Abstract
تعتمد دراسة الجهاز العصبي المركزي (CNS) على نضوج استهداف الجيني للسكان العصبية. ومع ذلك، فقد أثبتت مهمة تقييد التعبير عن الجينات التي تهم فرعية العصبية محددة صعبة بشكل ملحوظ بسبب الندرة النسبية للعناصر المروج محددة. interneurons GABAergic يشكل السكان الخلايا العصبية مع التنوع الجيني والمورفولوجي واسعة النطاق. في الواقع، تم التعرف على أكثر من 11 أنواع فرعية مختلفة من interneurons GABAergic في القشرة الماوس 1. هنا نقدم بروتوكول تكييفها لاستهداف انتقائي للسكان GABAergic. حققنا النوع الفرعي الاستهداف الانتقائي للinterneurons GABAergic باستخدام عنصر محسن من النسخ homeobox العوامل Dlx5 وDlx6، المتماثلات من ذبابة الفاكهة البعيدة أقل (دلل) الجينات 2،3، لدفع التعبير عن جينات محددة من خلال Electroporation للفي الرحم.
Introduction
الجزء الأكبر من interneurons GABAergic القشرية تنشأ من هيكلين الجنينية عابرة اسمه الفضيلة العقدية سطي والذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري على التوالي) 4. Parvalbumin والسوماتوستاتين معربا عن interneurons تنشأ في MGE حين Calretinin (CR)، Vasointestinal الببتيد (VIP) وريلين reelin (إعادة) معربا عن interneurons تنشأ من فريق الخبراء الاستشاري. هذه الأنواع الفرعية عصبون يمكن تمييزها من تواريخ ميلاد لهم. يولدون MGE فرعية مستمدة بين يوم الجنينية 9.5 (E9.5) وe16.5 5،6. في المقابل، يولدون interneurons فريق الخبراء الاستشاري المستمدة من E12.5 من خلال e18.5 مع إنتاجها تبلغ ذروتها في E15.5 6. استهداف الجيني لهذه الفئة من السكان ولدوا في وقت متأخر، ومع ذلك، لا يزال بعيد المنال.
يتم التعبير عن الفئران القاصي-أقل (DLX) حصرا الجينات في الدماغ الأمامي البطني تطوير 3. interneurons GABAergic الخلايا العصبية الإسقاط والجسم المخطط ولكن الخلايا الهرمية لا القشرية التعبير عن Dlx1، 2،5، و 6 الجينات في مراحل النمو المبكرة 3. في الواقع، يتم التعبير عن الجينات DLX في منطقة MGE وفريق الخبراء الاستشاري subventricular (SVZ) في جميع الأسلاف GABAergic. التعبير عن هذه الجينات يصبح يقتصر على تحديد الأنواع الفرعية في مراحل تالية للتفتل 7-9. أظهر الأدلة التجريبية السابق أن العنصر محسن Dlx5 / 6 يسمح للالاستهداف الانتقائي الأنساب GABAergic في نماذج الفئران المعدلة وراثيا 2. اختبرنا استخدام واحدة من هذه العناصر محسن في سياق episomal التعبير في مخ الفأر النامية. نحن الفرعية المستنسخة عنصر محسن Dlx5 / 6 جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من المروج وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في bluescript (BS) العمود الفقري بلازميد (الشكل 1). قدمنا البلازميد عن طريق Electroporation للفي الرحم في E15.5 لاستهداف انتقائي CR-، وكبار الشخصيات والمعاودة النوع الفرعي 3،8،10. لدينا تقنية تسمح ل electroporation متفرق، مما يسهلإعادة إعمار الميزات المورفولوجية الخلايا سفعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مستويات مرتفعة بشكل استثنائي في التعبير الجيني في الخلايا العصبية GABAergic القشرية تسمح للدراسات وظيفية. أجرينا الخسارة والربح من الدراسات الدالة باستخدام العديد من نوع البرية والجينات السلبية المسيطرة 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم علاج جميع الحيوانات وفقا للأنظمة والمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من كلية الطب بجامعة نيويورك.
الماوس سلالات
تم استخدام الفئران الإناث وبستر السويسرية التي تقدمها تاكونيك لهذه التجارب. من أجل استهداف تحديدا interneurons طبقة سطحية، واستخدمت الأجنة E15.5.
ملاحظة: البلازميد المستخدمة في هذا العمل (Dlx5 / 6.eGFP بلازميد 3 ميكروغرام / ميكرولتر) تم إنشاؤها باستخدام تقنيات الاستنساخ القياسية. تم استنساخ EGFP [كدنا] إلى Dlx5 / 6 Pmin-بوليا بلازميد. هذا البلازميد هو متاح عند الطلب (demarn02@nyumc.org).
1. إعداد حقن مكروي الماصات
- تعيين مجتذب الحرارة # 2-860.
- وضع وتأمين الزجاج الشعرية بالقرب من خيوط. تأكد من أن القطر الخارجي (OD) من ماصة هو ما يقرب من 30 ميكرون.
- اضغط على زر "سحب".
- إزالة الشعرية بعناية. الجزء السفلي هو الإبرة. تجاهل الجزء العلوي.
2. التخدير الداخلي
- إعداد غرفة تحتوي على الأيزوفلورين. ملاحظة: الأيزوفلورين هو المخدر المفضل بسبب عملها السريع وتدني نسبة الآثار الجانبية. بنتوباربيتال هو خيار آخر؛ ومع ذلك، والتسامح من هذا الدواء هو متغير ويمكن أن يؤدي إلى معدل وفيات أعلى من الأيزوفلورين.
- ضبط تدفق الأيزوفلورين إلى 4-5٪ في 0.5-1 لتر / دقيقة O 2.
- تأكد من أن صمام للغرفة مفتوحة في حين يتم إغلاق صمام لمحول الرأس.
- ضع الماوس حاملا في الغرفة.
- السماح الماوس للذهاب تحت تأثير التخدير. هذا وسوف يستغرق حوالي 2-3 دقائق. تحقق من معدل التنفس. إذا كان الماوس يبدأ اللهاث، وانخفاض جرعة من الأيزوفلورين.
- بعد مخدرة الماوس، وإزالة فورا أنه من الغرفة. وضعه الجانب بطني حتى على لوحة التدفئة وأناnsert رأسه في قناع التي سوف تستمر في تزويد الأيزوفلورين طوال الجراحة. تأكد من التبديل تدفق الأيزوفلورين من غرفة إلى أنابيب يربط قطعة محول الرأس. وضع قطرة من زيوت التشحيم العين في كل عين وإغلاق العينين.
- تعيين سادة التدفئة إلى 36 ° C درجة للحد من انخفاض حرارة الجسم.
- تحقق من عدم وجود ذيل القدم وردود الفعل من قبل معسر الكفوف الخلفية والذيل.
3. جراحة
- تطهير الجلد الذي يغطي البطن مع الايثانول 70٪.
- استخدام ملقط لسحب الجلد لأعلى. بعد كل جراحة، وغسل جميع الصكوك مع المنظفات والماء، وتعقيمها عند 72 درجة CO / N.
- جعل شق عمودي صغير (حوالي 2 سم) على طول خط الوسط ابتداء من منتصف المسافة بين أزواج الثالثة والرابعة من الغدد الثديية. استخدام مقص الجراحة الدقيقة. الحرص على عدم تلف جدار البطن.
- فصل بلطف الجلد من الصفاق.
- تصور الشرايينوالأوردة على جدار البطن. جعل شق آخر 2 سم الرأسي من خلال الصفاق (تجنب السفن) لفضح تجويف البطن.
- المشبك الجلد وجدار البطن على كل جانب تجنب تحامل الشرايين. ملاحظة: إذا تم ثقب الشرايين عن طريق الخطأ، تضحية الحيوان فورا عن طريق إجراء خلع عنق الرحم أو جرعة زائدة الأيزوفلورين.
- قبل تدفئة برنامج تلفزيوني العقيمة إلى 37 درجة مئوية. تغطية المشابك مع PBS رطبة كيم مناديل.
- ترطيب تجويف البطن يتعرض مع برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة عدة مرات أثناء أداء الجراحة.
- باستخدام ملقط مستديرة، برفق سلسلة الجنينية (E15.5) بعيدا عن تجويف. السماح للبقية السلسلة على مناديل مبللة. تبدأ من خلال فضح نصف الرحم أولا. بمجرد electroporated الأجنة في ذلك، إعادته في الداخل، ثم العمل على الشوط الثاني.
4. Electroporation لل
- الاستمرار في استخدام ملقط مستديرة لمعالجة الأجنة.
- السادسsualize البطينات الجانبية. البطينات الجانبية تشغيل على طول خط الوسط (الشكل 1B).
- إضافة سريع الأخضر (الأوراق المالية: 10٪ ث / ت) في حل DNA ل01:20 الخليط إلى تصور أنه خلال الحقن. تحضير محلول الحمض النووي عن طريق إذابة بيليه الحصول عليها من معيار ماكسي الإعدادية البروتوكول في تنقية الماء المقطر.
- استخدام بال micropipettes قبل سحبها مع المكبس لحقن 1 مل من محلول الحمض النووي (Dlx5 / 6-EGFP، 3 ميكروغرام / ميكرولتر) مع الأخضر السريع. قطع غيض من micropipette مع غرامة forcep رقم 5 (دومون) لمغادرة 6 ملم طول من بداية الكتف إلى نهاية رأس الإبرة قبل تحميل ماصة. عقد رأس الجنين مع ملاقط الجولة. أدخل الدماغ مع ماصة في زاوية 45 درجة تهدف للبطين الجانبي تقع بالقرب من خط الوسط. إذا تخترق إبرة من خلال البطين، يتراجع ببطء ماصة كما يمكنك استخدام المكبس لحقن الحمض النووي. البطين يجب أن يتحول إلى اللون الأخضر عندماالحل يبدأ لملئه. عند هذه النقطة، يتوقف عن الحركة ماصة وحقن 1 مل من الحمض النووي. بلطف، وسحب ماصة.
- تعيين electroporator CUY21 إلى خمس 45V البقول من 50 ميللي ثانية متباعدة من قبل 950 ميللي ثانية.
- استخدام 5 مم أقطاب مجداف للأجنة E15.5. تراجع الأقطاب في برنامج تلفزيوني لضمان انتقال الحالي كفاءة.
- وضع المجاذيف القطب حول رأس الجنين مع مجداف إيجابي على البطين تحتوي على محلول الحمض النووي. انخفاض طفيف مجداف الإيجابي مع احترام الآخر سلبي لخلق تيار البطني من خلال الفضيلة العقدية. وهذا التلاعب تقليل التعبير خارج الرحم في الخلايا الهرمية.
- بعد وضع الأقطاب، وتقديم نبضه عن طريق الضغط على دواسة القدم مرة واحدة.
- إزالة الأقطاب والقضاء عليها نظيفة. كرر الخطوات من 4،6-4،9 مع كل جنين.
- بعد electroporating جميع الأجنة، صب 3 مل من برنامج تلفزيوني في تجويف البطن وإعادتها إلى تجويف البطن.
- خياطة أول جدار البطن مع إبرة منحنية و5-0 خياطة الحرير ثم الجلد. تطبيق يدوكائين (4٪) على الجرح. إدارة 120 ملغم / كغم من الأسبرين داخل الغشاء البريتوني للتسكين.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في 20 دقيقة أو أقل. فإنه من المستحسن أن electroporate مبتدئين فقط بضع الأجنة للحفاظ على وقت العملية باختصار. سوف العمليات الجراحية لفترات طويلة يقلل من معدل بقاء الأجنة. - إزالة الحيوان من أنابيب التخدير والسماح الاسترداد على وسادة التدفئة على ورقة يمسح.
- عودة الحيوان إلى القفص، والحفاظ على وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية ورصد الوضع الصحي. الحيوانات يتسامح عموما الجراحة بشكل جيد وتبدأ في التحرك ببطء قريبا بعد أن يتم إزالتها من أنابيب التخدير. إذا لاحظت النزيف المفرط أو الخمول، وتضحية الحيوان فورا عن طريق إجراء الموافقة IACUC إجراءات القتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم أو التخدير جرعة زائدة.
- العودة إلى قفص فيفاRIUM. سوف الإناث تلد بشكل طبيعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن تكييف Electroporation للتقنية في الرحم لتحقيق نوع من الخلايا استهداف محدد من الخلايا العصبية التي تستحق. لدفع التعبير عن EGFP في interneurons فريق الخبراء الاستشاري المشتقة، استخدمنا عنصر محسن Dlx5 / 6 والمقيدة الحقن جهدنا لE15.5، المرحلة التي يتم إنشاؤها غالبية interneurons فريق الخبراء الاستشاري مشتقة. أجرينا التحليل في وP8 P15 11 (الشكلان 1 و 2). أكدنا أصل بطني من الخلايا العصبية electroporated من شارك electroporating على CAG-mCherry وDlx5 البلازميدات / 6-EGFP في تركيزات متساوي المولية في E15.5. في هذه التجربة، لاحظنا أن الأسلاف البطنية الوحيدة الواقعة في منطقة subventricular (SVZ) شارك أعربت كل من البروتينات 11. هذا التعبير الزمانية المكانية من البروتينات الفلورية يتزامن مع التعبير التنموي الطبيعي للDlx5 و 6 الجينات، والتي لا يتم التعبير عنها في البطين ولكن subventrمنطقة icular 4. وعلاوة على ذلك، قمنا بتقييم هوية من interneurons GABAergic Dlx5 / 6-mCherry electroporated في خط knockin الماوس GAD67-EGFP. وجدنا أن الغالبية العظمى من الخلايا العصبية electroporated أعرب GAD67، انزيم التي أعربت عنها كل الخلايا GABAergic 11. بالإضافة إلى ذلك، حددنا هوية النوع الفرعي من interneurons electroporated عن طريق أداء المناعية والتحليل الكهربية في P15. تم الكشف عن نمط من التعبير عن علامات محددة النوع الفرعي بواسطة المناعي في أقسام ناظم البرد 11 (الشكل 2). وجدنا أن interneurons electroporated في E15.5 التعبير على وجه الحصر تقريبا NPY، ريلين reelin، وكبار الشخصيات والكروم، التي سبق وصفها عصبون علامات فريق الخبراء الاستشاري المستمدة-6. وعلاوة على ذلك، فإن الخصائص الكهربية الجوهرية من هذه الخلايا العصبية هي في الاتفاق مع احد سبق وصفها في دراسات الخرائط مصير 6،11. كل ذلك معا، وهذه النتائج تشير إلى أن electropoالتموينية مع عنصر محسن Dlx5 / 6 في E15.5 تستهدف بشكل انتقائي فرعية عصبون فريق الخبراء الاستشاري مشتقة.
الرقم 1. تمثيل تخطيطي من التجارب Electroporation لل. أ) Subcloning استراتيجية لDlx5 / 6-EGFP البلازميد. ب) رسم بياني يوضح استراتيجية التجريبية.
ويرسم الشكل 2. Electroporated interneurons من التعبير عن علامات النوع الفرعي فريق الخبراء الاستشاري مشتقة. A) interneurons المستمدة فريق الخبراء الاستشاري electroporated مع Dlx5 / 6-EGFP البلازميد. لاحظ Electroporation للمتفرق من فريق الخبراء الاستشاري فرعية متنوعة. ب) عصبون، معربا عن كبار الشخصيات في P8. يحدد EGFP التعبير وشجرة تغصنية بأكملها ومحواري الشجرة من الخلايا العصبية واحدة. ج) عصبون، معربا عن NPY في P8. التعبير نبي يحدد خلايا neurogliaform. د) عصبون، معربا عن NPY في P15. شريط النطاق A، 100 مم؛ BD، 50 مم
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قيود تقنية
في حين أن هذا الأسلوب يسمح للخلية التحليل المستقل للعمليات الخلية، فإنه ليست مناسبة لتحليل السكان. وelectroporations هم متفرق جدا مع أقل من ألف خلايا electroporated في الدماغ. ونتيجة لذلك، هذه التقنية لا يمكن استخدامها لتقييم العواقب السلوكية الناجمة عن التلاعب الجيني للinterneurons فريق الخبراء الاستشاري مشتقة.
بينما electroporations تنفذ على أنواع فرعية الهدف E13.5-E14.5 MGE المشتقة، وكفاءة منخفضة 10. نحن التكهن بأن Dlx5 / 6 محسن هو أقل نشاطا في MGE فرعية تالية للتفتل على الأقل في سياق التعبير episomal.
أهمية فيما يتعلق بأساليب موجودة
وتمثل هذه التقنية تقدم من قبل وسائل Electroporation لل12،13 لدراسة interneurons. نظرا لندرتها النسبية والجنين بطنيالأصل شركة الاستثمارات الوطنية، وقد أثبتت هذه الفئة من السكان من الخلايا العصبية الصعب استهداف. توفر تقنية لدينا الوسائل اللازمة لإجراء تحليل خلايا مستقلة من interneurons فريق الخبراء الاستشاري مشتقة. مستويات عالية من EGFP التعبير تسمح لتصور وتحليل interneurons واحد.
تطبيقات المستقبلية
من خلال الجمع بين استخدام البلازميدات محددة وخطوط الماوس المعدلة وراثيا من الممكن تحقيق السيطرة الزمانية والمكانية في التعبير عن الجينات في المصالح. على سبيل المثال، استخدمنا Dlx5 / 6-TTA بلازميد لتشغيل التعبير عن الجينات المحورة تيتو محرض. في هذه التجارب، كنا قادرين على إسكات التعبير التحوير من قبل ادارتها دوكسي 8. نحن حاليا على وضع بروتوكول لاستخدام هذه التقنية في تركيبة مع نظام CreER.
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
لتحقيق Electroporation للكفاءة والبقاء على قيد الحياة، في محاولة لتجنب excesSIVE التلاعب في الأجنة و / أو أجهزة. بالإضافة إلى ذلك، تجنب معسر الشرايين والأوردة. سوف الماوس سرعان ما تصبح نقص حجم الدم في حال حدوث النزيف. بعد الانتهاء من Electroporation لل، وضع الأجنة والأجهزة في نفس المواقف حيث وجدت لهم لتجنب خلق مكامن الخلل التي يمكن أن تسبب نقص الأكسجة. تهدف لمدة 20 دقيقة أو أقل وقت الجراحة. ترطيب تجويف البطن مع PBS مرات عديدة أثناء الجراحة. خلال Electroporation لل، في محاولة لثقب البطين مرة واحدة فقط مع الإبرة الشعرية. سوف الثقب المتكرر يقلل من معدل البقاء على قيد الحياة. بعد فترة التدريب، ينبغي أن يكون معدل البقاء على قيد الحياة 80٪ أو أعلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نحن ممتنون لLIHONG يين للمساعدة التقنية. NVD هو حاصل على جائزة NARSAD يونغ الباحث ومدعومة أيضا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5 MH095825-02 K99). ويدعم البحوث في المختبر Fishell من قبل المعهد الوطني للصحة، والمعهد الوطني للصحة العقلية (5 MH095147-02 R01، R01 MH071679-09 5)، المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (5 R01 NS081297-02، 1 P01 NS074972 -01A1) ومؤسسة سيمونز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
