Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Karakterisering av G-protein-koblede reseptorer ved en fluorescens-basert Kalsium Mobilisering analysen

Published: July 28, 2014 doi: 10.3791/51516
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, KU Leuven

Summary

Den her beskrevne fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse er et medium-throughput screening omvendt farmakologi system for identifikasjon av funksjonsaktiverende ligand (er) med isolerte G protein-koblede reseptorer (GPCR).

Abstract

For mer enn 20 år, har omvendt farmakologi vært den ledende strategi for å oppdage de aktive ligander av foreldreløs G protein-koblede reseptorer (GPCR). Utbruddet av en omvendt farmakologi analysen er kloning og påfølgende transfeksjon av en GPCR av interesse i et mobiltelefon uttrykk system. Det heterologe uttrykt reseptoren blir deretter utfordret med en forbindelse bibliotek av kandidatligandene for å identifisere den reseptor-aktiverende ligand (er). Reseptor Aktivering kan vurderes ved måling av endringer i konsentrasjonen av andre messenger reporter molekyler, som kalsium-eller cAMP. Den fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse som beskrives her er en ofte brukt medium-throughput revers farmakologi assay. Den foreldreløse GPCR er forbigående uttrykt i humane embryonale nyre 293T (HEK293T) celler og en promiskuøs Gα 16 konstruere er kotransfiseres. Etter ligand binding, aktivering av Gα 16 subenheten induserer frigjøring av kalsium fROM det endoplasmatiske retikulum. Før ligand screening, blir reseptor-uttrykkende celler lastet med en fluorescerende kalsiumindikator, Fluo-4-acetoksymetyl. Det fluorescerende signalet fra Fluo-4 er ubetydelig i cellene under hvilebetingelser, men kan forsterkes mer enn en 100-ganger på interaksjon med kalsiumioner som frigjøres etter reseptoraktivering. Den beskrevne teknikk ikke krever tidkrevende etablering av stabilt transfekterte cellelinjer der transfekterte genetiske materiale blir integrert i vertscellens genom. I stedet forbigående transfeksjon, genererer midlertidige ekspresjon av målgenet, er tilstrekkelig til å utføre screening-analyse. Oppsettet gir middels-throughput screening av hundrevis av forbindelser. Co-transfeksjon av promiskuøs Gα 16, som par til de fleste GPCR, kan den intracellulære signalveien for å bli omdirigert mot frigjøring av kalsium, uavhengig av den opprinnelige signalveien i endogen settninger. De HEK293T celler er lett å håndtere og har bevist sin effekt i hele år i reseptor deorphanization analyser. Imidlertid kan optimaliseringen av analysen for spesifikke reseptorer være nødvendig.

Introduction

G protein-koblede reseptorer (GPCR) utgjør en av de største og mest mangfoldige familier blant alle celleoverflateproteiner. Deres tilstedeværelse i virveldyr, virvelløse dyr, planter, gjær og mugg, slim så vel som i protozoer og den tidligste diploblastic metazoa indikerer at GPCR er blant de eldste molekyler knyttet til signaltransduksjon 1.. Deres naturlige aktive ligander omfatter et bredt mangfold av eksterne stimuli inkludert peptider, biogene aminer, dufter, glykoproteiner, og fotoner to. Som sådan er disse reseptor-ligand-signalsystemer er involvert i mange forskjellige fysiologiske prosesser. Den brede funksjonelle spektrum gjør dem ideelt egnet for utvikling av terapeutiske medikamenter som dekker et bredt spekter av humane sykdommer. Om 50-60% av dagens narkotika mål er representert ved GPCRs 3,4. Foruten sin store betydning i den farmasøytiske industrien, GPCRs er også i søkelyset for utvikling av enny generasjon av artsspesifikke insekt 5,6 og plantevernmidler generelt. Fordi de naturlige ligander av mange GPCRs er fortsatt uidentifisert, klassifiseres de som foreldreløs GPCRs. Den deorphanization av disse reseptorene vil bedre forståelsen av deres fysiologiske roller i organismer og kan avdekke antatte mål for nye stoffet applikasjoner 7.

Siden den genomiske era, er det motsatte farmakologi strategi mye brukt for deorphanization av GPCR åtte. Denne metode innebærer at en orphan reseptorer er brukt som en "krok" til "fisk ut 'sin aktiverende ligand i et biologisk ekstrakt eller fra et bibliotek av syntetiske forbindelser. Den GPCR av interesse er derfor klonet og deretter transfektert i et mobiltelefon ekspresjonssystem. I de mest brukte metoder er reseptoraktivering bestemmes ved måling av endringer i konsentrasjonen av andre messenger molekyler 9 (f.eks, aequorin) 10 eller fluorescerende kalsium indikatorer (f.eks Fluo-4) 11. Den fluorescens-baserte analyser, hvori reseptor-uttrykkende celler blir lastet med en fluorescerende kalsiumindikator før ligand screening, har den fordel at de tillater high-throughput screening fordi de er enkle å bruke, kortlese tid, og fleksibiliteten til screening flere foreldreløse reseptorer på en enkelt plate 12.

Her blir fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse grundig beskrevet og illustrert ved deorphanization prosessen av Drosophila melanogaster korte nevropeptid K (sNPF) reseptoren. Denne neuropeptidergic signalsystem ble opprinnelig karakterisert ved Mertens et al. i 2002 13 med en kalsium Bioluminescens analysen utført i kinesisk hamster eggstokk (CHO)14 og etter Feng et al. I 2003 med en elektrofysiologisk analyse ved hjelp Xenopus oocytter 15. Tilstedeværelsen av sNPF signaleringssystem ser ut til å være begrenset til rekken av Arthropoda, hvor det er innblandet i en rekke prosesser, inkludert regulering av foring, vekst, stressreaksjoner, bevegelse, og døgnrytme 16.

Forskning på neuropeptidergic signalanlegg i insekter kan ikke bare føre til nye mål for utvikling av insektmidler, men kjennskap til deres virkemåte kan også bli ekstrapolert til andre organismer så mange signalsystemer er generelt godt konservert gjennom evolusjon 17.. I det siste tiåret, har store fremskritt er gjort i deorphanization prosessen med insekt neuropeptidreseptorer GPCR. Til tross for disse tiltakene, har bare et lite antall reseptorer blitt matchet til deres beslektet ligand, og massevis av sekvensinformasjon fornye foreldreløs GPCRs har blitt tilgjengelig på grunn av den blomstrende av genomikk 18. Tilgjengeligheten av middels / høy throughput screening tilnærminger, som fluorescens-basert kalsium mobilisering analysen som har vist seg å være en mye brukt teknikk 9,18, er derfor uvurderlig.

Den fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse som beskrevet her blir utført i den humane embryonale nyre 293T (HEK293T) cellelinje, og benytter et fluorescerende probe for å bestemme endringer i den intracellulære kalsiumkonsentrasjon ved reseptor-aktivering. For å sikre høy ekspresjon og oversettelses nivåer av reseptoren, en Kozak konsensussekvens 19 tilsatt til 5'-enden av den reseptor-kodende sekvens, som deretter klonet i en ekspresjonsvektor (for eksempel vektor pcDNA serie for pattedyr-cellelinjer). Ettersom det er vanskelig å forutsi den endogene G protein-kopling av en foreldreløse GPCR basert på sekvensinformasjonalene, de andre messenger molekyler (f.eks, kalsium eller camp) som er modulert etter reseptoraktivering ofte forblir ukjent før ligand identifikasjon. For å omgå dette problemet, promiskuøse G proteiner i G q familien (f.eks murine Gα 15 eller menneskelig Gα 16 [brukt her]) eller chimere G proteiner (f.eks, Gα qi5) som samhandler med de fleste GPCRs og indusere frigjøring av kalsium kan være co-uttrykt 20,21,22. Ved binding av ligand til dens reseptor, gjennomgår GPCR en konformasjonsendring som fører til aktivering av spesifikke intracellulære baner. Den guanosine diphosphate (BNP) molekyl, forpliktet i henhold til hvile på, til Gα 16 subenheten, vil bli erstattet av en guanosine trifosfat (GTP) molekyl. Dette frembringer en dissosiasjon av heterotrimeric G protein i en Gα 16 og Gβγ subenhet. Den Gα 16 subenheten aktiverer fosfolipase C &# 946; (PLCβ), som i sin tur hydrolyserer membran-bundet fosfatidylinositol bisfosfat (PIP 2) som resulterer i diacylglycerol (DAG) og inositol Trisphosphate (IP 3). IP 3 vil spre seg over hele cytoplasmaet og aktiverer IP 3-avhengige kalsiumkanaler tilstede i membranen av det endoplasmatiske retikulum, som induserer frigjøring av kalsium inn i cytoplasmaet.

Den kalsium-frigjøring ved reseptor aktivering skjer i løpet av sekunder, og kan bli detektert ved å laste celler før screening-analyse med et kalsiumsensitivt fargestoff, som Fluo-4-acetoksymetyl (AM) 11. Den AM ester-gruppen kan fluoroforen for å krysse cellemembranen og spaltes av ved cytoplasmatiske esteraser Inne i cellen. Følgelig er de negative ladninger av den fluorescerende fargestoff avslørt, og hindrer den fra å spre ut av cellen og slik at det å samhandle med kalsiumioner. Fluorescenssignalet of Fluo-4 er ubetydelig i celler under hvile på, bare inneholder kalsiumkonsentrasjonen i nanomolarområdet. Imidlertid, når kalsium er sluppet på reseptoraktivering, kan signalet øke konsentrasjonen avhengig til mer enn 100-ganger herved sikre et stort signal-til-støy-forhold. Fluo-4 oppviser dessuten et stort dynamisk område for rapportering [kalsium] rundt en K d (kalsium) på 345 nM, som gjør det egnet til å måle fysiologisk relevante kalsium endringer i et bredt spekter av celler. Den magnetisering av Fluo-4 skjer ved 488 nm og emisjon fluorescens måles ved 525 nm 11. Fluorimeters som fluorescens avbildningsplateleser (FLIPR) 23, Novostars eller FlexStation (stasjonsenhet) 12 er middels / høy gjennomstrømming systemer som tillater simultan forbindelsen tilsetningen og deteksjonen av den Fluo-4-signal ved reseptoraktivering for hver godt i en prøve-plate. Den kalsium mobiliseringsanalyse som beskrives her er avhengig av stasjonenEnheten 96-brønns mikroplate-systemet.

