Den här beskrivna fluorescens-baserade kalciummobilisering analysen är en medel genomströmning omvänd farmakologi screening system för identifiering av funktionellt aktiverande ligand (er) av föräldralösa G-proteinkopplade receptorer (GPCRs).
För mer än 20 år, har omvänd farmakologi varit den mest framstående strategi för att upptäcka de aktiverande ligander av föräldralösa G-proteinkopplade receptorer (GPCRs). Uppkomsten av en omvänd farmakologi analysen är kloningen och efterföljande transfektion av en GPCR av intresse i ett cellulärt expressionssystem. Den heterologa uttryckta receptorn utmanades sedan med en förening bibliotek av kandidatligander för att identifiera receptor-aktiverande ligand (er). Receptoraktivering kan bedömas genom mätning av förändringar i koncentrationen av andra budbärare reportermolekyler, såsom kalcium-eller cAMP. Den fluorescens-baserade kalciummobilisering analys som beskrivs här är en ofta använd medel genomströmning vända farmakologi analys. Den anonyma GPCR transient uttryckt i humana embryonala njur-293T (HEK293T)-celler och en promiscuous Ga-16-konstruktionen samtransfekteras. Efter ligandbindning, aktivering av Ga-16-subenheten inducerar frisättningen av kalcium firom det endoplasmatiska retiklet. Före ligand screening, är receptoruttryckande celler laddade med en fluorescerande indikator kalcium, Fluo-4 acetoximetyl. Fluorescenssignalen av Fluo-4 är försumbar i celler under vilande betingelser men kan amplifieras mer än en 100-faldig vid interaktionen med kalciumjoner som frisätts efter receptoraktivering. Den beskrivna tekniken kräver inte den tidskrävande etablering av stabilt transfekterade cellinjer i vilka den transfekterade genetiska materialet är integrerat i värdcellgenomet. Istället kan en transient transfektion, generera tillfälligt uttryck av målgenen, är tillräcklig för att utföra screeningsanalys. Installationen gör mellan throughput screening av hundratals föreningar. Co-transfektion av promiscuous Ga-16, som är kopplad till de flesta GPCR: er, ger den intracellulära signaleringsvägen som skall omriktas mot frisättningen av kalcium, oberoende av den nativa signalväg i endogen instningar. De HEK293T cellerna är lätta att hantera och har bevisat sin effektivitet genom åren i receptor deorphanization analyser. Emellertid kan en optimering av analysen för specifika receptorer förblir nödvändigt.
G-proteinkopplade receptorer (GPCR) utgör en av de största och mest diversifierade familjerna bland alla cellytan proteiner. Deras närvaro i ryggradsdjur, ryggradslösa djur, växter, jäst och slemsvamp, samt i protozoer och den tidigaste diploblastic Metazoa visar att GPCRs är bland de äldsta molekylerna är kopplade med signaltransduktion 1. Deras naturliga aktiverande ligander omfattar en stor mångfald av yttre stimuli, inklusive peptider, biogena aminer, luktämnen, glykoproteiner och fotoner 2. Som sådana är dessa receptor-ligand signalsystem inblandad i ett stort antal olika fysiologiska processer. Det breda funktionella spektrum gör dem idealiska för utveckling av terapeutiska läkemedel som täcker ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar. Om 50-60% av de nuvarande läkemedelsmål representeras av GPCRs 3,4. Förutom deras stora betydelse inom läkemedelsindustrin, GPCRs är också i fokus för utvecklingen av enny generation av artspecifika insekts 5,6 och bekämpningsmedel i allmänhet. Eftersom de naturliga ligander av många GPCRs är fortfarande oidentifierad, klassificeras de som föräldralösa GPCRs. Den deorphanization av dessa receptorer kommer att förbättra förståelsen för deras fysiologiska roller i organismer och kan avslöja förmodade mål för nya läkemedelsansökningar 7.
Eftersom den genomiska eran, är det omvända farmakologi strategi i stor utsträckning för deorphanization av GPCRs 8. Ansatsen innebär att en föräldralös receptor används som en "krok" till "fiska ut" sin aktiverande ligand från ett biologiskt extrakt eller från ett bibliotek av syntetiska ämnen. Den GPCR av intresse därför klonas och därefter transfekteras i ett cellulärt expressionssystem. I de mest vanligen använda metoderna är receptoraktivering bestämmas genom mätning av förändringar i koncentrationen av den andra budbärarmolekyler 9 </sup>. De huvudsakliga receptorscreeninganalyser är beroende av kalciumkänsliga självlysande proteiner (t.ex. aequorin) 10 eller fluorescerande kalcium indikatorer (t.ex. Fluo-4) 11. De fluorescensbaserade analyser, där receptoruttryckande celler är laddade med en fluorescerande indikator kalcium före ligand screening, har den fördelen att de tillåter high-throughput screening på grund av sin användarvänlighet, kort tid att läsa, och flexibiliteten i screening flera föräldralösa receptorer på en enda platta 12.
Här är den fluorescensbaserad kalciummobilisering assay noggrant beskrivas och illustreras genom deorphanization förfarandet enligt Drosophila melanogaster korta neuropeptid F (sNPF) receptorn. Denna neuropeptidergic signalsystem ursprungligen präglats av Mertens et al. 2002 13 med en kalcium mareld analys utförs i kinesisk hamster äggstock (CHO)14 och av Feng et al. 2003 med en elektrofysiologisk analys med hjälp av Xenopus oocyter 15. Närvaron av signalsystemet sNPF tycks vara begränsat till phylum av Arthropoda, där den är inblandad i ett stort antal processer inklusive regleringen av matning, tillväxt, stressreaktioner, locomotion och dygnsrytm 16.
Forskning om neuropeptidergic signalsystem i insekter kan inte bara leda till nya mål för utvecklingen av insektsmedel, men kunskapen om deras funktion kan också extrapoleras till andra organismer så många signalsystem har i allmänhet väl bevarade genom evolutionen 17. Under det senaste decenniet har stora framsteg gjorts i deorphanization processen av insektsneuropeptid GPCRs. Trots dessa ansträngningar har bara ett litet antal receptorer matchats till sin tillhörande ligand, och massor av sekvensinformation förnya föräldralösa GPCRs har blivit tillgängliga på grund av den blomstrande av genomik 18. Tillgången på medium / high-throughput screening metoder, såsom fluorescensbaserade kalciummobilisering analys som har visat sig vara en stor utsträckning teknik 9,18, är därför ovärderlig.
Fluorescensbaserade kalciummobilisering analys såsom beskrivits här utförs i humana embryonala njur 293T (HEK293T) cellinjen och använder en fluorescerande prob för att fastställa förändringar i intracellulära kalciumkoncentrationer på receptoraktivering. För att garantera hög expression och nivåer av receptorn översättnings är en Kozak konsensussekvens 19 sattes till 5'-änden av den receptorkodningssekvensen, som därefter klonas i en expressionsvektor (t.ex. pcDNA vector serie för däggdjurscellinjer). Eftersom det är svårt att förutsäga den endogena G-protein-koppling av en föräldralös GPCR baserat på sekvensinformationensam, den andra budbärarmolekyler (t.ex. kalcium-eller cAMP) som moduleras efter receptoraktivering förblir ofta okänd före ligand identifiering. För att kringgå detta problem, promiscuous G-proteiner i Gq familj (t.ex. murina Ga-15 eller human Ga 16 [används här]) eller chimära G-proteiner (t.ex. Ga qi5) som interagerar med de flesta GPCR: er och inducerar frisättningen av kalcium kan samuttryckas 20,21,22. Vid bindning av liganden till dess receptor undergår GPCR en konformationsförändring som leder till aktivering av specifika intracellulära signalvägar. Den guanosin difosfat (GDP) molekyl, bunden inom ramen vilande betingelser till Ga-16-subenhet, kommer att ersättas av en guanosin-trifosfat (GTP)-molekyl. Detta framkallar dissociationen av det heterotrimera G-proteinet i en Ga-16 och Gβγ subenheten. Den Ga 16 subenheten aktiverar fosfolipas C &# 946; (PLCβ), vilket i sin tur hydrolyserar den membranbundna fosfatidylinositol bisfosfat (PIP2) vilket resulterar i diacylglycerol (DAG) och inositol-trifosfat (IP3). IP 3 kommer att spridas över hela cytoplasman och aktiverar IP-3-beroende kalciumkanaler som är närvarande i membranet i det endoplasmatiska retiklet, vilket inducerar frisättningen av kalcium i cytoplasman.
Kalcium frisättning vid receptoraktivering inträffar inom några sekunder och kan detekteras genom laddning av celler före screeningsanalys med ett kalciumkänsligt färgämne, som Fluo-4 acetoximetyl (AM) 11. AM estergruppen möjliggör fluoroforen att passera cellmembranet och spjälkas av genom cytoplasmatiska esteraser en gång inne i cellen. Följaktligen är de negativa laddningarna i det fluorescerande färgämnet omaskerad, hindrar den från att diffundera ut ur cellen och låta det interagera med kalciumjoner. Den fluorescerande signal of Fluo-4 är försumbar i celler under vila förhållanden endast innehåller kalciumkoncentrationer i nanomolarområdet. Emellertid, när kalcium frigöres vid receptoraktivering, kan signalen öka koncentrationsberoende till mer än en 100-faldig, härmed att säkerställa ett stort signal-till-brusförhållande. Fluo-4 uppvisar också ett stort dynamiskt omfång för att rapportera [kalcium] runt ett Kd (kalcium) på 345 nM, vilket gör den lämplig för att mäta fysiologiskt relevanta kalcium förändringar i en rad olika celler. Exciteringen av Fluo-4 uppträder vid 488 nm och fluorescensemissionen mäts vid 525 nm 11. Fluorimeters såsom fluorescens avbildningsplattläsare (FLIPR) 23, den Novostar eller FlexStation (stationsanordningen) 12 är medium / high-throughput system som tillåter samtidig förening addition och detekteringen av Fluo-4 signal vid receptoraktivering för varje brunn i en analysplatta. Den kalciummobilisering analysen beskriven här förlitar sig på stationenenheten 96-brunnars mikrosystemet.
Den SoftMax Pro (mjukvara) används för att driva stationen enheten samt för analys av data. Programmet visar omedelbart resultatet som diagram i 96-brunnsformat. Flera brunnar kan väljas samtidigt för att jämföra resultaten av dessa brunnar i samma diagram. Den relativa fluorescerande enhet (RFU)-värden för brunnar i varje kolumn samtidigt mäts under en period av två minuter, med början före tillsatsen av föreningarna till brunnarna och fortsätter efter mätning av den fluorescerande signalen följande receptoraktivering. Typiskt, utvecklingen av en agonist kurvan sammanfaller med baslinje tills en aktiverande förening sättes till cellerna, vilket resulterar i en snabb ökning av fluorescenssignalen. Den topphöjden är korrelerad med den slutliga agonistkoncentrationen i brunnen. Efter toppen, droppar den fluorescerande signalen långsamt mot baslinjenivån. Det RFU mätningar can omvandlas till koncentration-responskurvor för att bestämma EC50-värdet (halva maximala effektiva koncentrationen) av en ligand. I allmänhet är åtminstone tre oberoende skärmar, var och en innefattar tre kopior av en koncentrationsserie, ska utföras för att komponera en tillförlitlig koncentration-responskurva.
Det rekommenderas att inkludera flera positiva och negativa kontroller i experimentell design. Först av allt, en transfektion kontroll, dvs genomförande av en receptor med en känd ligand, bör testas. Detta gör det möjligt att kontrollera om den transfektion agenten var i drift. Inkorporering av ett kontrollförsök med en agonist för en endogen receptor av cellinjen och en negativ kontroll (t.ex. tvättbuffert) rekommenderas också för att övervaka hälsan och livskraften hos cellerna och för att utesluta möjligheten att tvättbufferten var kontaminerad med en faktor som skulle kunna framkalla ett auto fluoredoft svar. Ofta använda agonister är en peptid härledd från det proteas-aktiverad receptor-1 (PAR 1), som verkar som en PAR en selektiv agonist, eller karbakol, som aktiverar den acetylkolinreceptorn. Celler transfekterade med en tom expressionsvektor bör också testas för att utesluta att aktiva föreningar interagerar med cellens endogena receptorer. Optimering av flera parametrar som beskrivs i protokollet nedan kan krävas för olika signalsystem. En schematisk figur av den fullständiga fluorescensbaserad kalciummobilisering analysen visas i Figur 1.
Figur 1. Övergripande schema över fluorescensbaserade kalciummobilisering analys. Automatiserad vätskehantering och samtidig fluorescensmätningar utförs med stationenenhet mikroplattläsare, som drivs av programvaran. Stationen enheten innehåller tre lådor, en för cellplattan, förening plattan och dricks rack. Utbyggnaden i pipett överför föreningar från en kolumn av föreningen plattan till motsvarande kolumnen i cellplattan (steg 1). Varje brunn av cellplattan innehåller ett monolager av HEK293T celler som har co-transfekterade med GPCR av intresse och den promiskuösa Ga 16 subenhet. När en förening som aktiverar receptorn, är Ga-16-bunden BNP ersättas av GTP. The Ga 16 subenhet dissocierar därefter från Gβγ komplexet och aktiverar fosfolipas Cp (PLCβ), vilket i sin tur hydrolyserar fosfatidylinositol bisfosfat (PIP2) vilket resulterar i diacylglycerol (DAG) och inositol-trifosfat (IP3). IP 3 aktiverar IP-3-beroende kalciumkanaler som är närvarande i membranet i det endoplasmatiska retiklet, vilket inducerar frisättningen av kalcium into cytoplasman. Interaktionen av kalcium med Fluo-4 (med vilket cellerna lagras inför till förening addition) resulterar i en fluorescenssignal (steg 2). Programmet presenteras resultaten som relativa fluorescerande enhet (RFU)-värden som funktion av tiden, och topphöjderna korrelerar med liganden koncentration på ett koncentrationsberoende sätt. Dessa data kan sedan omvandlas till en koncentration-responskurva för att bestämma EC50-värdet på ett ligand-receptorparet (steg 3).
Fluorescensbaserade kalciummobilisering analys med framgång tillämpas för att bekräfta den funktionella karakteriseringen av Drosophila sNPF peptiderga signaleringssystem, som redan utfördes genom Mertens et al. med en bioluminescens-analys och av Feng et al. med en elektrofysiologisk analys 13,15. De EG 50 värden som erhålls med fluorescens-analys i HEK293T-celler är omkring 10 gånger lägre än de som erhölls med bioluminescens-analys utförs i CHO-celler (Drome-sNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drome-sNPF- 2: fluo = 5.89 nM, lumi = 42 nM, Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM, Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Dessa variationer kan förklaras av flera faktorer, inklusive det faktum att en av de använda expressionssystem kan vara bättre lämpade för funktionell expression av en given receptor eller vikningen av vissa receptorer kan vara mindre effektiva i cissa celltyper. De EC 50-värden för alla fyra Drome-sNPF peptider är i nanomolarområdet vid prov på sin receptor med både fluorescens och mareld analysen, i allmänhet stöder den fysiologiska relevansen av sin peptid-receptor interaktion in vivo.
Observera att ingen transfektion kontroll med en receptor för vilken den aktiverande liganden är känd ingick i skärm som presenteras här, eftersom signaleringssystemet Drosophila sNPF normalt transfektionen kontroll i experimentella uppställningar. Den positiva kontrollen med en endogen ligand av HEK293T cellerna (PAR 1) och den negativa kontroll (tvättbuffert) inkluderades i skärmen. Resultaten från PAR 1 visade att cellerna var i ett gott skick. Den negativa kontrollen (tvättbuffert) framkallade inte en fluorescerande signal, som indikerar att det medium i vilket peptiderna upplöses var fri från eventuella föroreningar som skulle kunna influence resultaten.
Den tidigare karakteriserats Drosophila sNPF signaleringssystem användes här för att förklara den fluorescensbaserad kalciummobiliseringsanalys. För detta ändamål var koncentrationsserie av de aktiverande ligander testades omedelbart. När emellertid en föräldralös receptor bringas till överexpression i en screeningsanalys för att testa ett bibliotek som innehåller hundratals av föreningar, är det rekommenderat att första skärmen med relativt höga slutkoncentrationer av liganderna (t.ex.., 10 eller 1 | iM). Efter detektering av en aktiverande förening, kan en utspädningsserie av att föreningen som skall screenas för att komponera en koncentration-responskurva och för att bestämma EC50-värde.
När den aktiverande liganden hos en receptor som är bestämd, kan den intracellulära signaleringsvägen att undersökas ytterligare genom en anpassning av protokollet. Analysen kan utföras såsom beskrivits ovan, men utan att samtransfektera G ^5, 16-subenheten. När ett kalciumsvar mäts, betyder det att receptorn par med en endogen Ga q-subenheten av det cellulära expressionssystemet. När ingen fluorescerande signal observeras, kan protokoll för att mäta förändringar i koncentrationer av andra sekundära budbärare (t.ex.., CAMP) tillämpas.
Struktur-aktivitetssamband (SAR) studier kan även utföras för att definiera peptidens kärnsekvensen som krävs för aktivering av receptorn. Först är stympade sekvenser utvärderas för att definiera den minimala aminosyrasekvensen för den peptid som fortfarande kan aktivera receptorn. Därefter kan peptider testas i vilken systematiskt varje aminosyra har ersatts med en alaninrest. Testning syntetisk alaninsubstitutionsserie på receptorn tillåter att bestämma vikten av var och en av aminosyrorna för receptoraktivering 24,25.
Trots dess allmänna användning och bevisade effekkans, måste det understrykas att den analys som beskrivs här kan behöva några anpassningar för att få optimala resultat för specifika receptorer av intresse. The Ga 16 subenheten har den fördelen att den binder till de flesta GPCR: er, men kan också ha en dominant-negativ effekt på receptorer som endogent par via Ga q 22. I detta fall kan det vara bra att testa olika kombinationer av G-proteiner under optimeringen av en kalciumanalys roman och att jämföra resultaten för Ga q kopplade receptorer i frånvaro eller närvaro av Ga 16. Alternativa analyser som är oberoende av den samverkande G-protein för att upptäcka receptoraktivering kan också utföras, såsom translokation av GFP-märkta arrestin, eller att upptäcka förändringar i membranpotential (t ex., Av FLIPR Membrane Potential Assay Kit). Förutom använde Fluo-4:00 här, ett brett utbud av andra kalciumkänsliga fluoroforer, alla med sin egen spektral och chemical egenskaper, finns tillgänglig. Den lämpligaste fluorofor kan väljas baserat på den GPCR, celltyp och den tillgängliga plattläsare, men experimentell verifiering är nödvändig. Mängderna transfekterade DNA och DNA / transfektionsreagens förhållande behov att bestämmas för varje receptor-transfektion reagens-cellinje kombination. Slutligen bör det hållas i minnet att celler i kontinuerlig kultur tillåter endast 20-25 användbara passager för att utföra screeningsanalyserna.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Research Foundation Flanders (FWO-Vlaanderen, Belgien, G.0601.11) och KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ och LT nytta av ett stipendium från FWO-Vlaanderen.
HEK293T cells | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | MP Biomedicals | 195173 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Penicillin-Streptomycin (P-S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
jetPRIME | Polyplus transfection | 114-01 | FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies) |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Reagent A100, Lysis buffer | Chemometec | 910-0003 | |
Reagent B, Stabilizing buffer | Chemometec | 910-0002 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
NaOH (1 M) | Vel | 2781 | |
Pluronic acid | Invitrogen | P-3000MP | |
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen) |
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) | Sigma-Aldrich | Z707503 and Z707554 | |
FlexStation device | Molecular Devices | NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices) | |
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom | Greiner Bio-One | 655090 | Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | ||
Microcentrifuge tubes, siliconized | BioCision | BCS-2470 | |
Polystyrene V-shaped 96-well plates | Greiner Bio-One | 651101 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
Soft Max Pro software | Molecular Devices |