Karaktärisering av G-proteinkopplade receptorer av en fluorescensbaserad kalciummobilisering Assay

Summary

Den här beskrivna fluorescens-baserade kalciummobilisering analysen är en medel genomströmning omvänd farmakologi screening system för identifiering av funktionellt aktiverande ligand (er) av föräldralösa G-proteinkopplade receptorer (GPCRs).

Abstract

För mer än 20 år, har omvänd farmakologi varit den mest framstående strategi för att upptäcka de aktiverande ligander av föräldralösa G-proteinkopplade receptorer (GPCRs). Uppkomsten av en omvänd farmakologi analysen är kloningen och efterföljande transfektion av en GPCR av intresse i ett cellulärt expressionssystem. Den heterologa uttryckta receptorn utmanades sedan med en förening bibliotek av kandidatligander för att identifiera receptor-aktiverande ligand (er). Receptoraktivering kan bedömas genom mätning av förändringar i koncentrationen av andra budbärare reportermolekyler, såsom kalcium-eller cAMP. Den fluorescens-baserade kalciummobilisering analys som beskrivs här är en ofta använd medel genomströmning vända farmakologi analys. Den anonyma GPCR transient uttryckt i humana embryonala njur-293T (HEK293T)-celler och en promiscuous _{Ga-16-konstruktionen} samtransfekteras. Efter ligandbindning, aktivering av _{Ga-16-subenheten} inducerar frisättningen av kalcium firom det endoplasmatiska retiklet. Före ligand screening, är receptoruttryckande celler laddade med en fluorescerande indikator kalcium, Fluo-4 acetoximetyl. Fluorescenssignalen av Fluo-4 är försumbar i celler under vilande betingelser men kan amplifieras mer än en 100-faldig vid interaktionen med kalciumjoner som frisätts efter receptoraktivering. Den beskrivna tekniken kräver inte den tidskrävande etablering av stabilt transfekterade cellinjer i vilka den transfekterade genetiska materialet är integrerat i värdcellgenomet. Istället kan en transient transfektion, generera tillfälligt uttryck av målgenen, är tillräcklig för att utföra screeningsanalys. Installationen gör mellan throughput screening av hundratals föreningar. Co-transfektion av promiscuous _Ga-16, som är kopplad till de flesta GPCR: er, ger den intracellulära signaleringsvägen som skall omriktas mot frisättningen av kalcium, oberoende av den nativa signalväg i endogen instningar. De HEK293T cellerna är lätta att hantera och har bevisat sin effektivitet genom åren i receptor deorphanization analyser. Emellertid kan en optimering av analysen för specifika receptorer förblir nödvändigt.

Introduction

G-proteinkopplade receptorer (GPCR) utgör en av de största och mest diversifierade familjerna bland alla cellytan proteiner. Deras närvaro i ryggradsdjur, ryggradslösa djur, växter, jäst och slemsvamp, samt i protozoer och den tidigaste diploblastic Metazoa visar att GPCRs är bland de äldsta molekylerna är kopplade med signaltransduktion ^1. Deras naturliga aktiverande ligander omfattar en stor mångfald av yttre stimuli, inklusive peptider, biogena aminer, luktämnen, glykoproteiner och fotoner ^2. Som sådana är dessa receptor-ligand signalsystem inblandad i ett stort antal olika fysiologiska processer. Det breda funktionella spektrum gör dem idealiska för utveckling av terapeutiska läkemedel som täcker ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar. Om 50-60% av de nuvarande läkemedelsmål representeras av GPCRs ^3,4. Förutom deras stora betydelse inom läkemedelsindustrin, GPCRs är också i fokus för utvecklingen av enny generation av artspecifika insekts ^5,6 och bekämpningsmedel i allmänhet. Eftersom de naturliga ligander av många GPCRs är fortfarande oidentifierad, klassificeras de som föräldralösa GPCRs. Den deorphanization av dessa receptorer kommer att förbättra förståelsen för deras fysiologiska roller i organismer och kan avslöja förmodade mål för nya läkemedelsansökningar ^7.

Eftersom den genomiska eran, är det omvända farmakologi strategi i stor utsträckning för deorphanization av GPCRs ^8. Ansatsen innebär att en föräldralös receptor används som en "krok" till "fiska ut" sin aktiverande ligand från ett biologiskt extrakt eller från ett bibliotek av syntetiska ämnen. Den GPCR av intresse därför klonas och därefter transfekteras i ett cellulärt expressionssystem. I de mest vanligen använda metoderna är receptoraktivering bestämmas genom mätning av förändringar i koncentrationen av den andra budbärarmolekyler ⁹ (t.ex. aequorin) ¹⁰ eller fluorescerande kalcium indikatorer (t.ex. Fluo-4) ^11. De fluorescensbaserade analyser, där receptoruttryckande celler är laddade med en fluorescerande indikator kalcium före ligand screening, har den fördelen att de tillåter high-throughput screening på grund av sin användarvänlighet, kort tid att läsa, och flexibiliteten i screening flera föräldralösa receptorer på en enda platta ^12.

Här är den fluorescensbaserad kalciummobilisering assay noggrant beskrivas och illustreras genom deorphanization förfarandet enligt Drosophila melanogaster korta neuropeptid F (sNPF) receptorn. Denna neuropeptidergic signalsystem ursprungligen präglats av Mertens et al. 2002 ¹³ med en kalcium mareld analys utförs i kinesisk hamster äggstock (CHO)¹⁴ och av Feng et al. 2003 med en elektrofysiologisk analys med hjälp av Xenopus oocyter ^15. Närvaron av signalsystemet sNPF tycks vara begränsat till phylum av Arthropoda, där den är inblandad i ett stort antal processer inklusive regleringen av matning, tillväxt, stressreaktioner, locomotion och dygnsrytm ^16.

Forskning om neuropeptidergic signalsystem i insekter kan inte bara leda till nya mål för utvecklingen av insektsmedel, men kunskapen om deras funktion kan också extrapoleras till andra organismer så många signalsystem har i allmänhet väl bevarade genom evolutionen ^17. Under det senaste decenniet har stora framsteg gjorts i deorphanization processen av insektsneuropeptid GPCRs. Trots dessa ansträngningar har bara ett litet antal receptorer matchats till sin tillhörande ligand, och massor av sekvensinformation förnya föräldralösa GPCRs har blivit tillgängliga på grund av den blomstrande av genomik ^18. Tillgången på medium / high-throughput screening metoder, såsom fluorescensbaserade kalciummobilisering analys som har visat sig vara en stor utsträckning teknik ^9,18, är därför ovärderlig.

Fluorescensbaserade kalciummobilisering analys såsom beskrivits här utförs i humana embryonala njur 293T (HEK293T) cellinjen och använder en fluorescerande prob för att fastställa förändringar i intracellulära kalciumkoncentrationer på receptoraktivering. För att garantera hög expression och nivåer av receptorn översättnings är en Kozak konsensussekvens ¹⁹ sattes till 5'-änden av den receptorkodningssekvensen, som därefter klonas i en expressionsvektor (t.ex. pcDNA vector serie för däggdjurscellinjer). Eftersom det är svårt att förutsäga den endogena G-protein-koppling av en föräldralös GPCR baserat på sekvensinformationensam, den andra budbärarmolekyler (t.ex. kalcium-eller cAMP) som moduleras efter receptoraktivering förblir ofta okänd före ligand identifiering. För att kringgå detta problem, promiscuous G-proteiner i _Gq familj (t.ex. murina _Ga-15 eller human Ga ₁₆ [används här]) eller chimära G-proteiner (t.ex. Ga _qi5) som interagerar med de flesta GPCR: er och inducerar frisättningen av kalcium kan samuttryckas ^20,21,22. Vid bindning av liganden till dess receptor undergår GPCR en konformationsförändring som leder till aktivering av specifika intracellulära signalvägar. Den guanosin difosfat (GDP) molekyl, bunden inom ramen vilande betingelser till _{Ga-16-subenhet,} kommer att ersättas av en guanosin-trifosfat (GTP)-molekyl. Detta framkallar dissociationen av det heterotrimera G-proteinet i en _Ga-16 och Gβγ subenheten. Den Ga ₁₆ subenheten aktiverar fosfolipas C &# 946; (PLCβ), vilket i sin tur hydrolyserar den membranbundna fosfatidylinositol bisfosfat _(PIP2) vilket resulterar i diacylglycerol (DAG) och inositol-trifosfat _(IP3). IP ₃ kommer att spridas över hela cytoplasman och aktiverar _{IP-3-beroende} kalciumkanaler som är närvarande i membranet i det endoplasmatiska retiklet, vilket inducerar frisättningen av kalcium i cytoplasman.

Kalcium frisättning vid receptoraktivering inträffar inom några sekunder och kan detekteras genom laddning av celler före screeningsanalys med ett kalciumkänsligt färgämne, som Fluo-4 acetoximetyl (AM) ^11. AM estergruppen möjliggör fluoroforen att passera cellmembranet och spjälkas av genom cytoplasmatiska esteraser en gång inne i cellen. Följaktligen är de negativa laddningarna i det fluorescerande färgämnet omaskerad, hindrar den från att diffundera ut ur cellen och låta det interagera med kalciumjoner. Den fluorescerande signal of Fluo-4 är försumbar i celler under vila förhållanden endast innehåller kalciumkoncentrationer i nanomolarområdet. Emellertid, när kalcium frigöres vid receptoraktivering, kan signalen öka koncentrationsberoende till mer än en 100-faldig, härmed att säkerställa ett stort signal-till-brusförhållande. Fluo-4 uppvisar också ett stort dynamiskt omfång för att rapportera [kalcium] runt ett _Kd (kalcium) på 345 nM, vilket gör den lämplig för att mäta fysiologiskt relevanta kalcium förändringar i en rad olika celler. Exciteringen av Fluo-4 uppträder vid 488 nm och fluorescensemissionen mäts vid 525 nm ^11. Fluorimeters såsom fluorescens avbildningsplattläsare (FLIPR) ^23, den Novostar eller FlexStation (stationsanordningen) ¹² är medium / high-throughput system som tillåter samtidig förening addition och detekteringen av Fluo-4 signal vid receptoraktivering för varje brunn i en analysplatta. Den kalciummobilisering analysen beskriven här förlitar sig på stationenenheten 96-brunnars mikrosystemet.

Den SoftMax Pro (mjukvara) används för att driva stationen enheten samt för analys av data. Programmet visar omedelbart resultatet som diagram i 96-brunnsformat. Flera brunnar kan väljas samtidigt för att jämföra resultaten av dessa brunnar i samma diagram. Den relativa fluorescerande enhet (RFU)-värden för brunnar i varje kolumn samtidigt mäts under en period av två minuter, med början före tillsatsen av föreningarna till brunnarna och fortsätter efter mätning av den fluorescerande signalen följande receptoraktivering. Typiskt, utvecklingen av en agonist kurvan sammanfaller med baslinje tills en aktiverande förening sättes till cellerna, vilket resulterar i en snabb ökning av fluorescenssignalen. Den topphöjden är korrelerad med den slutliga agonistkoncentrationen i brunnen. Efter toppen, droppar den fluorescerande signalen långsamt mot baslinjenivån. Det RFU mätningar can omvandlas till koncentration-responskurvor för att bestämma _EC50-värdet (halva maximala effektiva koncentrationen) av en ligand. I allmänhet är åtminstone tre oberoende skärmar, var och en innefattar tre kopior av en koncentrationsserie, ska utföras för att komponera en tillförlitlig koncentration-responskurva.

Det rekommenderas att inkludera flera positiva och negativa kontroller i experimentell design. Först av allt, en transfektion kontroll, dvs genomförande av en receptor med en känd ligand, bör testas. Detta gör det möjligt att kontrollera om den transfektion agenten var i drift. Inkorporering av ett kontrollförsök med en agonist för en endogen receptor av cellinjen och en negativ kontroll (t.ex. tvättbuffert) rekommenderas också för att övervaka hälsan och livskraften hos cellerna och för att utesluta möjligheten att tvättbufferten var kontaminerad med en faktor som skulle kunna framkalla ett auto fluoredoft svar. Ofta använda agonister är en peptid härledd från det proteas-aktiverad receptor-1 (PAR _1), som verkar som en PAR _en selektiv agonist, eller karbakol, som aktiverar den acetylkolinreceptorn. Celler transfekterade med en tom expressionsvektor bör också testas för att utesluta att aktiva föreningar interagerar med cellens endogena receptorer. Optimering av flera parametrar som beskrivs i protokollet nedan kan krävas för olika signalsystem. En schematisk figur av den fullständiga fluorescensbaserad kalciummobilisering analysen visas i Figur 1.

Figur 1. Övergripande schema över fluorescensbaserade kalciummobilisering analys. Automatiserad vätskehantering och samtidig fluorescensmätningar utförs med stationenenhet mikroplattläsare, som drivs av programvaran. Stationen enheten innehåller tre lådor, en för cellplattan, förening plattan och dricks rack. Utbyggnaden i pipett överför föreningar från en kolumn av föreningen plattan till motsvarande kolumnen i cellplattan (steg 1). Varje brunn av cellplattan innehåller ett monolager av HEK293T celler som har co-transfekterade med GPCR av intresse och den promiskuösa Ga ₁₆ subenhet. När en förening som aktiverar receptorn, är _Ga-16-bunden BNP ersättas av GTP. The Ga ₁₆ subenhet dissocierar därefter från Gβγ komplexet och aktiverar fosfolipas Cp (PLCβ), vilket i sin tur hydrolyserar fosfatidylinositol bisfosfat _(PIP2) vilket resulterar i diacylglycerol (DAG) och inositol-trifosfat _(IP3). IP ₃ aktiverar _{IP-3-beroende} kalciumkanaler som är närvarande i membranet i det endoplasmatiska retiklet, vilket inducerar frisättningen av kalcium into cytoplasman. Interaktionen av kalcium med Fluo-4 (med vilket cellerna lagras inför till förening addition) resulterar i en fluorescenssignal (steg 2). Programmet presenteras resultaten som relativa fluorescerande enhet (RFU)-värden som funktion av tiden, och topphöjderna korrelerar med liganden koncentration på ett koncentrationsberoende sätt. Dessa data kan sedan omvandlas till en koncentration-responskurva för att bestämma _EC50-värdet på ett ligand-receptorparet (steg 3).

Protocol

Obs: Alla åtgärder i vilka celler är involverade bör utföras i en steril miljö genom att arbeta i ett laminärt flöde.

1. Underhåll av HEK293T cellinje

1. Odla HEK293T-celler i en T-75 kolv vid 37 ° C i en 5% _CO2 fuktad inkubator.
2. Passage cellerna när ett sammanflöde av 80% uppnås. Obs: Det tar normalt 3-4 dagar. Celler i kontinuerlig kultur tillåter 20-25 användbara passager för screening.
   1. Placera Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS) utan kalciumklorid och magnesiumklorid, PBS-trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (500 ml PBS kompletterad med 10 ml trypsin-EDTA-lösning och 4,5 ml 4% EDTA) och tillväxtmedium (500 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium - hög glukos [DMEM], kompletterat med 10% fetalt bovint serum [FBS] och 1 mM penicillin-streptomycin [PS]) vid rumstemperatur i en halvtimme i förväg.
   2. Ta bortdet gamla odlingsmediet från cellerna. Skölj bort döda celler med 3 ml PBS och ta bort PBS igen.
   3. Lägg 3 ml PBS-trypsin-EDTA, inkubera under 1 min vid rumstemperatur och avlägsna lösningen Anm Morfologin hos cellerna kommer att ändras från stjärnformade till sfär-formad.
   4. Lossa cellerna från botten av kolven genom försiktig knackning och samla upp cellerna genom sköljning botten flera gånger med 10 ml färskt tillväxtmedium.
   5. Överför 1 ml av cellkulturen till en ny T-75-kolv innehållande 14 ml färskt tillväxtmedium och inkubera vid 37 ° C i en 5% _CO2 fuktad inkubator.

2. Transient transfektion av HEK293T Celler

1. Odla HEK293T-celler i en T-75 kolv, tre dagar före själva kalciummobilisering analysen sker. Se till att använda tre T-75-kolvar, en för transfektion med receptorkonstruktionen, en för transfektion med en tom expressionsvektor, som negativ kontroll, och one för transfektion kontroll. Obs: passage av cellerna utförs som beskrivet i steg 1.2. När flera 96-hålsplattor måste screenas, kan T-150 flaskor användas för att få ett högre utbyte av celler (för att göra detta, dubbelt samtliga noterade mängder i steg 1.2.5, 2.3, 3.1.3 och 3.1.4) .
2. Inkubera kolvarna vid 37 ° C i en 5% _CO2 fuktad inkubator under 20 till 24 h tills cellkulturerna närma sig 50-70% konfluens.
3. Co-transfektera en population av celler med expressionsvektor som kodar för GPCR av intresse och Ga ₁₆ konstruktionen, den andra kolven med den tomma vektorn och Ga ₁₆ konstruktionen, och den tredje med transfektion kontroll och Ga ₁₆ konstruktionen. OBS: I detta protokoll var Drosophila sNPF receptorn klonad i en pcDNA3.1 mammalieexpressionsvektor ^13. JetPRIME användes för att utföra transfektionen, men andra transfektionsreagens kan användas också.
   1. Lägg påotalt av 7,8 | ig DNA (3,9 pg receptorkonstruktion eller tom vektor, och 3,9 | j, g Ga ₁₆ uttryckskonstruktion) till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 500 pl av JetPRIME buffert. Blanda väl genom att vortexa röret och centrifugera ner inom kort.
   2. Lägg 37,5 pl av JetPRIME reagens, virvel och spinn ner i 1 min vid 14000 x g.. Inkubera transfektion blandning 10 min vid rumstemperatur.
   3. Lägg transfektionen blandning droppvis till cellodlingsmediet och se till att pipetteringen direkt in i mediet att undvika kontakt med väggarna i odlingskolv. Inkubera kolvarna vid 37 ° C i en 5% _CO2 fuktad inkubator under 20 till 24 timmar.

3. Kalciummobilisering Assay

1. Samla de transfekterade cellerna och utsäde dem i 96-brunnars svarta väggar och klara bottnade plattor.
   1. Placera PBS, PBS-trypsin-EDTA och DMEM överföringsmedium (500 ml DMEM kompletterat med 10% dialyserat FBSoch 1% PS) vid rumstemperatur i en halvtimme i förväg.
   2. Coat den 96-väl svart väggar, klara bottenplattor med 60 l PBS med fibronektin (0,0025%) per brunn (5,85 ml PBS och 150 ul fibronektin [0,1%] per platta). Inkubera plattorna vid rumstemperatur i 1 h med locket på. Avlägsna lösningen från brunnarna och inkubera plattorna igen under 1 timme utan lock vid rumstemperatur. Alternativt är det möjligt att använda pre-belagda plattor för förbättrad fastsättning cell.
   3. Ta bort det gamla odlingsmedium från cellerna och spola döda celler bort med 3 ml PBS och ta bort PBS.
   4. Tillsätt 3 ml PBS-trypsin-EDTA, inkubera i 1 minut, ta sedan bort lösningen. Obs: cellernas morfologi ändras från stjärnformade till sfär-formad.
   5. Lossa cellerna från botten av flaskan genom att klappa försiktigt och samla dem genom att skölja flera gånger med 10 ml DMEM överföringsmedium. Överför cellerna i ett 50 ml Falcon-rör.
   6. Räknaantalet celler per ml (utförs med en NucleoCounter här, men en Burker kammare är acceptabelt). Tillsätt 100 | il av cellkulturen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 100 pl lyseringsbuffert och blanda genom att knacka på röret. Tillsätt 100 l stabiliserande buffert och blanda genom att peka.
   7. Fyll en NucleoCassette med cellsuspensionen och räkna cellerna med räknaren. Multiplicera antalet celler efter tre, som cellerna späddes med en faktor tre vid tillsats av lys och stabiliserande buffert i steg 3.1.6.
   8. Späd cellerna till en slutkoncentration av 600000 celler / ml och ympa 150 pl av cellerna per brunn i de belagda plattorna för att erhålla en celltäthet av omkring 90000 celler per / brunn. Undvik luftbubblor och knacka på plattan för att sprida cellerna jämnt för att få ett sammanhängande cellager. Inkubera plattorna vid 37 ° C i en 5% _CO2 fuktad inkubator under 16 till 24 timmar.
2. Fyll på cellerna med det fluorescerande färgämnet och förbereda compound plattan.
   1. Förbered Hanks balanserade saltlösning (HBSS) / HEPES / ^{Ca2 +} / bovint serumalbumin (BSA) buffert: lägga 165 l _CaCl2 stamlösning (1 M _CaCl2 i destillerat vatten [dH ₂ O] - butik i rumstemperatur), 500 pl HEPES stamlösning (1 M HEPES i dH ₂ O, pH 7,4 - Förvara i rumstemperatur), och 0,05 g BSA till 50 ml HBSS. Observera att fettsyrafritt BSA används för kalciumanalyser, såsom fettsyror kan aktivera specifika receptorer, vilket försämrar kalciumsignalen av receptorn av intresse.
   2. Förbered probenecid lösning (100x, 250 mM): lös upp 0,71 g probenecid i 5 ml NaOH (1 M) och tillsätt 50 pl HEPES lager lösning och 5 ml i HBSS / HEPES / ^{Ca2 +} / BSA-buffert - alltid bered nya lösning. Anm: Probenecid inhiberar oorganiska anjontransportörer som kan rubba Fluo-4 från cytoplasman, och därigenom minska den fluorescerande signalen. Det rekommenderas att utföra färgen lastning inärvaro och frånvaro av probenecid för att bestämma huruvida oorganiska anjontransportörer utgöra ett potentiellt problem i de speciella cellinjer under utredning, såsom probenecid kan även minska den agonistförmedlade signalen.
   3. Förbered tvättbuffert: tillsätt 500 l probenecid lösning till 50 ml HBSS / HEPES / ^{Ca2 +} / BSA-buffert, justera pH till 7,4 och filtrera buffertlösningen. Alltid förbereda färsk buffert, och 50 ml buffert per platta krävs.
   4. Förbered 10% pluronsyra lösning: Blanda 50 l pluronsyra (20% vikt / volym i dimetylsulfoxid [DMSO]) med 50 ^ DMSO - om kristallisering inträffar, värm till 37 ° C och alltid förbereda färsk lösning.
   5. Förbered Fluo-4:00-lösning (1 mM): lägg till 44 l 10% pluronsyra lösning på en flaska som innehåller 50 mikrogram Fluo-4:00 och skaka tills det är helt upplöst. Undvik exponering för ljus för att förhindra blekning av fluoroforen.
   6. Förbered buffert: till 8,8 ml DMEM supplemented med 10 mM HEPES och 2,5 mM probenecid (pH 7,4) till Fluo-04:00-lösning (44 | il) och skaka. Använd alltid färsk buffert.
   7. Kasta bort mediet från cellerna, tvätta cellerna med 200 pl PBS per brunn och avlägsna PBS.
   8. Addera 55 pl laddningsbuffert per brunn och inkubera under 1 timme vid rumstemperatur. Linda in plattan i aluminiumfolie för att undvika exponering av plattan för ljus.
   9. Se till att torka av föreningarna innan skärmen om de är lösta i lösningsmedel som är skadliga (t.ex. acetonitril) för det cellulära expressionssystem.
   10. Solubilisera peptiderna i tvättbuffert i silikoniserade 1,5 ml mikrorör. Bered en spädningsserie för att göra en koncentration-respons-analys och för att bestämma _EC50-värdet för en ligand. Addera 70 pl av liganden i motsvarande brunn av föreningen plattan (V-formade 96-brunnars plattor) och inkluderar positiva (endogen agonist) och negativa kontroller (tvättbuffert) på varje platta. Inte e: Om en förening inte är löslig i tvättbufferten, kan man prova andra lösningsmedel som inte är skadliga för cellerna som undersöks, till exempel vatten eller lösningar som emulgerar och solubiliserar oljor och andra vattenlösliga ämnen (t.ex. Kolliphor EL) .
   11. Mät alla prover i tre exemplar. Kom ihåg att 50 | il av en ligand från föreningen plattan kommer att överföras i en brunn med 100 ^ il tvättbuffert av cellplattan under analysen, så framställa föreningarna vid 3x sin önskade slutliga koncentrationen.
   12. Kassera laddningsbuffert från cellplattan och tillsätt 100 pl tvättbuffert till varje brunn. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur och förhindra exponering för ljus.
   13. Kassera tvättlösning från cellplattan och tillsätt 100 | il ny tvättbuffert till varje brunn.
   14. Inkubera cellplattan föreningen platta, och en spets kuggstång (96 brunnar, stationsanordningen pipettspetsar) under 15 min vid 37 ° C.

title "> 4. Assay på stationen Device

1. Skapa och ladda önskad protokollfilen med programmet och aktivera temperaturenhet för läsning kammaren. Här mäta kalciumsvar vid 37 ° C under 2 min en rad i taget med 1,52 sek intervall mellan på varandra följande avläsningar (mätning av en fullständig 96-brunnars platta tar cirka 25 min) vid 525 nm. Ställ excitation av Fluo-4 till 488 nm och överföra en total volym av 50 | il av föreningen till cellplattan, 18 sek efter det att behandlingen start med dispenseringshastighet inställd på 26 pl / sek och en pipett höjd av 135 | il.
2. Placera föreningen och cellplattan och spetsen kuggstången i lämpliga lådor för stationsanordningen.
3. Utför en läsning av cellplattan på samma excitation och emissionsvåglängd i ENDPOINT läget, innan själva skärmen i FLEX-läge. OBS: Denna mätning ger relativ fluorescens enhet (RFU) värden och möjliggör detektion av variabilitet mellan vills av plattan. Värden mellan 20.000 och 40.000 anses vara acceptabelt.
4. Starta analysen och analysera data med programvaran.

Representative Results

Koncentration serien sträcker sig från 50 ^ M till 0,001 nM testades för alla fyra Drosophila sNPF peptider (Drome-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide) på HEK293T celler som övergående uttrycker Drosophila sNPF receptorn och promiskuösa Ga ₁₆ subenhet. The GPCR aktiverades genom alla fyra peptider i slutkoncentrationer på upp till 0,1 nM och receptoraktivering var koncentrationsberoende. Figur 2 visar grafer som motsvarar en av tre kopior av den Drome-sNPF-en koncentrationsserie. Den negativa kontrollen (tvättbuffert) inducerade inte en fluorescerande signal, medan den positiva kontrollen (PAR ₁ - ₁ pM) framkallade en stark aktivering av det endogena proteaset-aktiverad receptor-1, vilket leder till en hög fluorescenssignal (± 30000 RFU). Det bör noteras att en avvikelse avden typiska kurvan kan indikera avvikelser. Till exempel kan en pågående ökning av kurvan utan att återvända till baslinjen vara relaterade till icke-receptor-medierade signaler, såsom förekomsten av kalciumjonoforer, eller en störd membranet orsakar kalciumläckage.

Mjukvaran gör det möjligt att skriva in formler för att bestämma den andel av aktivering eller standardfelen för de olika koncentrationer bland annat. De resulterande data används för att komponera preliminära koncentration-responskurvor för att beräkna _{EC50-värden,} såsom visas för de fyra Drome-sNPF peptider i Fig. 3. Kurvorna i Figur 3 inkluderar även data för den negativa kontrollen där koncentrationen serie de Drome-sNPF peptider testades på HEK293T celler transfekterade med en tom pcDNA3.1 vektor. Resultaten indikerar att tillsatsen av peptiderna till dessa celler har ingen effekt på endogena receptorer, men sannerligen activåt receptorn av intresse. Fluorescensbaserade kalciummobilisering analysen upprepades sedan tre gånger oberoende av varandra. På grundval av de preliminära koncentration-responskurvor för den första skärmen, de testade koncentrationerna anordnat att täcka det dynamiska området hos kurvan (fig. 4). EC50-värdena för Drome-sNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [95% konfidens-intervall]), Rhone-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Rhone-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) och Drome-sNPF- 4 (0,50 ± 1,01 nM) är liknande, vilket indikerar att de är lika potenta att aktivera receptorn.

Figur 2. Grafisk produktion av programvaran för en receptor-medierad fluorescens respons av en koncentration serie. Tolv slutliga koncentrationer (från 50 ^ M till 0,001 nM) of Drome-sNPF-1-peptid testades på Drome-sNPF receptorn. Aktivering uttrycks i relativa fluorescerande enhet (RFU) värden. Den övre grafen ger resultaten av de sex högsta koncentrationerna och den undre kurvan i de sex lägsta koncentrationerna. Den positiva kontrollen (+) är PAR ₁ (1 M) och den negativa kontrollen (-) är tvättbuffert.

Figur 3. Inledande koncentration-responskurvor för Drosophila sNPF peptider bestäms av en enda fluorescensbaserad kalciummobiliseringsanalys. De koncentration-responskurvor för Drosophila sNPF receptor uttrycktes transient i HEK293T celler för de fyra Drosophila sNPF peptider visas i blått. För de negativa kontrollerna (visas i rött), ades peptider testades på HEK293Tceller som transfekterats med en tom pcDNA3.1 vektor. De fluorescerande svaren visas som relativa (%) till det högsta värdet (100% aktivitet). Kurvorna är resultatet av ett experiment i vilket varje koncentrationsserie mättes i triplikat. De vertikala staplarna representerar standardfel av medelvärdet (SEM), som ibland är mindre än de som används symboler (i det fallet är det endast de symboler som avbildas).

Figur 4. Koncentration-responskurvor och motsvarande _EG-50 värden av Drosophila sNPF peptider bestäms av tre oberoende fluorescensbaserad kalciummobiliseringsanalyser. Koncentrations-responskurvor för Drosopihla sNPF receptorn transient uttryckta i HEK293T celler för de fyra Drosophila sNPF peptider är resultatet av tre oberoende migasurements varje utförd i tre exemplar (n ≥ 9). De fluorescerande svaren visas som relativa (%) till det högsta värdet (100% aktivitet). Asterisker indikerar koncentrationer för vilka n ≤ 9. Felstaplar visar SEM, som ibland är mindre än de som används symboler (i det fallet, bara de symboler som avbildas). EC _50-värden visas med deras 95% konfidensintervall.

Discussion

Fluorescensbaserade kalciummobilisering analys med framgång tillämpas för att bekräfta den funktionella karakteriseringen av Drosophila sNPF peptiderga signaleringssystem, som redan utfördes genom Mertens et al. med en bioluminescens-analys och av Feng et al. med en elektrofysiologisk analys ^13,15. De EG ₅₀ värden som erhålls med fluorescens-analys i HEK293T-celler är omkring 10 gånger lägre än de som erhölls med bioluminescens-analys utförs i CHO-celler (Drome-sNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drome-sNPF- 2: fluo = 5.89 nM, lumi = 42 nM, Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM, Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Dessa variationer kan förklaras av flera faktorer, inklusive det faktum att en av de använda expressionssystem kan vara bättre lämpade för funktionell expression av en given receptor eller vikningen av vissa receptorer kan vara mindre effektiva i cissa celltyper. De EC _50-värden för alla fyra Drome-sNPF peptider är i nanomolarområdet vid prov på sin receptor med både fluorescens och mareld analysen, i allmänhet stöder den fysiologiska relevansen av sin peptid-receptor interaktion in vivo.

Observera att ingen transfektion kontroll med en receptor för vilken den aktiverande liganden är känd ingick i skärm som presenteras här, eftersom signaleringssystemet Drosophila sNPF normalt transfektionen kontroll i experimentella uppställningar. Den positiva kontrollen med en endogen ligand av HEK293T cellerna (PAR ₁₎ och den negativa kontroll (tvättbuffert) inkluderades i skärmen. Resultaten från PAR ₁ visade att cellerna var i ett gott skick. Den negativa kontrollen (tvättbuffert) framkallade inte en fluorescerande signal, som indikerar att det medium i vilket peptiderna upplöses var fri från eventuella föroreningar som skulle kunna influence resultaten.

Den tidigare karakteriserats Drosophila sNPF signaleringssystem användes här för att förklara den fluorescensbaserad kalciummobiliseringsanalys. För detta ändamål var koncentrationsserie av de aktiverande ligander testades omedelbart. När emellertid en föräldralös receptor bringas till överexpression i en screeningsanalys för att testa ett bibliotek som innehåller hundratals av föreningar, är det rekommenderat att första skärmen med relativt höga slutkoncentrationer av liganderna (t.ex.., 10 eller 1 | iM). Efter detektering av en aktiverande förening, kan en utspädningsserie av att föreningen som skall screenas för att komponera en koncentration-responskurva och för att bestämma _EC50-värde.

När den aktiverande liganden hos en receptor som är bestämd, kan den intracellulära signaleringsvägen att undersökas ytterligare genom en anpassning av protokollet. Analysen kan utföras såsom beskrivits ovan, men utan att samtransfektera G ^5, _{16-subenheten.} När ett kalciumsvar mäts, betyder det att receptorn par med en endogen Ga _q-subenheten av det cellulära expressionssystemet. När ingen fluorescerande signal observeras, kan protokoll för att mäta förändringar i koncentrationer av andra sekundära budbärare (t.ex.., CAMP) tillämpas.

Struktur-aktivitetssamband (SAR) studier kan även utföras för att definiera peptidens kärnsekvensen som krävs för aktivering av receptorn. Först är stympade sekvenser utvärderas för att definiera den minimala aminosyrasekvensen för den peptid som fortfarande kan aktivera receptorn. Därefter kan peptider testas i vilken systematiskt varje aminosyra har ersatts med en alaninrest. Testning syntetisk alaninsubstitutionsserie på receptorn tillåter att bestämma vikten av var och en av aminosyrorna för receptoraktivering ^24,25.

Trots dess allmänna användning och bevisade effekkans, måste det understrykas att den analys som beskrivs här kan behöva några anpassningar för att få optimala resultat för specifika receptorer av intresse. The Ga ₁₆ subenheten har den fördelen att den binder till de flesta GPCR: er, men kan också ha en dominant-negativ effekt på receptorer som endogent par via Ga _q ^22. I detta fall kan det vara bra att testa olika kombinationer av G-proteiner under optimeringen av en kalciumanalys roman och att jämföra resultaten för Ga _q kopplade receptorer i frånvaro eller närvaro av Ga _16. Alternativa analyser som är oberoende av den samverkande G-protein för att upptäcka receptoraktivering kan också utföras, såsom translokation av GFP-märkta arrestin, eller att upptäcka förändringar i membranpotential (t ex., Av FLIPR Membrane Potential Assay Kit). Förutom använde Fluo-4:00 här, ett brett utbud av andra kalciumkänsliga fluoroforer, alla med sin egen spektral och chemical egenskaper, finns tillgänglig. Den lämpligaste fluorofor kan väljas baserat på den GPCR, celltyp och den tillgängliga plattläsare, men experimentell verifiering är nödvändig. Mängderna transfekterade DNA och DNA / transfektionsreagens förhållande behov att bestämmas för varje receptor-transfektion reagens-cellinje kombination. Slutligen bör det hållas i minnet att celler i kontinuerlig kultur tillåter endast 20-25 användbara passager för att utföra screeningsanalyserna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA solution (0.25%)	Sigma-Aldrich	T4049
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	MP Biomedicals	195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose  (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Penicillin-Streptomycin (P-S)	Sigma-Aldrich	P4333
jetPRIME	Polyplus transfection	114-01	FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies)
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Reagent A100, Lysis buffer	Chemometec	910-0003
Reagent B, Stabilizing buffer	Chemometec	910-0002
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H8264
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
NaOH (1 M)	Vel	2781
Pluronic acid	Invitrogen	P-3000MP
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)	Sigma-Aldrich	Z707503 and Z707554
FlexStation device	Molecular Devices		NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom	Greiner Bio-One	655090	Corning 96-well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates
NucleoCassette	Chemometec	941-0001
NucleoCounter NC-100	Chemometec
Microcentrifuge tubes, siliconized	BioCision	BCS-2470
Polystyrene V-shaped 96-well plates	Greiner Bio-One	651101
96-Well, FlexStation pipette tips	Molecular Devices	9000-0912
Soft Max Pro software	Molecular Devices