Den SoftMax Pro (software) blir brukt til å betjene stasjonen enheten samt for dataanalyse. Programmet viser umiddelbart resultater som grafer i 96-brønners format. Flere brønner kan velges samtidig for å sammenligne resultatet av disse brønner på den samme grafen. Verdier av brønner i hver kolonne Den relative fluorescerende enhet (RFU) blir samtidig målt i et tidsrom på to minutter, med start før tilsetning av forbindelsene til brønnene og fortsetter etter måling av det fluorescerende signal etter reseptoraktivering. Vanligvis, utviklingen av en agonist kurve er på linje med grunnlinjen til en aktiverende forbindelse ble tilsatt til cellene, noe som resulterer i en rask økning av det fluorescerende signal. Den topphøyde er korrelert med den endelige agonist-konsentrasjon i brønnen. Etter toppen faller fluorescenssignalet sakte mot baseline nivå. RFU målinger can bli omdannet til konsentrasjons-responskurver for å bestemme EC50-verdi (halv maksimal effektiv konsentrasjon) av en ligand. Generelt er i det minste tre uavhengige skjermer, hver med tre kopier av en konsentrasjonsserie, bør utføres for å sette sammen en pålitelig konsentrasjon-respons-kurve.

Det anbefales å inkludere flere positive og negative kontroller i eksperimentell design. Først av alt, en transfeksjon kontroll, det vil si innføringen av en reseptor med en kjent ligand, bør testes. Dette gjør det mulig å verifisere om transfeksjon agent var i drift. Innlemmelse av en kontrolleksperiment med en agonist for en endogen reseptor på cellelinjen, og en negativ kontroll (for eksempel vaskebuffer) er også anbefalt for å overvåke tilstanden og levedyktighet av cellene og for å utelukke muligheten for at vaskebufferen var forurenset med en faktor som kan lokke fram en auto-fluorescerende Whiteduft respons. Ofte brukte agonister er et peptid avledet fra protease-reseptor-1 (par 1), som fungerer som en PAR en selektiv agonist eller carbachol, som aktiverer den acetylcholin-reseptoren. Celler transfektert med tom ekspresjonsvektor bør også testes for å utelukke at aktive forbindelser kommuniserer med cellens endogene reseptorer. Optimalisering av flere parametere som er beskrevet i protokollen nedenfor, kan være nødvendig for ulike signalsystemer. En skjematisk figur av den komp fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse er vist i figur 1.

Figur 1
Figur 1. Generelle ordningen med fluorescens-basert kalsium mobilisering analysen. Automatisert væskehåndtering og samtidig fluorescens målinger er utført med stasjonenenhetsmikroplateleser, drevet av programvaren. Stasjonen enheten inneholder tre skuffer: en for cellen plate, sammensatte plate og tips rack. Den innebygde Pipetteenhet overføringer forbindelser fra én kolonne med det sammensatte plate til den tilsvarende kolonnen av cellene plate (trinn 1). Hver brønn av celleplate har et monosjikt av HEK293T celler som har blitt co-transfektert med GPCR av interesse og promiskuøse Gα 16 subenheten. Når en forbindelse som aktiverer reseptoren, er Gα 16-bundet GDP erstattet med GTP. Den Gα 16 subenheten deretter spaltes fra det Gβγ kompleks og aktiverer fosfolipase Cβ (PLCβ), som i sin tur hydrolyserer fosfatidylinositol bisfosfat (PIP 2) som resulterer i diacylglycerol (DAG) og inositol Trisphosphate (IP 3). IP 3 aktiverer IP 3-avhengige kalsiumkanaler tilstede i membranen av det endoplasmatiske retikulum, indusere frigjøring av kalsium into cytoplasma. Interaksjonen av kalsium med Fluo-4 (med hvilke cellene er lastet før sammensatte tillegg) resulterer i et fluorescerende signal (trinn 2). Programvaren presenterer resultatene som relative fluorescerende enhet (RFU)-verdier i funksjon av tiden, og topphøyder korrelerer med ligandkonsentrasjonen på en konsentrasjonsavhengig måte. Disse dataene kan deretter bli omdannet til en konsentrasjon-respons-kurve for å bestemme EC50 verdien av en ligand-reseptor-par (trinn 3).

Protocol

Bemerk: Alle handlinger hvor celler er forbundet med dette skal utføres i et sterilt miljø ved å arbeide i en laminær strømning.

En. Vedlikehold av HEK293T Cell Linje

  1. Dyrk de HEK293T celler i en T-75 kolbe ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
  2. Passage cellene når en sammenfletting av 80% er nådd. Merk: Dette tar vanligvis 3 til 4 dager. Celler i kontinuerlig kultur tillate 20-25 brukbare passasjer for screening.
    1. Plasser Dulbeccos fosfatbufret saltvann (PBS) uten kalsium-klorid og magnesiumklorid, PBS-trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (500 ml PBS supplert med 10 ml trypsin-EDTA-oppløsning og 4,5 ml 4% EDTA) og vekstmedium (500 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium - høy glukose [DMEM] supplert med 10% føtalt bovint serum [FBS] og 1 mM penicillin-streptomycin [PS]) ved romtemperatur i en halv time på forhånd.
    2. Fjernden gamle vekstmedium fra cellene. Skyll av døde celler med 3 ml PBS og fjern PBS igjen.
    3. Tilsett 3 ml PBS-trypsin-EDTA, inkuberes i 1 min ved romtemperatur og fjern løsning Merk: morfologien av cellene vil endre seg fra stjerne-formet til å sfære-formet.
    4. Løsne cellene fra bunnen av kolben ved forsiktig tapping og samle cellene ved å skylle de nedre flere ganger med 10 ml friskt vekstmedium.
    5. Overføring 1 ml av cellekulturen i en ny T-75 kolbe inneholdende 14 ml friskt vekstmedium og inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.

2. Forbigående Transfection av HEK293T Cells

  1. Dyrk de HEK293T celler i en T-75 kolbe 3 dager før den faktiske kalsium mobiliseringsanalyse finner sted. Sørg for å bruke tre T-75 kolber, en for transfeksjon med reseptoren konstruere, en for transfeksjon med et tomt uttrykk vektor, som negativ kontroll, og one for transfeksjon kontroll. Merk: aging av cellene blir utført som beskrevet i trinn 1.2. Når flere 96-brønners plater må være skjermet, kan T-150 kolber brukes for å få en høyere avkastning av celler (for å gjøre dette, doble alle børsnoterte mengder i trinn 1.2.5, 2.3, 3.1.3 og 3.1.4) .
  2. Inkuber kolber ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 20-24 timer inntil cellekulturer nærmer 50-70% sammenløp.
  3. Co-transfektere en populasjon av celler med ekspresjonsvektor som koder for GPCR av interesse og Gα 16 konstrukt, den andre kolben med den tomme vektoren og Gα 16 konstruksjon, og den tredje med transfeksjon kontrollen og Gα 16 konstruktet. Merk: I denne protokollen, ble Drosophila sNPF reseptor klonet i en pcDNA3.1 pattedyr uttrykk vektor 13. JetPRIME ble brukt til å utføre transfeksjon, men andre transfeksjon reagenser kan anvendes i tillegg.
    1. Legg påotal på 7,8 ug DNA (3,9 ug reseptor konstrukt eller tom vektor, og 3,9 ug Gα 16 ekspresjon construct) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett 500 pl av den JetPRIME buffer. Bland godt ved å virvle røret, og spinne ned kort tid.
    2. Legg 37,5 mL av JetPRIME reagens, Vortex og spinne ned i 1 min på 14 000 x g. Inkuber transfeksjon blandingen 10 minutter ved romtemperatur.
    3. Tilsett transfeksjon blandingen dråpevis til cellekulturmediet, og sørge for å pipettere direkte inn i mediet unngå kontakt med veggene i kulturkolben. Inkuber kolber ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 20-24 timer.

Tre. Kalsium Mobilisering Assay

  1. Samle de transfekterte cellene og frø dem i 96-brønners sorte vegger, klare bunn plater.
    1. Plasser PBS, PBS-Trypsin-EDTA og DMEM overføringsmedium (500 ml DMEM supplert med 10% dialysert FBSog 1% PS) ved romtemperatur i en halv time på forhånd.
    2. Coat 96-brønns sorte vegger, klare bunnplater med 60 mL PBS med fibronectin (0,0025%) per brønn (5,85 ml PBS og 150 mL fibronek [0,1%] per plate). Inkuber platene ved romtemperatur i 1 time med lokket på. Ta løsningen fra brønnene og inkuberes platene på nytt i 1 time uten lokk på ved romtemperatur. Alternativt er det mulig å anvende pre-belagte plater for forbedret cellebinding.
    3. Ta av den gamle vekstmedium fra cellene og skyll døde celler av med 3 ml PBS og fjern PBS.
    4. Tilsett 3 ml PBS-Trypsin-EDTA, inkuberes i 1 min, deretter fjerne den løsningen. Merk: Morfologi av cellene endres fra stjerne-formet til å sfære-formet.
    5. Løsne cellene fra bunnen av kolben ved forsiktig tapping og samle dem ved skylling flere ganger med 10 ml DMEM overføringsmedium. Overfør cellene i et 50 ml Falcon-røret.
    6. TelleAntall celler per ml (utført med en NucleoCounter her, men et Burker kammer er akseptabelt). Tilsett 100 ul av cellekultur i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 100 mL lysis buffer og bland ved å banke røret. Tilsett 100 mL stabiliserende buffer og bland ved å trykke.
    7. Fyll en NucleoCassette med cellesuspensjonen og telle celler med disken. Doble antallet celler etter tre, som cellene ble fortynnet med en faktor på tre da tilsetning av lysis og stabiliserende buffer i trinn 3.1.6.
    8. Fortynn cellene til en sluttkonsentrasjon på 600 000 celler / ml og frø 150 pl av de celler per brønn i de belagte platene til å oppnå en celletetthet på omtrent 90 000 celler pr / brønn. Unngå luftbobler, og slå platen til å spre cellene jevnt for å få et sammenhengende cellelaget. Inkuber platene ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 16-24 timer.
  2. Laste cellene med fluorescerende fargestoff og forberede compound plate.
    1. Forbered Hanks balanserte saltløsning (HBSS) / HEPES / Ca 2 + / bovin serum albumin (BSA) buffer: legge 165 mL CaCl 2 stamløsning (1 M CaCl 2 i destillert vann [dH 2 O] - butikken ved romtemperatur), 500 mL HEPES stamløsning (1 M HEPES i dH 2 O, pH 7,4 - butikken ved romtemperatur), og 0,05 g BSA til 50 ml HBSS. Legg merke til at fettsyrefritt BSA anvendes for kalsium-analyser, som fettsyrer kan aktivere spesifikke reseptorer, svekke kalsiumsignalet fra reseptoren av interesse.
    2. Forbered probenecid løsning (100x, 250 mM) oppløses 0,71 g probenecid i 5 ml NaOH (1 M) og tilsett 50 pl HEPES lagerløsning og 5 ml av HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA buffer - alltid forberede frisk løsning. Merk: Probenecid hemmer uorganisk anion transportører som kan løsne Fluo-4 fra cytoplasma, og dermed redusere det fluorescerende signal. Det anbefales å utføre fargestoff lasting inærvær og fravær av probenecid for å bestemme om uorganiske anion transportører presentere et potensielt problem i den bestemte cellelinjer i henhold til undersøkelse, som probenecid kan til og med redusere den agonist-mediert signal.
    3. Forbered vaskebuffer: Tilsett 500 ul probenecid løsning til 50 ml HBSS / HEPES / Ca 2 + / BSA buffer, justere pH til 7,4, og filtratet bufferoppløsningen. Alltid forberede frisk buffer, og 50 ml buffer per plate er nødvendig.
    4. Forbered 10% pluronic syreoppløsning: bland 50 ul pluronic syre (20% w / v i dimetyl-sulfoksyd [DMSO]) med 50 pl DMSO - Hvis krystallisering inntreffer, varme til 37 ° C og alltid klar frisk løsning.
    5. Forbered Fluo-4 AM løsning (1mm): legg til 44 mL 10% pluronic syre løsning på et hetteglass som inneholder 50 mikrogram Fluo-4 AM og vortex til den er helt oppløst. Unngå eksponering for lys for å hindre bleking av fluoroforen.
    6. Forbered lasting buffer: legg 8,8 ml DMEM supplemented med 10 mM HEPES og 2,5 mM probenecid (pH 7,4) til Fluo-4 AM-oppløsning (44 mL) og vortex. Bruk alltid frisk buffer.
    7. Kast medium fra cellene, vaskes cellene med 200 ul PBS per brønn, og fjerne PBS.
    8. Legg 55 mL lasting buffer per brønn og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Pakk platen inn i aluminiumsfolie for å hindre eksponering av platen til å lyse.
    9. Sørge for å tørke forbindelsene før skjermen hvis de er oppløst i oppløsningsmidler som er skadelig (f.eks acetonitril) for den cellulære ekspresjonssystem.
    10. Oppløse peptider i vaskebuffer i silikonisert 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilbered en fortynning serie for å utføre en konsentrasjon-respons-analyse og for å bestemme EC50 verdien av en ligand. Legg 70 pl av liganden i den tilsvarende brønn av det sammensatte plate (V-formede 96-brønners plater) og omfatter en positiv (endogen agonist) og negative kontroller (vaskebuffer) på hver plate. Ikke e: Hvis en forbindelse er ikke oppløselig i vaskebufferen, kan man forsøke andre løsningsmidler som ikke er skadelig for cellene under undersøkelse, for eksempel vann eller løsninger som emulgere og oppløseliggjøre oljer og andre vann-uoppløselige stoffer (f.eks Kolliphor EL) .
    11. Mål alle prøver i triplikat. Husk at 50 pl av en ligand fra det sammensatte plate blir overført inn i en brønn med 100 ul vaskebuffer av celleplaten under analysen, så fremstille forbindelsene med 3 x den ønskede sluttkonsentrasjon.
    12. Kast lastebuffer fra celleplaten og tilsett 100 ul vaskebuffer til hver brønn. Inkuber platen i 15 min ved romtemperatur og hindre eksponering for lys.
    13. Kast vaskebufferen fra celleplaten og tilsett 100 ul ny vaskebuffer til hver brønn.
    14. Inkuber celleplaten, sammensatt plate, og en spiss stativ (96-vel, stasjonsenhet pipettespisser) i 15 min ved 37 ° C.
Tittelen "> 4. analysen på Station Device

  1. Lag og laste ønsket protokoll filen med programvaren og aktivere temperaturstyringsenhet for lesing kammeret. Her måler kalsiumrespons ved 37 ° C i 2 min én rad av gangen med 1,52 sek intervallet mellom suksessive målinger (måling av en komplett 96-brønns plate tar omtrent 25 min) ved 525 nm. Sett eksitasjon av Fluo-4 til 488 nm, og overføre et totalvolum på 50 pl av forbindelsen til celleplaten, 18 sek etter at lese start, med dispenseringshastigheten satt til 26 pl / sek og en pipette høyde på 135 pl.
  2. Plasser sammensatte og celle plate, og spissen rack i de aktuelle skuffene i stasjonen enheten.
  3. Utfør en enkelt lest av celleplaten ved samme eksitering og emisjonsbølgelengde på ENDPOINT modus, før selve skjermen i FLEX modus. Merk: Denne målingen gir relativ fluorescens enhet verdier (RFU) og kan oppdage variasjon mellom vills av platen. Verdier mellom 20 000 og 40 000 er regnet som akseptabelt.
  4. Start-analysen og analysere data med programvaren.

Representative Results

Konsentrasjon serien spenner fra 50 mikrometer til 0,001 nM ble testet for alle fire Drosophila sNPF peptider (Drome-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide) på HEK293T celler som forbigående uttrykker Drosophila sNPF reseptoren og den promiskuøse Gα 16 subenheten. Den GPCR ble aktivert ved alle fire peptider i sluttkonsentrasjoner på opptil 0,1 nM, og reseptor-aktivering var konsentrasjonsavhengig. Figur 2 viser grafer som tilsvarer en av tre kopier av Drome-sNPF-1 konsentrasjon serie. Den negative kontroll (vaske-buffer) induserte ikke en fluoriserende signal, mens den positive kontroll (PAR 1-1 uM) fremkalte sterk aktivering av den endogene protease-reseptor-1, noe som fører til en høy fluorescerende signal (± 30.000 RFU). Det bør bemerkes at et avvik påden typiske kurven kan indikere misdannelser. For eksempel kan en kontinuerlig økning av kurven uten å gå tilbake til grunnlinjen være relatert til ikke-reseptor-medierte signaler, som for eksempel nærvær av kalsium ionophores, eller en avbrutt lipidbilag som forårsaker kalsium lekkasjer.

Programmet gjør det mulig å skrive inn formler for å bestemme prosentandelen av aktivering eller standardfeilene for de forskjellige konsentrasjoner blant andre. De resulterende data brukes til å skrive innledende konsentrasjon-responskurvene for å beregne EC50-verdier, slik det er vist for de fire Drome-sNPF peptider i figur 3.. Kurvene på figur 3 omfatter også dataene for den negative kontrollen der konsentrasjonen serie de Drome-sNPF peptider ble testet på HEK293T celler transfektert med en tom pcDNA3.1 vektor. Resultatene viser at tilsetningen av peptidene til disse cellene har ingen effekt på endogene reseptorer, men faktisk activspiste reseptoren av interesse. Den fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse ble deretter gjentatt tre ganger, uavhengig av hverandre. Basert på de innledende konsentrasjon-respons kurver av den første skjerm, ble de testede konsentrasjoner tilpasset til å dekke den dynamiske rekkevidden til kurven (figur 4). De EC50 verdier av Drome-sNPF-1 (2.04 ± 1.48 nM [95% konfidensintervall]), Drome-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drome-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) og Drome-sNPF- 4 (0.50 ± 1.01 nM) er like, noe som indikerer at de er like potent til å aktivere reseptoren.

Fig. 2
Figur 2. Grafisk utdata av programvaren for en reseptor-mediert fluorescens respons av en konsentrasjonsserie. Tolv sluttkonsentrasjoner (som strekker seg fra 50 uM til 0,001 nM) of Drome-sNPF-en peptid ble testet på Drome-sNPF reseptoren. Aktivering er uttrykt i relativ fluorescerende enhet verdier (RFU). Den øvre graf gir resultatene av de seks høyeste konsentrasjoner og den nedre graf av seks laveste konsentrasjoner. Den positive kontroll (+) er PAR 1 (1 mM) og den negative kontroll (-) er vaskebuffer.

Figur 3
Fig. 3. Innledende konsentrasjon-respons kurver av Drosophila sNPF peptider bestemmes ved et enkelt fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse. Konsentrasjon-respons-kurver av Drosophila sNPF reseptor forbigående uttrykt i HEK293T celler for de fire Drosophila sNPF peptider er vist i blått. For de negative kontroller (vist i rødt), ble peptider testet på HEK293Tceller transfektert med tom vektor pcDNA3.1. De fluorescerende responser er vist som relativ (%) til den høyeste verdi (100% aktivering). Kurvene er resultatet av et eksperiment hvor hvert konsentrasjonsserie ble målt in triplo. De vertikale linjene representerer standardfeil til gjennomsnittet (SEM), som noen ganger er mindre enn de brukte symboler (i så fall, er bare symbolene avbildet).

Figur 4
Fig. 4. Konsentrasjon-responskurver og tilsvarende EC 50 verdier av Drosophila sNPF peptider bestemt ved tre uavhengige fluorescens-baserte kalsium mobiliserings assays. De konsentrasjons-responskurver ved Drosopihla sNPF reseptor forbigående uttrykt i HEK293T celler for de fire Drosophila sNPF peptider er resultatet av tre uavhengige megasurements hver utført i triplikat (n ≥ 9). De fluorescerende responser er vist som relativ (%) til den høyeste verdi (100% aktivering). Stjernene viser konsentrasjoner som n ≤ 9. Feilfelt angir SEM, som noen ganger er mindre enn de brukte symboler (i så fall, er bare symbolene avbildet). EC 50-verdier er vist med sine 95% konfidensintervall.

Discussion

Den fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse ble med hell anvendt for å bekrefte den funksjonelle karakterisering av Drosophila sNPF peptidergic signalsystem, som allerede er utført av Mertens et al. med en bioluminescens-analyse og ved Feng et al. med en elektrofysiologisk analyse 13,15. De EC 50-verdier oppnådd med fluorescens analysen i HEK293T celler er ca 10 ganger mindre enn de som oppnås med Bioluminescens analysen utført i CHO celler (Drome-sNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM, Drome-sNPF- 2: fluo = 5,89 nM, lumi = 42 nM, Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM, Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Disse variasjoner kan forklares av flere faktorer, inkludert det faktum at en av de som benyttes ekspresjonssystemer kan være bedre egnet for funksjonell ekspresjon av en gitt reseptor, eller folding av noen reseptorer kan være mindre effektive i certain celletyper. De EC 50 verdier av alle fire Drome-sNPF peptider er i nanomolarområdet når testet på deres reseptoren med både fluorescens og Bioluminescens analysen, generelt støtter fysiologiske betydningen av deres peptid-reseptor interaksjon in vivo.

Legg merke til at ingen transfeksjon kontroll med en reseptor som den aktiverende ligand er kjent var inkludert i skjermen er presentert her, siden Drosophila sNPF signaleringssystem er normalt transfeksjon kontroll i forsøksoppsett. Den positive kontrollen med en endogen ligand av HEK293T celler (PAR 1) og den negative kontroll (vaskebuffer) ble inkludert i skjermen. Resultatene av PAR 1 viste at cellene var i god stand. Den negative kontroll (vaske-buffer) ikke fremkalle et fluorescerende signal, noe som indikerer at det medium hvori peptidene oppløses var fri for forurensninger som kunne Influence resultatene.

Den tidligere karakterisert Drosophila sNPF signalsystem ble brukt her for å forklare fluorescens-baserte kalsium mobiliseringsanalyse. For dette formålet ble konsentrasjonsserie av de aktiverende ligander testet umiddelbart. Når imidlertid et orphan reseptorer er brakt til overekspresjon i en screening-test for å teste et bibliotek inneholdende flere hundre forbindelser, anbefales det først å skjerm med forholdsvis høye sluttkonsentrasjon av ligandene (f.eks., 10 eller 1 uM). Etter påvisning av en aktiverende forbindelse, kan en fortynningsserie av denne forbindelse være skjermet for å komponere en konsentrasjon-respons-kurve, og for å bestemme EC50 verdien.

Når den aktiverende ligand av en reseptor som er bestemt, kan den intracellulære signalveien bli ytterligere undersøkt ved å tilpasse protokollen. Analysen kan bli utført som beskrevet ovenfor, men uten ko-transfeksjon av G ^5, 16 underenhet. Når en kalsiumrespons blir målt, så betyr det at reseptoren par med en endogen Gα q subenheten av det cellulære ekspresjonssystem. Når ingen fluorescerende signal er observert, kan protokoller for å måle endringer i konsentrasjoner av andre sekundære budbringere (f.eks., CAMP) brukes.

Structure-activity relationship (SAR-studier) kan også utføres for å definere peptid kjernesekvens som kreves for reseptoraktivering. Først blir avkortede sekvenser vurderes for å definere den minimale aminosyresekvensen til peptidet som fortsatt er i stand til å aktivere reseptoren. Deretter kan peptider bli testet hvori systematisk hver aminosyre er blitt erstattet med en alanin-rest. Testing syntetisk alanin-substitusjon serie på reseptoren gjør det mulig å fastslå betydningen av hver av aminosyrene for reseptoraktivering 24,25.

Til tross for sin hyppige bruk og påviste effekcacy, må det understrekes at analysen beskrevet her kan trenge noen tilpasninger for å få optimale resultater for spesifikke reseptorer av interesse. Den Gα 16 subenheten har den fordel at det binder til de fleste GPCR, men kan også ha en dominant-negativ effekt på reseptorene som endogent par via Gα q 22. I dette tilfelle kan det være nyttig for å teste forskjellige kombinasjoner av G-proteiner under optimalisering av en ny kalsium assay og for å sammenligne resultatene for Gα Q-koblede reseptorer i fravær eller nærvær av Gα 16.. Alternative analyser som er uavhengige av den G-protein interaksjon for å detektere aktivering av reseptoren kan også utføres, slik som translokasjon av GFP-merket arrestin, eller deteksjon av endringer i membranpotensial (f.eks., Ved FLIPR Membrane Potential Assay Kit). Foruten Fluo-4 AM brukt her, et bredt spekter av andre kalsium-sensitive fluorophores, hver med sin egen spektral og chemical egenskaper, er tilgjengelig. Den mest hensiktsmessige fluoroforen kan velges basert på den GPCR, celletypen og den tilgjengelige plate-leser, men eksperimentell verifisering er nødvendig. Mengdene av transfektert DNA og DNA / transfeksjon reagens-forhold må bestemmes for hver reseptor-transfeksjon reagens-cellelinje kombinasjon. Til slutt bør det tas i betraktning at celler i kontinuerlig kultur bare tillate 20-25 brukbare passasjer å utføre screening-analyser.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner Research Foundation Flandern (FWO-Vlaanderen, Belgium, G.0601.11) og KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ og LT dra nytte av et fellesskap fra FWO-Vlaanderen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA solution (0.25%) Sigma-Aldrich T4049
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) MP Biomedicals 195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose  (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Penicillin-Streptomycin (P-S) Sigma-Aldrich P4333
jetPRIME Polyplus transfection 114-01 FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies)
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Reagent A100, Lysis buffer Chemometec 910-0003
Reagent B, Stabilizing buffer Chemometec 910-0002
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H8264
Probenecid Sigma-Aldrich P8761
NaOH (1 M) Vel 2781
Pluronic acid Invitrogen P-3000MP
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Fluo-4 AM Invitrogen F14201 Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) Sigma-Aldrich Z707503 and Z707554
FlexStation device Molecular Devices NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom Greiner Bio-One 655090 Corning 96-well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates
NucleoCassette Chemometec 941-0001
NucleoCounter NC-100 Chemometec
Microcentrifuge tubes, siliconized BioCision BCS-2470
Polystyrene V-shaped 96-well plates Greiner Bio-One 651101
96-Well, FlexStation pipette tips Molecular Devices 9000-0912
Soft Max Pro software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bockaert, J., Pin, J. P. Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success. EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).
  2. Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).
  3. Drews, J. Drug discovery a historical perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).
  4. Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).
  5. Bendena, W. G. Neuropeptide physiology in insects. Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).
  6. Van Hiel, M. B., et al. Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents. Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).
  7. Tang, X. L., Wang, Y., Li, D. L., Luo, J., Liu, M. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).
  8. Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schiöth, H. B. G protein-coupled receptor deorphanizations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).
  9. Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors. Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).
  10. Brough, S. J., Shah, P. Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling. Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).
  11. Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  12. Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay. Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).
  13. Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).
  14. Lu, H. -L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. J. Vis. Exp. (50), e2732 (2011).
  15. Feng, G., et al. Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster. Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).
  16. Nässel, D. R., Wegener, C. A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling. Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).
  17. Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. Mini-review The evolution of neuropeptide signaling. Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).
  18. Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview. Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).
  19. Kozak, M. An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs). Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  20. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase. CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  21. Ral Conklin, B., et al. Carboxyl-terminal mutations of Gqα and Gsα that alter the fidelity of receptor activation. Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).
  22. Kostenis, E. Is Gα16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).
  23. Robas, N. M., Fidock, M. D. Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays. Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).
  24. Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., Gäde, G., Schoofs, L. Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors. Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).
  25. Peeters, L., et al. A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes. Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).

Tags

Cellular Biology G protein-koblet reseptor (GPCR) kalsium mobilisering analysen reverse farmakologi deorphanization cellular uttrykk system HEK293T Fluo-4 FlexStation
Karakterisering av G-protein-koblede reseptorer ved en fluorescens-basert Kalsium Mobilisering analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Caers, J., Peymen, K., Suetens, N.,… More

Caers, J., Peymen, K., Suetens, N., Temmerman, L., Janssen, T., Schoofs, L., Beets, I. Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay. J. Vis. Exp. (89), e51516, doi:10.3791/51516 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter