeen. Omdat de natuurlijke liganden van vele GPCR's zijn nog niet geïdentificeerd, worden ze ingedeeld als orphan GPCR's. De ontwezing van deze receptoren zal het begrip van hun fysiologische rol in organismen te verbeteren en kunnen mogelijke targets te ontdekken voor nieuwe drug toepassingen 7.

Sinds de genomische tijdperk, is het omgekeerde farmacologie strategie op grote schaal toegepast voor de ontwezing van GPCR's 8. De benadering impliceert dat een orphan receptor wordt gebruikt als een "haak" m "vissen uit 'de activerende ligand van een biologisch extract of uit een bibliotheek van synthetische stoffen. De GPCR plaats wordt daarom gekloneerd en vervolgens getransfecteerd in een cellulair expressiesysteem. In de meest gebruikte werkwijzen wordt receptoractivering bepaald door veranderingen in de concentratie van tweede boodschappermoleculen 9 (bijv. aequorin) 10 of fluorescente calcium indicatoren (bijv. Fluo-4) 11. De fluorescentie gebaseerde testen, waarbij-receptor tot expressie cellen met een fluorescente calcium indicator voor ligand screening, hebben het voordeel dat ze laten high-throughput screening vanwege hun gebruiksgemak, korte leestijd en de flexibiliteit van screening meerdere weesreceptoren op een enkele plaat 12.

Hier wordt de fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay grondig beschreven en geïllustreerd door de ontwezing werkwijze volgens de Drosophila melanogaster korte neuropeptide F (SNPF) receptor. Dit neuropeptiderge signaleringssysteem werd oorspronkelijk gekenmerkt door Mertens et al.. 2002 13 met een calcium-bioluminescentie assay uitgevoerd in Chinese hamster ovarium (CHO)-cellen14 en door Feng et al.. In 2003 met een elektrofysiologische test met behulp van Xenopus oöcyten 15. De aanwezigheid van het SNPF signaleringssysteem lijkt beperkt tot de phylum van Arthropoda, waar het is betrokken bij een groot aantal processen, zoals de regeling van het voeden, groei, stressreacties, motoriek en circadiane ritmes 16.

Onderzoek naar neuropeptiderge signaleringssystemen bij insecten kan niet alleen leiden tot nieuwe doelen voor de ontwikkeling van insecticiden, maar de kennis van hun werking kan ook worden geëxtrapoleerd naar andere organismen zoals velen signalering systemen zijn over het algemeen goed gebleven doorheen de evolutie 17. In het laatste decennium, heeft grote vooruitgang geboekt in het ontwezing proces van insecten neuropeptide GPCR's. Ondanks deze inspanningen zijn er slechts een klein aantal receptoren zijn afgestemd op hun verwante ligand, en tal van sequentie-informatie voornieuwe orphan GPCR's is beschikbaar vanwege de booming van genomics 18 geworden. De beschikbaarheid drager / high-throughput screening methoden, zoals fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay die heeft bewezen een veel toegepaste techniek 9,18 zijn, dus onschatbaar.

De fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie assay zoals beschreven wordt uitgevoerd in humane embryonale nier 293T (HEK293T) cellijn en gebruikt een fluorescente probe veranderingen in intracellulaire calciumconcentraties te bepalen na receptoractivering. Om een hoge expressie niveaus en translatie van het receptor waarborgen, wordt een Kozak consensussequentie 19 toegevoegd aan het einde van de receptor coderende sequentie, dat vervolgens wordt gekloneerd in een expressievector (bv. pcDNA vector serie voor zoogdiercellijnen) het 5 '. Omdat het moeilijk is om het endogene G-eiwit-koppeling van een wees GPCR basis van sequentie-informatie voorspellenalleen, de tweede boodschapper moleculen (bijvoorbeeld calcium of cAMP) die worden gemoduleerd na activering van de receptor vaak onbekend blijven voorafgaand aan ligand identificatie. Om dit probleem te omzeilen, promiscue G-eiwitten van de G q familie (bijvoorbeeld van muis Ga-15 of menselijke Ga-16 [hier gebruikt]) of chimere G-eiwitten (bijvoorbeeld, Ga-qi5) die interageren met de meeste GPCR's en veroorzaken het vrijkomen van calcium kan mede worden uitgedrukt 20,21,22. Na binding van de ligand aan de receptor, de GPCR ondergaat een conformationele verandering die leidt tot de activering van specifieke intracellulaire wegen. De guanosine difosfaat (GDP) molecuul, onder rusttoestand de Ga-16 subeenheid gebonden, wordt vervangen door een guanosine trifosfaat (GTP) molecuul. Dit veroorzaakt de dissociatie van de heterotrimere G proteïne in een Ga-16 en Gβγ subeenheid. De Ga-16 subeenheid activeren fosfolipase C &# 946; (PLCβ), die op zijn beurt hydrolyseert het membraangebonden fosfatidylinositol bisfosfaat (PIP2) waardoor diacylglycerol (DAG) en inositol trifosfaat (IP3). IP3 wordt verspreid over het cytoplasma en activeert IP3-afhankelijke calciumkanalen in de membraan van het endoplasmatisch reticulum, die de afgifte van calcium in het cytoplasma.

De calciumafgifte bij receptoractivering plaatsvindt binnen seconden en kan worden gedetecteerd door het laden van cellen voor de screening test met een calcium-gevoelige kleurstof, Fluo-4 zoals acetoxymethyl (AM) 11. De AM estergroep kan de fluorofoor aan de celmembraan passeren en afgesplitst door cytoplasmatische esterasen eenmaal binnen de cel. Bijgevolg, de negatieve ladingen van de fluorescente kleurstof worden ontmaskerd, waardoor deze diffundeert uit de cel en te laten interageren met calciumionen. De fluorescerende signaal of Fluo-4 is te verwaarlozen in cellen onder rusttoestand alleen met calcium concentraties in het nanomolaire gebied. Wanneer calcium wordt vrijgegeven na receptoractivering kan het signaal concentratie-afhankelijke verhogen tot meer dan 100-voudige, hierbij zorgen voor een grote signaal-ruisverhouding. Fluo-4 vertoont ook een groot dynamisch bereik voor het melden van [calcium] rond een K d (calcium) van 345 nM, waardoor het geschikt is om fysiologisch relevante calcium veranderingen in een breed scala van cellen te meten. De excitatie van Fluo-4 treedt op bij 488 nm en de fluorescentie emissie wordt gemeten bij 525 nm 11. Fluorimeters zoals de fluorescentie beeldvorming plaatlezer (FLIPR) 23, de Novostar, of het FlexStation (station apparaat) 12 zijn middelgrote / high-throughput systemen die gelijktijdig verbinding toevoeging en de detectie van de Fluo-4 signaal op receptor activering mogelijk maken voor elke goed een testplaat. De mobilisatie van calcium test hier beschreven is gebaseerd op het stationapparaat 96-well microplaat systeem.

De SoftMax Pro-software (software) gebruikt om het apparaat te bedienen station en voor gegevensanalyse. Het programma toont onmiddellijk de resultaten in grafieken in 96-well formaat. Meerdere putjes kunnen gelijktijdig worden geselecteerd om de resultaten van deze putten vergelijken op dezelfde grafiek. De relatieve fluorescentie-eenheid (RFU) waarden van putjes in elke kolom worden gelijktijdig gedurende twee minuten, beginnen voor de toevoeging van verbindingen aan de putjes en permanente na meting van het fluorescentiesignaal volgende receptoractivering. Typisch, de ontwikkeling van een agonist curve uitgelijnd met de basislijn tot een activerende verbinding wordt toegevoegd aan de cellen, resulterend in een snelle toename van het fluorescentiesignaal. De piekhoogte is gecorreleerd met de uiteindelijke agonist concentratie in de put. Na de piek, het fluorescerende signaal langzaam daalt naar het basisniveau. De RFU metingen can worden omgezet in concentratie-respons curves voor de EC 50-waarde (de helft van de maximale effectieve concentratie) van een ligand te bepalen. In het algemeen, ten minste drie onafhankelijke schermen, elk met drie replica van een concentratie reeks moet worden uitgevoerd om een ​​betrouwbare concentratie-responscurve samenstellen.

Het wordt aanbevolen om een ​​aantal positieve en negatieve controles in proefopzet. Allereerst een transfectie controle, namelijk de toepassing van een receptor met een bekende ligand, worden getest. Dit maakt het mogelijk na te gaan of de transfectiemiddel was operationeel. Opneming van een controle-experiment met een agonist van een endogene receptor van de cellijn en een negatieve controle (bijvoorbeeld wasbuffer) worden ook aanbevolen bewaken de gezondheid en levensvatbaarheid van de cellen en de mogelijkheid dat de wasbuffer werd verontreinigd sluiten een factor die een auto-fluore kon ontlokkengeur reactie. Veelgebruikte agonisten een peptide afgeleid van het protease-geactiveerde receptor-1 (PAR 1), die als PAR 1 selectieve agonist of carbachol, die acetylcholine receptor activeert. Cellen getransfecteerd met een lege expressievector moet worden getest te sluiten dat actieve verbindingen interageren met endogene receptoren van de cel. Optimalisatie van verscheidene parameters in de hieronder beschreven protocol kan nodig zijn voor verschillende signaleringssystemen. Een schematische figuur van een totale fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie assay is weergegeven in figuur 1.

Figuur 1
Figuur 1. Algemeen schema van de fluorescentie gebaseerde calciummobilisatie assay. Geautomatiseerde liquid handling en gelijktijdige fluorescentie metingen worden uitgevoerd met het stationapparaat microplaat lezer, aangedreven door de software. Het station apparaat bevat drie laden: een voor de cel plaat, samengestelde plaat en nog veel rek. De ingebouwde pipet overdrachten verbindingen uit een kolom van de samengestelde plaat in de overeenkomstige kolom van de celplaat (stap 1). Elk putje van de cel plaat bevat een monolaag van HEK293T cellen die zijn co-getransfecteerd met de GPCR van belang en de promiscue Ga-16 subeenheid. Wanneer een verbinding activeert de receptor, wordt de Ga-16 gebonden BNP vervangen door GTP. De Ga-16 subeenheid vervolgens dissocieert het complex en activeert Gβγ fosfolipase Cp (PLCβ), die op zijn beurt hydrolyseert fosfatidylinositol bisfosfaat (PIP2) waardoor diacylglycerol (DAG) en inositol trifosfaat (IP3). IP3 activeert IP3-afhankelijke calciumkanalen in de membraan van het endoplasmatisch reticulum, het induceren van de afgifte van calcium into het cytoplasma. De interactie van calcium met Fluo-4 (waarbij de cellen voorafgaand aan de toevoeging verbinding geladen) resulteert in een fluorescent signaal (stap 2). De software stelt de resultaten relatieve fluorescerende eenheid (RFU) waarden als functie van de tijd en piekhoogtes correleren met de ligand concentratie in een concentratie-afhankelijke wijze. Deze gegevens kunnen vervolgens worden omgezet in een concentratie-responscurve op de EC 50-waarde van een ligand-receptor paren (stap 3) bepalen.

Protocol

Opmerking: Alle acties waarbij cellen betrokken zijn te worden uitgevoerd in een steriele omgeving uitgevoerd door in een laminaire stroming.

1. Onderhoud van de HEK293T cellijn

  1. Groeien de HEK293T cellen in een T-75 kolf bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
  2. Passage de cellen bij een confluentie van 80% bereikt. Opmerking: Dit duurt normaal 3 tot 4 dagen. Cellen in continue cultuur toestaan ​​20-25 bruikbare passages voor screening.
    1. Plaats de Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calciumchloride en magnesiumchloride, PBS-trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (500 ml PBS gesupplementeerd met 10 ml trypsine-EDTA-oplossing en 4,5 ml 4% EDTA) en groeimedium (500 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's - hoge glucose [DMEM] gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum [FBS] en 1 mM penicilline-streptomycine [PS]) bij kamertemperatuur een half uur op voorhand.
    2. Verwijderende oude groei van de cellen. Afspoelen dode cellen met 3 ml PBS en verwijder de PBS opnieuw.
    3. Voeg 3 ml PBS-trypsine-EDTA, incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur en verwijdert de oplossing Opmerking: De morfologie van de cellen verandert van stervormige tot bolvormige.
    4. Draai de cellen van de bodem van de kolf zachtjes te tikken en laat de cellen gespoeld onder meerdere malen met 10 ml vers kweekmedium.
    5. Breng 1 ml van de celkweek in een nieuwe T-75 kolf die 14 ml vers groeimedium en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.

2. Transiënte transfectie van HEK293T-cellen

  1. Groeien de HEK293T cellen in een T-75 kolf 3 dagen voor de eigenlijke calciummobilisatie test plaatsvindt. Zorg drie T-75 flessen, een voor transfectie met de receptor construct, een voor transfectie met een lege expressievector, als negatieve controle en o gebruikne voor de transfectie controle. Opmerking: De passage van de cellen wordt uitgevoerd zoals beschreven in stap 1.2. Wanneer meerdere 96-well platen moeten worden gescreend, kan T-150 kolven worden gebruikt om een ​​hoger rendement van de cellen (om dit te doen, dubbele alle vermelde hoeveelheden in stappen 1.2.5, 2.3, 3.1.3 en 3.1.4) te krijgen .
  2. Incubeer de kolven bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 20-24 uur totdat de celkweken benadering 50-70% confluentie.
  3. Co-transfecteren een populatie van cellen met de expressievector die codeert voor het GPCR plaats en Ga-16 construct, de tweede kolf met de lege vector en Ga-16 construct, en de derde met de transfectie controle en Ga-16 construct. Opmerking: In dit protocol werd het Drosophila SNPF receptor gekloneerd in pcDNA3.1 zoogdierexpressievector 13. JetPRIME werd gebruikt om de transfectie uit te voeren, maar andere transfectie reagentia kunnen eveneens worden gebruikt.
    1. Toevoegen aanotal van 7,8 pg DNA (3,9 ug receptor construct of lege vector, en 3,9 ug Ga-16 expressieconstruct) naar een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 500 ul van de buffer JetPRIME. Meng goed door vortexen de buis en spin down binnenkort.
    2. Voeg 37,5 ul van de JetPRIME reagens, vortex en spin down gedurende 1 minuut bij 14.000 x g. Incubeer de transfectie mengsel 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Voeg het transfectiemengsel druppelsgewijs aan het celkweekmedium en zorg direct pipet in het medium vermijden van contact met de wanden van de kolf. Incubeer de kolven bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 20-24 uur.

3. Calcium Mobilisatie Assay

  1. Verzamel de getransfecteerde cellen en zaden ze in 96 putjes zwart wanden, heldere bodemplaten.
    1. Plaats de PBS, PBS-trypsine-EDTA en DMEM overdrachtsmedium (500 ml DMEM aangevuld met 10% gedialyseerd FBSen 1% PS) bij kamertemperatuur een half uur op voorhand.
    2. Smeer de 96-well zwart-walled, duidelijk bodemplaten met 60 pi PBS met fibronectine (0.0025%) per putje (5,85 ml PBS en 150 ul fibronectine [0,1%] per plaat). Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met de deksel. Verwijder de oplossing uit de putjes en incubeer de platen opnieuw gedurende 1 uur zonder deksel bij kamertemperatuur. Als alternatief is het mogelijk om vooraf beklede platen gebruikt voor een beter celhechting.
    3. Haal de oude groei van de cellen en spoel dode cellen af ​​met 3 ml PBS en verwijder de PBS.
    4. Voeg 3 ml PBS-trypsine-EDTA, incubeer gedurende 1 min, verwijder de oplossing. Opmerking: De morfologie van de cellen verandert van stervormige tot bolvormige.
    5. Draai de cellen van de bodem van de kolf door voorzichtig tikken en te verzamelen door meerdere malen spoelen met 10 ml DMEM overdrachtsmedium. Breng de cellen in een 50 ml Falcon buis.
    6. Tel deaantal cellen per ml (uitgevoerd met een NucleoCounter hier, maar een Burker's kamer is aanvaardbaar). Voeg 100 ul van de celkweek in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 100 ul lysis buffer en meng door de buis te tikken. Voeg 100 ul stabiliserende buffer en meng door te tikken.
    7. Vul een NucleoCassette met de celsuspensie en tel de cellen met de teller. Vermenigvuldig het aantal cellen met drie, de cellen werden verdund met een factor drie bij het toevoegen van de lysis en stabiliserende buffer in stap 3.1.6.
    8. Verdun de cellen tot een uiteindelijke concentratie van 600.000 cellen / ml en zaden 150 ul van de cellen per putje in de beklede platen met een celdichtheid van ongeveer 90.000 cellen per / putje te verkrijgen. Vermijd luchtbellen en tik op de plaat om de cellen gelijkmatig verspreid om een ​​aaneengesloten cellaag krijgen. Incubeer de platen bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 16-24 uur.
  2. Laad de cellen met de fluorescerende kleurstof en de voorbereiding van de compound plaat.
    1. Bereid Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / bovine serum albumine (BSA) buffer: voeg 165 ul CaCl2 voorraad-oplossing (1 M CaCl2 in gedestilleerd water [dH 2 O] - bewaren bij kamertemperatuur), 500 ul HEPES voorraad-oplossing (1 M HEPES in dH 2 O, pH 7,4 - bewaren bij kamertemperatuur), en 0,05 g BSA tot 50 ml HBSS. Merk op dat vetzuurvrij BSA wordt gebruikt voor calcium assays, vetzuren specifieke receptoren kunnen activeren afbreuk de calcium signaal van de receptor van interesse.
    2. Bereid probenecide oplossing (100x, 250 mM): los 0,71 g probenecide in 5 ml NaOH (1 M) en voeg 50 ul HEPES voorraad-oplossing en 5 ml van de HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA buffer - altijd vers te bereiden. Opmerking: probenecide remt anorganische anion transporters die kunnen verjagen Fluo-4 uit het cytoplasma, waardoor het fluorescerende signaal verminderen. Het wordt aanbevolen om de kleurstof belasting in te voerende aanwezigheid en afwezigheid van probenecide te bepalen of anorganische anion transporters vormen een potentieel probleem in het bijzonder cellijnen onderzocht, zoals probenecide ook de door agonist gemedieerde signaal kan verminderen.
    3. Bereid wasbuffer: voeg 500 ul probenecide oplossing van 50 ml HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA-buffer, op pH 7,4 en het filtraat bufferoplossing. Bereiden altijd verse buffer, en 50 ml buffer per plaat is vereist.
    4. Bereid 10% pluronzuur oplossing: meng 50 pl pluronzuur (20% w / v in dimethylsulfoxide [DMSO]) met 50 ul DMSO - indien gekristalliseerd, warmte tot 37 ° C en altijd vers te bereiden.
    5. Bereid TL 4:00 oplossing (1 mM): voeg 44 ul 10% pluronzuur oplossing een flesje dat 50 ug TL 04:00 en vortex bevat tot deze volledig is opgelost. Vermijd blootstelling aan licht om bleken van de fluorofoor voorkomen.
    6. Bereid ladingsbuffer: voeg 8,8 ml DMEM supplemented met 10 mM HEPES en 2,5 mM probenecide (pH 7,4) om de TL 4:00 oplossing (44 pl) en vortex. Gebruik altijd verse buffer.
    7. Gooi van de cellen, was de cellen met 200 pi PBS per well, en verwijder PBS.
    8. Voeg 55 ul loading buffer per putje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Wikkel de plaat in aluminiumfolie om blootstelling van de plaat aan licht voorkomen.
    9. Zorg ervoor dat de verbindingen drogen voordat het scherm indien ze worden opgelost in oplosmiddelen die schadelijk zijn (bijvoorbeeld acetonitril) voor het cellulaire expressiesysteem.
    10. Oplosbaar te maken van de peptiden in wasbuffer in gesiliconiseerde 1,5 ml microcentrifugebuizen. Bereid een verdunningsreeks tot een concentratie-respons analyse uit te voeren en de EC 50-waarde van een ligand te bepalen. Voeg 70 ul van de ligand in het overeenkomstige putje van de samengestelde plaat (V-vormige 96-well platen) en omvatten positieve (endogene agonist) en negatieve controles (wasbuffer) op elke plaat. Niet e: als een verbinding niet oplosbaar is in de wasbuffer, kan men proberen andere oplosmiddelen die niet schadelijk zijn voor de onderzochte cellen, zoals water of oplossingen emulgeren en oplosbaar oliën en andere in water oplosbare stoffen (bijv. Kolliphor EL) .
    11. Meet alle monsters in drievoud. Houd in gedachten dat 50 ul van een ligand van de verbinding plaat zal worden overgebracht naar een goed met 100 ul wasbuffer van de cel plaat tijdens de test, dus bereid de verbindingen bij 3x hun gewenste uiteindelijke concentratie.
    12. Gooi de beladingsbuffer uit de cel plaat en voeg 100 ul wasbuffer aan elk putje. Incubeer de plaat 15 minuten bij kamertemperatuur en blootstelling aan licht te voorkomen.
    13. Gooi de wasbuffer uit de cel bord en voeg 100 ul nieuwe wasbuffer aan elk putje.
    14. Incubeer de cel plaat, de verbinding plaat, en een tip rack (96-well, station apparaat pipet tips) gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
titel ". Assay op het Station Apparaat> 4

  1. Maken en laden gewenste protocol bestand met de software en activeer de temperatuurregelaar voor het lezen kamer. Hier meet calcium responsen bij 37 ° C gedurende 2 min een rij per keer met 1,52 sec interval tussen opeenvolgende metingen (meten van een volledige 96-well plaat duurt ongeveer 25 minuten) bij 525 nm. Stel de excitatie van Fluo-4 488 nm en breng een totaal volume van 50 pi van verbinding aan de celplaat, 18 seconden na het lezen start met de doseersnelheid ingesteld op 26 pl / s en een pipet hoogte van 135 pl.
  2. Plaats de verbinding en celplaat, en de tip rek in de juiste laden van het station apparaat.
  3. Voer een enkel lezen van de cel plaat op hetzelfde excitatie en emissie golflengte in de ENDPOINT modus, voordat het eigenlijke scherm in FLEX-modus. Opmerking: Deze meting geeft relatieve fluorescentie-eenheid (RFU) waarden en laat het opsporen van variabiliteit tussen wijLLS van de plaat. Waarden tussen de 20.000 en 40.000 worden als aanvaardbaar beschouwd.
  4. Start de test en de gegevens met de software analyse.

Representative Results

Concentratiereeks variërend van 50 uM tot 0,001 nM werden getest voor alle vier Drosophila SNPF peptiden (Drome-SNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide) op HEK293T cellen die kortstondig drukken de Drosophila SNPF receptor en de promiscue Ga-16 subeenheid. De GPCR werd geactiveerd door vier peptiden in finale concentraties tot 0,1 nM en receptoractivering werd concentratieafhankelijke. Figuur 2 toont de grafieken corresponderend met een van de drie replica's van de Drome-SNPF-1 concentratiereeks. De negatieve controle (wasbuffer) heeft een fluorescent signaal opwekken, terwijl de positieve controle (PAR 1 - 1 uM) veroorzaakte sterke activatie van de endogene protease-geactiveerde receptor-1, wat leidt tot een hoge fluorescentiesignaal (± 30.000 RFU). Opgemerkt zij dat een afwijking vande typische curve afwijkingen aantonen. Bijvoorbeeld, een lopend stijging van de curve zonder terugkeer naar de basislijn worden gerelateerd aan niet-receptor-gemedieerde signalen, zoals de aanwezigheid van calcium ionoforen, of een verstoorde lipide bilaag waardoor calcium lekken.

De software maakt het invoeren formules om het percentage activering of de standaardfouten van de verschillende concentraties onder anderen bepalen. De resultaten gebruikt voorlopige concentratie-respons curven samen te schatten EC 50-waarden, zoals de vier Drome-SNPF peptiden in Figuur 3. De curven van figuur 3 ook de gegevens voor de negatieve controle waarbij de concentratie reeks de Drome-SNPF peptiden werden getest op HEK293T cellen die met een lege pcDNA3.1 vector. De resultaten geven aan dat de toevoeging van de peptiden aan deze cellen hebben geen effect op endogene receptoren, maar wel activaten de receptor van belang. De fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie-assay werd vervolgens herhaald driemaal onafhankelijk. Op basis van de voorlopige concentratie-respons curven van het beginscherm werden de geteste concentraties aangepast aan het dynamische bereik van de curve (figuur 4) omvatten. De EC50-waarden van Drome-SNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [95% betrouwbaarheidsinterval]), Drome-SNPF-2 (5.89 ± 3.74 nM), Drome-SNPF-3 (5.55 ± 3.95 nM) en Drome-SNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) vergelijkbaar zijn, wat aangeeft dat ze even sterk aan de receptor activeren.

Figuur 2
Figuur 2. Grafische output van de software voor een receptor gemedieerde fluorescentie respons van een concentratiereeks. Twaalf eindconcentraties (van 50 uM tot 0,001 nM) of de Drome-SNPF-1 peptide werden getest op de Drome-SNPF receptor. Activering wordt uitgedrukt in relatieve fluorescerende eenheid (RFU) waarden. De bovenste grafiek geeft de resultaten van de zes hoogste concentraties en de onderste grafiek van de zes laagste concentraties. De positieve controle (+) is PAR 1 (1 uM) en de negatieve controle (-) is wasbuffer.

Figuur 3
Figuur 3. Voorlopige concentratie-respons curven van Drosophila SNPF peptiden bepaald door een fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie assay. Concentratie-respons curven van de Drosophila SNPF receptor tijdelijk tot expressie gebracht in HEK293T cellen voor de vier Drosophila SNPF peptiden verschijnen in blauw. Voor de negatieve controles (aangegeven in rood), werden peptiden getest op HEK293Tcellen getransfecteerd met een lege vector pcDNA3.1. De fluorescerende reacties worden weergegeven als relatieve (%) van de hoogste waarde (100% activering). De curven zijn het resultaat van een experiment waarbij elke concentratiereeks werd in drievoud gemeten. De verticale balken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM), die soms kleiner zijn dan de gebruikte symbolen (in dit geval alleen de symbolen afgebeeld).

Figuur 4
Figuur 4. Concentratie-respons curven en bijbehorende EC 50-waarden van Drosophila SNPF peptiden bepaald door drie onafhankelijke fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie assays. De concentratie respons curven van de Drosopihla SNPF receptor tijdelijk tot expressie gebracht in HEK293T cellen voor de vier Drosophila SNPF peptiden het resultaat van drie onafhankelijke measurements elk in triplo (n ≥ 9). De fluorescerende reacties worden weergegeven als relatieve (%) van de hoogste waarde (100% activering). Sterretjes geven concentraties waarbij n ≤ 9. Fout geven SEM aan, die soms kleiner zijn dan de gebruikte symbolen (in dit geval alleen de symbolen afgebeeld). EC50 waarden worden getoond met hun 95% betrouwbaarheidsintervallen.

Discussion

De fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay werd met succes toegepast op de functionele karakterisatie van Drosophila SNPF peptiderge signalen, dat reeds werd uitgevoerd door Mertens et al. bevestigen. met bioluminescentie assay en Feng et al.. met een elektrofysiologische test 13,15. De EC 50-waarden verkregen met de fluorescentie assay in HEK293T cellen zijn ongeveer 10 maal lager dan deze die verkregen met de bioluminescentie test uitgevoerd in CHO-cellen (Drome-SNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM, Drome-SNPF- 2: fluo = 5.89 nM, lumi = 42 nM, Drome-SNPF-3: fluo = 5.55 nM, lumi = 31 nM, Drome-SNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Deze verschillen kunnen worden verklaard door verschillende factoren, waaronder het feit dat een van de gebruikte expressiesystemen beter geschikt voor functionele expressie van een bepaalde receptor kan zijn, of het vouwen van sommige receptoren kunnen minder efficiënt in cepaalde celtypen. De EC50 waarden van alle vier Drome-SNPF peptiden in het nanomolaire bereik wanneer getest op hun receptor met zowel de fluorescentie en bioluminescentie test algemeen ondersteunen de fysiologische relevantie van de peptide-receptor interactie in vivo.

Er worden geen transfectiecontrole met een receptor waarvoor de activerende ligand bekend is in het hier gepresenteerde scherm, omdat de Drosophila SNPF signaleringssysteem normale transfectie controle experimentele opstellingen. De positieve controle met een endogene ligand van de HEK293T cellen (PAR 1) en de negatieve controle (wasbuffer) werden in het scherm. De resultaten van PAR 1 bleek dat de cellen in een goede conditie. De negatieve controle (wasbuffer) heeft een fluorescent signaal opwekken, wat aangeeft dat het medium waarin de peptiden opgelost was vrij van verontreinigingen die influence de resultaten.

De eerder gekenmerkt Drosophila SNPF signaleringssysteem werd hier gebruikt om de fluorescentie gebaseerde calciummobilisatie assay verklaren. Hiertoe werden concentratie reeks van de activerende liganden direct getest. Wanneer evenwel een orphan receptor tot overexpressie in een screeningstest een bibliotheek met honderden testverbindingen wordt gebracht, wordt aanbevolen eerste scherm met relatief hoge eindconcentraties van de liganden (bijv.., 10 of 1 uM). Nadat de aanwezigheid van een activerende verbinding, een verdunningsreeks van die verbinding worden gescreend teneinde een concentratie-respons curve samenstellen en de EC 50 waarde te bepalen.

Wanneer de activerende ligand van een receptor wordt bepaald, kan de intracellulaire signaalroute verder onderzocht door aanpassing van het protocol. De test kan worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven, maar zonder co-transfecteren van de G ^5, 16 subeenheid. Wanneer een calciumrespons gemeten, betekent dat de receptor paren met een endogeen q Ga-subeenheid van het cellulaire expressiesysteem. Als er geen fluorescerend signaal wordt waargenomen, kan protocollen op veranderingen in de concentraties van andere secundaire boodschappers (bijv.., CAMP) meten worden toegepast.

Structuur-activiteit (SAR) studies kan ook worden uitgevoerd om de peptide kern juiste volgorde voor een receptor activering definiëren. Eerst worden ingekorte sequenties beoordeeld om de minimale aminozuursequentie van het peptide dat nog kan de receptor activeren definiëren. Vervolgens kunnen peptiden worden getest die systematisch heeft elk aminozuur gesubstitueerd voor een alanineresidu. Testen synthetische alanine-substitutie serie over de receptor kan het belang van elk van de aminozuren voor receptoractivering 24,25 bepalen.

Ondanks het veelvuldige gebruik en bewezen effiCacy, moet worden benadrukt dat de hier beschreven test kan nodig enkele aanpassingen om optimale resultaten voor specifieke receptoren van belang winnen. De Ga-16 subeenheid heeft het voordeel dat het bindt aan de meeste GPCRs, maar kan ook een dominant-negatief effect op receptoren endogeen partner via Ga-q 22. In dit geval kan het nuttig zijn verschillende combinaties van G-eiwitten getest tijdens de optimalisatie van een nieuwe calciumkanalen test en de resultaten voor Ga-q-gekoppelde receptoren te vergelijken in de afwezigheid of aanwezigheid van Ga-16 is. Alternatieve testen die onafhankelijk zijn van de interactie G eiwit receptoractivering detecteren zijn kunnen ook worden uitgevoerd, zoals de translocatie van GFP-gemerkte arrestin of de detectie van veranderingen in membraanpotentiaal (bijvoorbeeld. Door de FLIPR Membraanpotentiaal testkit). Naast gebruikte de Fluo-04:00 hier, een breed scala aan andere calcium-gevoelige fluoroforen, elk met een eigen spectrale en chemieal eigenschappen, is beschikbaar. De meest geschikte fluorofoor kan worden gekozen op basis GPCR, celtype en de beschikbare plaatlezer, maar experimentele verificatie noodzakelijk. De bedragen getransfecteerd DNA en het DNA / transfectiereagens verhouding moeten worden bepaald voor elke receptor-transfectiereagens-cellijn combinatie. Ten slotte moet in gedachten worden gehouden dat cellen in continue kweek staan ​​slechts 20-25 bruikbare passages aan de screeningstesten voeren.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO-Vlaanderen, België, G.0601.11) en de KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ en LT profiteren van een beurs van het FWO-Vlaanderen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA solution (0.25%) Sigma-Aldrich T4049
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) MP Biomedicals 195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose  (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Penicillin-Streptomycin (P-S) Sigma-Aldrich P4333
jetPRIME Polyplus transfection 114-01 FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies)
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Reagent A100, Lysis buffer Chemometec 910-0003
Reagent B, Stabilizing buffer Chemometec 910-0002
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H8264
Probenecid Sigma-Aldrich P8761
NaOH (1 M) Vel 2781
Pluronic acid Invitrogen P-3000MP
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Fluo-4 AM Invitrogen F14201 Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) Sigma-Aldrich Z707503 and Z707554
FlexStation device Molecular Devices NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom Greiner Bio-One 655090 Corning 96-well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates
NucleoCassette Chemometec 941-0001
NucleoCounter NC-100 Chemometec
Microcentrifuge tubes, siliconized BioCision BCS-2470
Polystyrene V-shaped 96-well plates Greiner Bio-One 651101
96-Well, FlexStation pipette tips Molecular Devices 9000-0912
Soft Max Pro software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bockaert, J., Pin, J. P. Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success. EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).
  2. Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).
  3. Drews, J. Drug discovery a historical perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).
  4. Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).
  5. Bendena, W. G. Neuropeptide physiology in insects. Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).
  6. Van Hiel, M. B., et al. Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents. Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).
  7. Tang, X. L., Wang, Y., Li, D. L., Luo, J., Liu, M. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).
  8. Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schiöth, H. B. G protein-coupled receptor deorphanizations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).
  9. Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors. Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).
  10. Brough, S. J., Shah, P. Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling. Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).
  11. Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  12. Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay. Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).
  13. Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).
  14. Lu, H. -L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. J. Vis. Exp. (50), e2732 (2011).
  15. Feng, G., et al. Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster. Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).
  16. Nässel, D. R., Wegener, C. A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling. Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).
  17. Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. Mini-review The evolution of neuropeptide signaling. Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).
  18. Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview. Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).
  19. Kozak, M. An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs). Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  20. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase. CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  21. Ral Conklin, B., et al. Carboxyl-terminal mutations of Gqα and Gsα that alter the fidelity of receptor activation. Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).
  22. Kostenis, E. Is Gα16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).
  23. Robas, N. M., Fidock, M. D. Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays. Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).
  24. Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., Gäde, G., Schoofs, L. Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors. Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).
  25. Peeters, L., et al. A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes. Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).

Tags

Cellular Biology G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) calcium mobilisatie assay omgekeerde farmacologie ontwezing cellulair expressiesysteem HEK293T Fluo-4 FlexStation
Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Caers, J., Peymen, K., Suetens, N.,… More

Caers, J., Peymen, K., Suetens, N., Temmerman, L., Janssen, T., Schoofs, L., Beets, I. Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay. J. Vis. Exp. (89), e51516, doi:10.3791/51516 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter