Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Характеристика G-белком с помощью флуоресцентной основе кальция мобилизации Пробирной

Published: July 28, 2014 doi: 10.3791/51516
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, KU Leuven

Summary

Здесь описано флуоресценции на основе кальций мобилизации анализ является средней пропускной способности обратной фармакологии система скрининга для идентификации функционально активирующего лиганда (ов) бесхозных G-белком рецепторов (GPCR).

Abstract

На протяжении более 20 лет, обратная фармакология был выдающийся стратегии, чтобы обнаружить активирующих лигандов сирот G-белком (GPCR). Наступление обратной фармакологии анализа является клонирование и последующей трансфекции GPCR интереса к сотовой системе экспрессии. Гетерологичный выражена рецептор то вызов с соединением библиотеки лигандов-кандидатов для идентификации рецептор-лиганд активации (ы). Активация рецепторов можно оценить путем измерения изменений в концентрации молекул второй мессенджер репортера, как кальций или цАМФ. Флуоресценции основе кальция мобилизация анализа, описанного здесь, часто используется средне-пропускной обратная фармакология анализа. Сирота ХВГФ временно экспрессируется в эмбриональных почек 293T (HEK293T) клеток и беспорядочную половую жизнь Gα 16 конструкция является котрансфицируют. После связывания лиганда, активация Gα 16 субъединицы индуцирует высвобождение кальция фром эндоплазматической сети. До лиганда скрининга, клетки, экспрессирующие рецептор загружаются с флуоресцентным индикатором кальция, Fluo-4 ацетоксиметил. Флуоресцентный сигнал из Fluo-4 незначительна в клетках в состоянии покоя, но может быть усилен более чем в 100 раз при взаимодействии с ионами кальция, которые выбрасываются после активации рецептора. Описанная методика не требует много времени созданию стабильно трансфицированных клеточных линий, в которых трансфектированную генетический материал, интегрированных в геном клетки-хозяина. Вместо этого переходное трансфекции, создавая временную экспрессию гена-мишени, является достаточным для выполнения скрининге. Установка позволяет среднего скрининг сотен соединений. Совместной трансфекции в беспорядочном Gα 16, который соединен с большинством GPCRs, позволяет внутриклеточный сигнальный путь будет перенаправлен к выпуску кальция, независимо от нативного сигнального пути эндогенного брусчаткиIngs. В клетки HEK293T просты в обращении и доказали свою эффективность на протяжении многих лет в рецепторных deorphanization анализов. Тем не менее, оптимизация анализа на специфические рецепторы могут оставаться необходимо.

Introduction

G-белком рецепторы (GPCR) составляют одну из крупнейших и наиболее диверсифицированных семей среди всех белков клеточной поверхности. Их присутствие в позвоночных, беспозвоночных, растения, дрожжи, и слизь плесень, а также в простейших и первой имеющий два зародышевых листка многоклеточные указывает, что GPCRs являются одними из старейших молекул, связанных с передачи сигнала 1. Их естественные активирующие лиганды включают в себя широкое разнообразие внешних раздражителей, включая пептиды, биогенные амины, отдушек, гликопротеинов и фотонов 2. Таким образом, эти системы сигнализации рецептор-лиганд участвуют в самых разнообразных физиологических процессов. Широкий Спектр устройств делает их идеально подходит для развития терапевтических препаратов, которые охватывают широкий спектр заболеваний человека. О 50-60% текущих лекарственных препаратов представлены GPCRs 3,4. Кроме того, их большое значение в фармацевтической промышленности, GPCRs также в центре внимания для развитияНовое поколение видоспецифичных инсектицидов 5,6 и пестицидов в целом. Поскольку естественные лиганды многих GPCRs еще неизвестный, они классифицируются как сирот GPCRs. Deorphanization этих рецепторов улучшит понимание их физиологической роли в организме и может раскрыть предполагаемые цели для новых приложений наркотиков 7.

С геномной эры, обратная стратегия фармакология широко применяется для deorphanization из GPCRs 8. Подход предполагает, что сиротский рецептор используется в качестве "крючок" до "рыба без 'ее активации лиганда с биологической экстракта или из библиотеки синтетических соединений. GPCR, представляющий интерес, поэтому клонировали и затем трансфицируют в сотовой системе экспрессии. В наиболее часто используемых методов, активация рецепторов определяют путем измерения изменений в концентрации молекул второго Messenger 9 (например, экворин) 10 или люминесцентные индикаторы кальция (например, флуо-4) 11. Флуоресцентные основе анализов, в которых рецептор-экспрессирующие клетки загружаются с флуоресцентным индикатором кальция до лиганда скрининга, имеют то преимущество, что они позволяют высокопроизводительного скрининга из-за их простоты использования, короткое время чтения, и гибкость скрининга несколько рецепторы сирот на одной пластине 12.

Здесь, флуоресценция на основе кальций мобилизации анализ тщательно описаны и проиллюстрированы в процессе deorphanization от Дрозофилы короткого нейропептида F (sNPF) рецепторов. Эта система сигнализации neuropeptidergic был первоначально характеризуется Мертенс и др.. в 2002 году 13 с биолюминесценции кальция анализа, проведенного в клетки яичника китайского хомячка (СНО)14 и Фэн и др.. В 2003 году с помощью электрофизиологического анализа с использованием Xenopus ооциты 15. Наличие системы сигнализации sNPF-видимому, ограничена к типу членистоногих, где она участвует в широком диапазоне процессов, включая регулирование подачи, роста стрессовых реакций, передвижения, и циркадных ритмов 16.

Исследование neuropeptidergic сигнальных систем насекомых может привести не только к новым целям для развития инсектицидов, но знание их функционирования могут быть также экстраполированы по отношению к другим организмам, как многие системы сигнализации в целом были хорошо сохраняющихся в ходе эволюции 17. В последнее десятилетие значительный прогресс был достигнут в процессе deorphanization насекомыми нейропептида GPCRs. Несмотря на эти усилия, лишь небольшое количество рецепторов были согласованы с их родственным лигандом, и множество информации о последовательности дляновые сироты GPCRs стала доступна благодаря бум геномики 18. Наличие средних / высокопроизводительного скрининга подходов, как флуоресценции основе кальция мобилизационной анализа, который оказался быть широко применяется методика 9,18, поэтому бесценны.

Флуоресценция на основе кальций мобилизации анализ, как описано здесь выполняется в человеческой эмбриональной почки 293T (HEK293T) клеточной линии и использует флуоресцентный зонд для определения изменений внутриклеточной концентрации кальция при активации рецептора. Чтобы гарантировать высокий уровень экспрессии и уровни перевод рецептора, консенсус последовательность Козака 19 добавляется к 5'-конца от кодирующей рецептор-последовательности, который впоследствии клонированного в вектор экспрессии (например, pcDNA вектор серии для клеточных линий млекопитающих). Как это трудно предсказать эндогенный G белок-сцепление-сироты GPCR на основе последовательности информацииодин, второй молекулы посыльного (например, кальция или цАМФ), которые модулированные после активации рецептора часто остаются неизвестными до идентификации лиганда. Чтобы обойти эту проблему, беспорядочные G белки семейства д G (например, мышиных Gα 15 или 16 человека Gα [используемого здесь]) или химерных белков G (например, Gα qi5), которые взаимодействуют с большинством GPCR, и вызывают высвобождение кальция может быть совместно выразили 20,21,22. После связывания лиганда с его рецептором, GPCR претерпевает конформационное изменение, которое приводит к активации специфических внутриклеточных путей. Гуанозин дифосфат (ВВП) молекула, обязаны в соответствии с покоящихся условиях в Gα 16 субъединицы, будет заменен на гуанозинтрифосфата (GTP) молекулы. Это провоцирует диссоциацию гетеротримерного G белка в Gα 16 и Gβγ субъединицы. Gα 16 субъединицы активирует фосфолипазу С &# 946; (PLCβ), который в свою очередь гидролизует мембраносвязанное фосфатидилинозитол бисфосфат (PIP 2) в результате диацилглицерина (DAG) и инозитол трифосфата (IP 3). ИП 3 будет распространяться по всей цитоплазме и активирует 3-зависимые IP кальциевых каналов, присутствующих в мембране эндоплазматической сети, который вызывает высвобождение кальция в цитоплазму.

Высвобождение кальция при активации рецепторов происходит в течение нескольких секунд и могут быть обнаружены путем загрузки клеток перед скрининге с кальций-чувствительным красителем, как Fluo-4 ацетоксиметил (AM) 11. Эфир группа AM позволяет флуорофором пересечь клеточную мембрану и отщепляется от цитоплазматических эстераз раз внутри клетки. Следовательно, отрицательные заряды флуоресцентным красителем которые без маски, предотвращая его диффузии из клетки и позволяет ему взаимодействовать с ионами кальция. Флуоресцентный сигнал ое Fluo-4 является незначительным в клетках в состоянии покоя, содержащих только концентрации кальция в наномолярном. Тем не менее, когда кальций высвобождается при активации рецептора, сигнал может увеличить в зависимости от концентрации в более чем в 100 раз, добровольно обеспечивает большое отношение сигнал-шум. Fluo-4 также обладает большой динамический диапазон для сообщения [кальций] вокруг K D (кальций) 345 нМ, что делает его пригодным для измерения физиологически соответствующие изменения кальция в широком диапазоне клеток. Возбуждение Fluo-4 происходит при 488 нм и флуоресцентное излучение измеряется при 525 нм 11. Флуориметров, как визуализация флуоресценции ридере (FLIPR) 23, Novostar, или FlexStation (станция устройство) 12 являются средние / системы высокой пропускной которые позволяют одновременно соединение сложение и обнаружение на флуо-4 сигнала при активации рецептора для каждой скважины в аналитический планшет. Анализ мобилизации кальция описано здесь опирается на станцииУстройство системы микропланшет с 96 лунками.

SoftMax Pro программное обеспечение (ПО) используется для управления устройством станции, а также для анализа данных. Программа немедленно отображает результаты в виде диаграмм в формате 96-а. Несколько скважин могут быть выбраны одновременно для сравнения результатов этих скважин на одном графике. Относительное флуоресцентный блок (РФС) значения скважин в каждом столбце, измеряются одновременно в течение двух минут, начиная перед добавлением соединений в лунки и продолжается после измерения флуоресцентного сигнала после активации рецептора. Как правило, тенденция кривой агониста выравнивается с базовой линией, пока активирующее соединение не будет добавлен к клеткам, что привело к быстрому увеличению флуоресцентного сигнала. Высота пика коррелирует с конечной концентрацией агониста в скважине. После пика, флуоресцентный сигнал медленно падает к базовому уровню. Измерения РФС окн быть переведены в кривые реакции на концентрацию для определения EC 50 значение (половина максимальная эффективная концентрация) лиганда. В целом, по крайней мере три независимых экранов, каждый из которых включает три реплик серии концентрации, должны быть выполнены, чтобы составить достоверную кривую концентрация-ответ.

Рекомендуется включать в себя несколько положительный и отрицательный контроль в экспериментальном дизайне. Прежде всего, контроль трансфекции, т.е. реализации рецептора с известным лигандом, должны быть проверены. Это позволяет проверить, является ли трансфекции агент был в рабочем состоянии. Включение контрольном эксперименте с агонистом для эндогенного рецептора клеточной линии и отрицательного контроля (например, промывочного буфера), также рекомендуется контролировать здоровье и жизнеспособность клеток и исключить возможность того, что промывочный буфер загрязненная фактором, который может вызвать авто-fluoreЗапах ответ. Часто используемые агонисты пептида, полученного из протеазы активированного рецептора-1 (PAR 1), который действует как PAR 1 селективного агониста, или карбахола, который активирует рецептор ацетилхолина. Клетки, трансфицированные пустой вектор экспрессии также должны быть проверены, чтобы исключить, что активные соединения взаимодействуют с эндогенными рецепторами клетки. Оптимизация нескольких параметров, описанных ниже в протоколе могут потребоваться для различных систем сигнализации. Схематический рисунок полного флуоресценции на основе кальция мобилизации анализа изображен на рисунке 1.

Рисунок 1
Измерения Рисунок 1. Общая схема флуоресценции основе кальция мобилизационной анализа. Автоматизированная обработка жидкости и одновременное флуоресценции выполняются со станциеймикропланшет устройства читатель, движимый с помощью программного обеспечения. Устройство станция содержит три ящика: один для планшета с клетками, соединение пластины и наконечник стойки. Встроенный в пипетки передает соединения из одной колонки составного пластины в соответствующей графе клеточной пластинки (шаг 1). Каждая лунка планшета с клетками содержит монослой HEK293T клеток, которые были котрансфицируют с GPCR интереса и беспорядочном Gα 16 субъединицы. Когда соединение активирует рецептор, Gα 16 переплете ВВП заменяется ГТФ. Gα 16 субъединицы впоследствии диссоциирует из комплекса Gβγ и активирует фосфолипазу Cβ (PLCβ), который в свою очередь гидролизует фосфатидилинозит бисфосфат (PIP 2), в результате диацилглицерина (DAG) и инозитол трифосфата (IP 3). ИП 3 активирует IP-каналы 3-зависимой кальция, имеющегося в мембране эндоплазматического ретикулума, вызывая высвобождение кальция Intо цитоплазма. Взаимодействие кальция с Fluo-4 (с которой клетки будут загружены до соединение дополнение) приводит к флуоресцентного сигнала (шаг 2). Программное обеспечение представляет результаты в виде относительной флуоресцентной блока (РФС) значений в зависимости от времени, и высоты пиков коррелирует с концентрацией лиганда в зависимости от концентрации. Эти данные затем могут быть преобразованы в кривой концентрация-ответ, чтобы определить значение пары лиганд-рецептор (шаг 3) EC 50.

Protocol

Примечание: Все действия, в которые вовлечены клетки следует проводить в стерильных условиях, работая в ламинарном потоке.

1. Ведение HEK293T клеточной линии

  1. Расти HEK293T клеток в Т-75 колбу при 37 ° С в 5% СО 2 увлажненном инкубаторе.
  2. Прохождение клетки, когда слияние 80% будет достигнут. Примечание: Как правило, это занимает от 3 до 4 дней. Клетки в непрерывной культуре позволяют 20-25 используемые каналы для скрининга.
    1. Поместите забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко в (PBS) без хлорида кальция и хлорид магния, PBS-трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (500 мл PBS с добавлением 10 мл раствора трипсина-ЭДТА и 4,5 мл 4% EDTA) и ростовой среде (500 мл среднего модифицированной орла Дульбекко - с высоким содержанием глюкозы [DMEM] с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки [FBS] и 1 мМ пенициллин-стрептомицина [PS]) при комнатной температуре полчаса заранее.
    2. Удалятьстарый ростовую среду из клеток. Смойте мертвые клетки с 3 мл PBS и снимите PBS снова.
    3. Добавить 3 мл PBS-трипсин-ЭДТА, инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре и удаления раствора Примечание: морфология клеток будет меняться от звездообразный к сфере-образную форму.
    4. Ослабьте клеток со дна колбы, осторожно разговоров и сбора клеток путем промывки нижние несколько раз с 10 мл свежей среды для роста.
    5. Передача 1 мл клеточной культуры в новые Т-75 колбу, содержащую 14 мл свежей среды роста, и инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 увлажненном инкубаторе.

2. Переходные Трансфекцию HEK293T клеток

  1. Расти HEK293T клеток в Т-75 колбу 3 дня до фактического мобилизационной кальция анализа происходит. Убедитесь, что используете три Т-75 колб, один для трансфекции рецептора конструкции, по одному для трансфекции с пустой вектор экспрессии, в качестве отрицательного контроля, и оСВ для контроля трансфекции. Примечание: пассирования клеток осуществляют, как описано в шаге 1.2. Когда несколько 96-луночные планшеты должны быть экранированы, Т-150 колбы можно использовать, чтобы получить более высокий выход клеток (для этого, двойные все перечисленные величины с шагом 1.2.5, 2.3, 3.1.3 и 3.1.4) .
  2. Инкубируйте колбы при 37 ° С в 5% СО 2 увлажненном инкубаторе в течение 20-24 часов, пока клеточные культуры не подойти 50-70% слияния.
  3. Со-трансфекции один популяция клеток с вектором экспрессии, кодирующего GPCR интереса и Gα 16 конструкции, второй колбу с пустым вектором и Gα 16 конструкции, а третий с контролем трансфекции и Gα 16 конструкции. Примечание: В этом протоколе, рецептор Drosophila sNPF был клонирован в pcDNA3.1 вектора экспрессии млекопитающих 13. JetPRIME была использована для выполнения трансфекции, но и другие трансфекции реагенты могут быть использованы также.
    1. Добавить вг о 7,8 мкг ДНК (3,9 мкг рецепторов конструкция или пустой вектор, и 3,9 мкг Gα 16 конструкция экспрессии) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавить 500 мкл буфера JetPRIME. Хорошо перемешайте встряхиванием трубки, и спин вниз в ближайшее время.
    2. Добавить 37,5 мкл JetPRIME реагента, вихря и спином вниз в течение 1 мин при 14000 х г. Инкубируйте трансфекции смесь 10 мин при комнатной температуре.
    3. Добавьте по каплям смесь для трансфекции в среду для культивирования клеток и убедитесь, что пипетки непосредственно в среде, избегая контакта со стенками культуральной колбе. Инкубируйте колбы при 37 ° С в 5% СО 2 увлажненном инкубаторе в течение 20-24 часов.

3. Кальций Мобилизация Анализ

  1. Соберите трансфекции клеток и семя их в 96-луночных черных стенками, четких дном пластин.
    1. Поместите PBS, PBS-трипсин-ЭДТА и переноса среды DMEM (500 мл DMEM с добавлением 10% FBS диализовалии 1% PS) при комнатной температуре полчаса заранее.
    2. Покройте 96-а черные стенками ясно нижние пластины с 60 мкл PBS с фибронектина (0,0025%) на лунку (5,85 мл PBS и 150 мкл фибронектин [0,1%] на чашку). Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 1 часа с крышкой на. Удаление раствора из лунок и инкубировали планшеты снова в течение 1 часа без крышки на при комнатной температуре. В качестве альтернативы, можно использовать предварительно покрытых пластин для повышения прикрепления клеток.
    3. Взлет старую ростовую среду от клеток и мертвых клеток промыть с 3 мл PBS и удалить PBS.
    4. Добавьте 3 мл PBS-Трипсин-ЭДТА, инкубировать 1 минуту, затем снимите решение. Примечание: морфология клеток изменяется от звездная к сфере-образную форму.
    5. Ослабьте клеток со дна колбы, осторожно нажав и собрать их путем промывки несколько раз с 10 мл DMEM среды передачи. Передача клеток в 50 мл сокола трубки.
    6. Всегоколичество клеток на мл (выполняется с NucleoCounter здесь, но камера Burker приемлем). Добавьте 100 мкл клеточной культуры в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 100 мкл буфера для лизиса и смешать, нажав на трубку. Добавить 100 мкл стабилизации буфер и смешать, нажав.
    7. Заполните NucleoCassette с клеточной суспензии и считать клетки со счетчиком. Умножить число клеток на три, как клетки разбавляли в три при добавлении лизис и стабилизации буфер на шаге 3.1.6.
    8. Развести клеток в конечной концентрации 600000 клеток / мл и семян 150 мкл клеток на лунку в покрытых пластин для получения плотности клеток приблизительно 90000 клеток на / лунку. Избегайте воздушных пузырьков и постучите по планшету для распространения клетки равномерно, чтобы получить непрерывный слой клеток. Инкубируйте пластин при 37 ° С в 5% СО 2 увлажненном инкубаторе в течение 16-24 часов.
  2. Загрузите клеток с флуоресцентным красителем и подготовить сотрудничестваmpound пластины.
    1. Подготовка сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / бычьего сывороточного альбумина (BSA) буфер: добавить 165 мкл CaCl 2 маточного раствора (1 М CaCl 2 в дистиллированной воде [дН 2 O] - хранить при комнатной температуре), 500 мкл HEPES раствор (1 М HEPES в дН 2 O, рН 7,4 - Хранить при комнатной температуре), и 0,05 г БСА до 50 мл HBSS. Следует отметить, что жирных кислот БСА используется для кальция анализов, как жирные кислоты могут активировать специфические рецепторы, ухудшая сигнал кальция рецептора, представляющего интерес.
    2. Подготовка пробенецид решение (100x, 250 мм): растворить 0,71 г пробенецида в 5 мл NaOH (1 м) и добавить 50 мкл HEPES основной раствор и 5 мл в HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA буфера - всегда готовить свежий раствор. Примечание: Пробенецидом ингибирует неорганический анион транспортеры, которые могут выбить Fluo-4 из цитоплазмы, тем самым снижая флуоресцентного сигнала. Рекомендуется выполнять загрузку красителя вприсутствии и в отсутствие пробенецид, чтобы определить, представляют ли неорганический анион транспортеры потенциальную проблему в конкретных клеточных линий под следствием, как пробенецид, возможно, даже уменьшить агонист-опосредованного сигнала.
    3. Подготовка промывочного буферного раствора: добавить 500 мкл пробенецид решения до 50 мл HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA буфера, отрегулировать рН до 7,4 и фильтрата буферный раствор. Всегда готовьте свежий буфер, и 50 мл буфера за требуется пластина.
    4. Подготовка 10% раствора Pluronic кислоты: смешать 50 мкл Pluronic кислота (20% вес / объем в диметилсульфоксиде [DMSO]) с 50 мкл DMSO - если происходит кристаллизация, тепло до 37 ° С и всегда готовить свежий раствор.
    5. Подготовка Fluo-4 решение АМ (1 мм): добавить 44 мкл раствора 10% Pluronic кислоты во флакон, который содержит 50 мкг Fluo-4 утра и вихрь, пока он полностью не растворится. Избегайте воздействия света, чтобы предотвратить обесцвечивание флуорофором.
    6. Подготовка загрузки буфера: добавить 8,8 мл DMEM supplementeг 10 мМ HEPES и 2,5 мМ пробенецида (рН 7,4) к решению Fluo-4 утра (44 мкл) и вихря. Всегда используйте свежий буфер.
    7. Отменить среды из клеток, промыть клетки с 200 мкл PBS на лунку, и удалить PBS.
    8. Добавить 55 мкл загрузочного буфера на лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Оберните пластину в алюминиевую фольгу с целью предотвращения воздействия пластины на свет.
    9. Убедитесь, чтобы высушить соединений перед экраном, если они растворены в растворителях, которые являются вредными (например, ацетонитрил) для системы сотовой экспрессии.
    10. Растворения пептиды в промывочного буфера в силиконизированных 1,5 мл микропробирок. Подготовить ряд разбавления для выполнения анализа концентрация-ответ и определить значение лиганда ЕС 50. Добавить 70 мкл лиганда в соответствующую лунку составного пластины (пластин V-образный 96-а) и включают в себя положительные (эндогенный агонист) и отрицательный контроль (промывочного буфера) на каждой пластине. Не е: Если соединение не растворяется в буфере для мытья, можно попробовать другие растворители, которые не вредны для клеток, находящихся под следствием, такие как вода или решений, которые эмульсию и растворения масла и другие нерастворимые в воде вещества (например, Kolliphor EL) .
    11. Измерьте все образцы в трех экземплярах. Имейте в виду, что 50 мкл лиганда из составного пластины будут переданы в колодец с 100 мкл промывочного буфера планшета с клетками во время анализа, так получения соединений в 3x их желаемой конечной концентрации.
    12. Откажитесь от загрузки буфера из клеточной пластинки и добавить 100 мкл моющего буфера в каждую лунку. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре и предотвратить воздействие света.
    13. Отменить промывочный буфер из клеточной пластинки и добавить 100 мкл промывочного буфера новое в каждую лунку.
    14. Инкубируйте клеточной пластинки, соединение пластины, и наконечник стойки (96-луночный, пипеток станция устройство советы) в течение 15 мин при 37 ° С.
Название "> 4. Анализ на станции устройство

  1. Создание и загрузка нужный файл протокола с программным обеспечением и активировать блок управления температурой для чтения камере. Здесь измерить ответов кальция при 37 ° С в течение 2 мин на одну строку за один раз с 1,52 сек интервала между последовательными показаниями (измерение полный 96 лунками занимает около 25 мин) при 525 нм. Установите возбуждение Fluo-4 в 488 нм и передавать общий объем 50 мкл соединения с клеточной пластинки, 18 сек после начала считывания, со скоростью дозирования, установленной на 26 мкл / сек и высотой пипетки 135 мкл.
  2. Установите соединение и клеток пластину, и кончик стойки в соответствующие ящики устройства станции.
  3. Производится одна чтения клеточной пластинки в то же возбуждения и эмиссии волны в режиме ENDPOINT, до начала фактической экрана в режиме FLEX. Примечание: Это измерение дает относительных единицах флуоресценции (РФС) значения и позволяет обнаруживать изменчивость между мыLLS пластины. Значения между 20000 и 40000 считаются приемлемыми.
  4. Запустите анализа и анализировать данные с помощью программного обеспечения.

Representative Results

Концентрация серии от 50 мкм до 0,001 нМ были проверены на всех четырех дрозофилы sNPF пептидов (Дром-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Дром-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Дром-sNPF-3: PQRLRWamide, Дром-sNPF-4: PMRLRWamide) на HEK293T клеток, которые временно экспрессируют рецептор дрозофилы sNPF и беспорядочную Gα 16 субъединицы. GPCR активировали всех четырех пептидов в конечных концентрациях до 0,1 нМ и активация рецептора зависит от концентрации. Рисунок 2 показывает графики, соответствующие одному из трех реплик концентрации серии дромо-sNPF-1. Отрицательный контроль (промывочный буфер) не вызывает флуоресцентный сигнал, в то время как положительный контроль (PAR 1 - 1 мкМ) вызывал сильную активацию эндогенных протеаз активированный рецептор-1, что приводит к высокой флуоресцентного сигнала (± 30000 РФС). Следует отметить, что отклонениеТипичная кривая может указывать аномалии. Например, непрерывный рост кривой без возврата к базовой линии может быть связано с не-рецептор-опосредованного сигналов, таких как присутствии ионофоров кальция, или нарушается липидный бислой протечки кальция.

Программное обеспечение позволяет вводе формул для определения процентного активации или стандартные ошибки в различных концентрациях и другие. Полученные данные используются для создания предварительные кривые концентрация-реакция для оценки ЕК 50 значения, как показано на четырех Дром-sNPF пептидов в рисунке 3. Кривые рисунке 3 также включают данные для отрицательного контроля, где концентрация серия пептиды Дром-sNPF были протестированы на HEK293T клеток, трансфицированных пустым вектором pcDNA3.1. Результаты показывают, что добавление пептидов с этими клетками не имеют никакого влияния на эндогенных рецепторов, но на самом деле Activели рецептор интересов. Флуоресценция на основе кальций мобилизации анализ был повторен три раза независимо. По предварительным кривых реакции на концентрацию исходного экрана, тестируемые концентрации были адаптированы для покрытия динамического диапазона кривой (рис. 4). Значения ЕС50 Дром-sNPF-1 (2,04 ± 1,48 нМ [95% доверительный интервал]), Дром-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 нМ), Дром-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 нМ) и Дром-sNPF- 4 (0,50 ± 1,01 нМ) аналогичны, указывая, что они в равной степени сильным, чтобы активировать рецептор.

Рисунок 2
Рисунок 2. Графический вывод программного обеспечения для рецептор-опосредованного флуоресценции ответ из серии концентрации. Двенадцать конечные концентрации (начиная от 50 мкм до 0,001 нМ) Oе Дром-sNPF-1 пептид испытывали на рецептор Дром-sNPF. Активация выражается в относительной флуоресцентной блока (РФС) значений. На верхнем графике приведены результаты шести высоких концентрациях и нижний график шести низких концентрациях. Положительный контроль (+) является п. 1 (1 мкМ) и отрицательный контроль (-) является промывочный буфер.

Рисунок 3
Рисунок 3. Предварительные кривые концентрация-ответ из дрозофилы sNPF пептидов, определенных одной флуоресцентной основе кальция мобилизационной анализа. Кривые концентрация-ответ рецептора Drosophila sNPF временно выражается в HEK293T клеток для четырех дрозофилы sNPF пептидов показаны синим цветом. Для отрицательных контролей (показано красным), пептиды были протестированы на HEK293TКлетки, трансфицированные пустым вектором pcDNA3.1. Флуоресцентные ответы показаны как относительно (%) до самого высокого значения (100% активации). Кривые являются результатом одном эксперименте, в котором каждая серия была измерена концентрация в трех экземплярах. Вертикальные полосы представляют стандартные ошибки среднего (SEM), которые иногда являются меньше, чем используемых символов (в этом случае, только символы изображены).

Рисунок 4
Рисунок 4. Кривые концентрация-ответ и соответствующие ЕС 50 значений дрозофилы sNPF пептидов определяется тремя независимых анализов мобилизации флуоресценции основе кальция. Кривые реагирования концентрация рецептора Drosopihla sNPF временно, выраженные в HEK293T клеток для четырех дрозофилы sNPF пептидов являются результатом из трех независимых меняasurements друг выполняется в трех экземплярах (п ≥ 9). Флуоресцентные ответы показаны как относительно (%) до самого высокого значения (100% активации). Звездочки указывают концентрации для которых п ≤ 9. Ошибки означает SEM, которые иногда меньше, чем используемых символов (в этом случае, только символы изображены). Значения ЕС 50 показаны с их 95% доверительными интервалами.

Discussion

Флуоресценция на основе кальций мобилизации анализ был успешно применен для подтверждения функциональную характеристику системы сигнализации пептидергические Drosophila sNPF, который был уже выполнены Мертенс и соавт. с биолюминесценции анализа и Фэн и др.. с электрофизиологического анализа 13,15. В ЕС 50 значения, полученные с флуоресцентного анализа в HEK293T клеток примерно в 10 раз меньше, чем полученные с биолюминесценции анализа, проведенного в клетках СНО (Дром-sNPF-1: фтор = 2,04 нМ, люми = 51 нМ; Дром-sNPF- 2: люм = 5,89 нМ, люми = 42 нМ; Дром-sNPF-3: фтор = 5,55 нМ, люми = 31 нМ; Дром-sNPF-4: фтор = 0,50 нМ, люми = 75 нМ). Эти вариации можно объяснить несколькими факторами, в том числе с тем, что один из используемых систем экспрессии может лучше подходить для функциональной экспрессии данного рецептора или сворачивание некоторых рецепторов может быть менее эффективным в Cтипы ertain клеток. EC 50 значения всех четырех дромо-sNPF пептидов находятся в диапазоне наномолярной при испытании на их рецепторов как с флуоресценции и биолюминесценции анализа, как правило, поддерживать физиологическое значение их взаимодействия пептид-рецептор в естественных условиях.

Следует отметить, что никакого контроля трансфекции с рецептором, для которого активации лиганд, как известно, не был включен в экране, представленной здесь, так как система сигнализации Drosophila sNPF, как правило, контроль трансфекции в экспериментальных установках. Положительный контроль с эндогенным лигандом HEK293T клеток (п. 1) и отрицательный контроль (промывочный буфер), были включены в экран. Результаты PAR 1 показали, что клетки были в хорошем состоянии. Отрицательный контроль (промывочный буфер) не вызывают флуоресцентный сигнал, который указывает, что среда, в которой пептиды растворяют был свободен от любых загрязнений, которые могут INFluence результаты.

Ранее характеризуется сигнальная система дрозофила sNPF был использован здесь, чтобы объяснить флуоресценции основе кальция мобилизационной анализа. С этой целью концентрации ряд активирующих лигандов были испытаны немедленно. Однако, когда сиротский рецептор доводится до повышенной экспрессией в скрининге, чтобы проверить библиотеку, содержащую сотни соединений, рекомендуется, чтобы первый экран с относительно высокими конечных концентраций лигандов (например., 10 или 1 мкМ). После обнаружения активирующего соединения, серия разбавление этого соединения могут быть подвергнуты скринингу, чтобы составить кривую концентрация-ответ и определить значение EC 50.

После активации лиганд рецептора определяется, внутриклеточный сигнальный путь может быть дополнительно исследованы путем адаптации протокола. Анализ может быть выполнен, как описано выше, но без со-трансфекции G ^5; 16 субъединицы. Когда реакция кальция измеряется, это означает, что пары рецептор, с эндогенной Gα д субъединицы системе сотовой выражение. Когда не наблюдается флуоресцентный сигнал, протоколы для измерения изменений в концентрациях других вторичных мессенджеров (например., ЦАМФ) могут быть применены.

Соотношение структура-активность (SAR) исследования также может быть осуществлена, чтобы определить основную последовательность пептида, необходимое для активации рецептора. Во-первых, усеченные последовательности оценивают, чтобы определить минимальную последовательность аминокислот пептида, который все еще способен активировать рецептор. Далее, пептиды могут быть проверены в котором систематически каждый аминокислота заменена на остатком аланина. Тестирование синтетического серию аланин-заместительной на рецептор позволяет определить важность каждого из аминокислот для активации рецептора 24,25.

Несмотря на частое использование и проверенных эффективность, то следует подчеркнуть, что анализ, описанный здесь может потребоваться некоторые приспособления, чтобы получить оптимальные результаты для специфических рецепторов, представляющих интерес. Gα 16 субъединицы имеет то преимущество, что он связывается с большинством GPCRs, но может также иметь доминантно-негативный эффект на рецепторы, которые эндогенно пара через Gα д 22. В этом случае может быть полезным, чтобы проверить различные комбинации G белков при оптимизации нового анализа кальция и сравнить результаты для Gα Q-связанных рецепторов в отсутствие или в присутствии Gα 16. Альтернативные анализы, которые не зависят от взаимодействующего белка G, чтобы обнаружить активацию рецептора также может быть выполнена, например, транслокации GFP-меченых аррестина, или выявления изменений мембранного потенциала (например., На FLIPR мембранного потенциала набора для анализа). Кроме того, Fluo-4 утра здесь используется, широкий спектр других кальция чувствительных флуорофорами, каждый со своим собственным спектрального и химикоаль свойства, доступно. Наиболее подходящий флуорофор может быть выбран на основе GPCR, типа клеток и доступной планшет-ридере, но экспериментальное подтверждение необходимо. Количества трансфицированных ДНК, а также необходимость соотношении реагент ДНК / трансфекции, которые будут определены для каждого рецептор-трансфекции комбинации реагент-клеточной линии. Наконец, следует иметь в виду, что клетки в непрерывной культуре только позволяют 20-25 используемые проходы для выполнения скрининга.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают, Foundation Фландрия исследований (FWO-Vlaanderen, Бельгия, G.0601.11) и KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. И.Б., TJ и LT выгоды от общения с FWO-Vlaanderen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA solution (0.25%) Sigma-Aldrich T4049
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) MP Biomedicals 195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose  (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Penicillin-Streptomycin (P-S) Sigma-Aldrich P4333
jetPRIME Polyplus transfection 114-01 FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies)
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Reagent A100, Lysis buffer Chemometec 910-0003
Reagent B, Stabilizing buffer Chemometec 910-0002
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H8264
Probenecid Sigma-Aldrich P8761
NaOH (1 M) Vel 2781
Pluronic acid Invitrogen P-3000MP
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Fluo-4 AM Invitrogen F14201 Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) Sigma-Aldrich Z707503 and Z707554
FlexStation device Molecular Devices NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom Greiner Bio-One 655090 Corning 96-well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates
NucleoCassette Chemometec 941-0001
NucleoCounter NC-100 Chemometec
Microcentrifuge tubes, siliconized BioCision BCS-2470
Polystyrene V-shaped 96-well plates Greiner Bio-One 651101
96-Well, FlexStation pipette tips Molecular Devices 9000-0912
Soft Max Pro software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bockaert, J., Pin, J. P. Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success. EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).
  2. Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).
  3. Drews, J. Drug discovery a historical perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).
  4. Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).
  5. Bendena, W. G. Neuropeptide physiology in insects. Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).
  6. Van Hiel, M. B., et al. Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents. Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).
  7. Tang, X. L., Wang, Y., Li, D. L., Luo, J., Liu, M. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).
  8. Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schiöth, H. B. G protein-coupled receptor deorphanizations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).
  9. Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors. Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).
  10. Brough, S. J., Shah, P. Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling. Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).
  11. Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  12. Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay. Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).
  13. Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).
  14. Lu, H. -L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. J. Vis. Exp. (50), e2732 (2011).
  15. Feng, G., et al. Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster. Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).
  16. Nässel, D. R., Wegener, C. A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling. Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).
  17. Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. Mini-review The evolution of neuropeptide signaling. Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).
  18. Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview. Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).
  19. Kozak, M. An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs). Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  20. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase. CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  21. Ral Conklin, B., et al. Carboxyl-terminal mutations of Gqα and Gsα that alter the fidelity of receptor activation. Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).
  22. Kostenis, E. Is Gα16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).
  23. Robas, N. M., Fidock, M. D. Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays. Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).
  24. Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., Gäde, G., Schoofs, L. Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors. Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).
  25. Peeters, L., et al. A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes. Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).

Tags

Клеточная биология выпуск 89 G-белком рецептор (GPCR) кальций мобилизации анализ обратный фармакологию deorphanization система сотовой выражение HEK293T Fluo-4 FlexStation
Характеристика G-белком с помощью флуоресцентной основе кальция мобилизации Пробирной
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Caers, J., Peymen, K., Suetens, N.,… More

Caers, J., Peymen, K., Suetens, N., Temmerman, L., Janssen, T., Schoofs, L., Beets, I. Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay. J. Vis. Exp. (89), e51516, doi:10.3791/51516 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter