This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Изучение центральной нервной системы (ЦНС) созревания зависит от генетической адресности нейронных популяций. Тем не менее, задача ограничивая экспрессию генов, представляющих интерес для конкретных нейрональных подтипов, оказалось на удивление сложным вследствие относительного дефицита конкретных элементов промотора. ГАМКергические интернейронов составляют нейронов население обширных генетических и морфологическое разнообразие. В самом деле, более 11 различных подтипов ГАМК интернейронов были охарактеризованы в коре мыши 1. Здесь мы представляем адаптированный протокол избирательный подход популяций ГАМКергические. Мы достигли подтипа избирательного выбора ГАМКергические интернейронов с помощью энхансерной элемент гомеобоксного транскрипционных факторов Dlx5 и Dlx6, гомологов дрозофилы дистальной-менее (DLL) гена 2,3, для управления экспрессией специфических генов через внутриутробное электропорации.
Основная часть коры интернейронов ГАМКергические происходят из двух переходных эмбриональных структур, названных медиальной и хвостового ганглиозные возвышения (MGE и общего равновесия соответственно) 4. Парвальбумина и соматостатина выражая интернейронов происходят в MGE, тогда Calretinin (Cr), Vasointestinal пептид (VIP) и Reelin (Re) выражая интернейронов происходят из КГЭ. Эти интернейрон подтипов можно отличить по их датах рождения. MGE, полученные подтипы рождаются между эмбриональной день 9.5 (E9.5) и E16.5 5,6. В отличие от этого, КГЭ, полученные интернейронов рождаются из E12.5 через E18.5 с их производство достигнув E15.5 6. Генетический таргетинг этого поздно родился населения, однако, пока не удается.
Мышиные дистального-менее (DLX) гены экспрессируется исключительно в развивающихся вентральной части переднего мозга 3. ГАМКергические интернейронов и полосатого тела нейронов разбрасывания, но не корковых пирамидальные клетки выразить Dlx1, 2,5, и 6 генов на ранних стадиях развития 3. В самом деле, гены Dlx выражаются в MGE и КГЭ субвентрикулярной зоне (SVZ) во всех предшественников ГАМКергические. Экспрессия этих генов становится ограниченным, чтобы выбрать подтипы в постмитотических этапах 7-9. Предыдущий экспериментальные доказательства показали, что усилитель элемент Dlx5 / 6 позволяет избирательный подход ГАМКергических линий в трансгенных мышах 2. Мы протестировали использование одного из этих усиливающих элементов в контексте выражение эписомального в развивающемся мозге мыши. Мы суб клонировали энхансер элемент Dlx5 / 6 вместе с минимальным промотором и расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в Bluescript (BS) магистральной плазмиды (рисунок 1). Мы ввели плазмиды с помощью внутриутробно электропорации в E15.5 для селективного воздействия CR-, VIP и повторно подтипов 3,8,10. Наша методика позволяет редкой электропорации, что облегчаетреконструкция морфологических особенностей ожога клеток. Кроме того, исключительно высокие уровни экспрессии генов в нейронах коры ГАМКергические позволяет функциональных исследований. Мы провели потери и усиление функциональных исследований с использованием нескольких дикого типа и доминантных негативных генов 11.
Ограничения техники
В то время как этот метод позволяет мобильному автономного анализа клеточных процессов, он не подходит для анализа населения. В electroporations очень редкие с менее тысячи клеток электропорации за мозга. Как следствие, этот метод не может быть использован ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Lihong Инь для оказания технической помощи. NVD является получателем NARSAD молодых исследователей премии и также при поддержке грантов NIH (5 K99 MH095825-02). Исследования в лаборатории Fishell поддерживается Национальным институтом здравоохранения, Национального института психического здоровья (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Национального института неврологических расстройств и инсульта (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) и Фонд Саймонса.
Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |