Abstract
In der Säugetier Cortex, Neuronen äußerst kompliziert Netzwerken und den Austausch von Informationen an den Synapsen. Veränderungen in der synaptischen Stärke, sowie Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, treten in einer Erfahrung abhängig und bietet die strukturelle Grundlage der neuronalen Plastizität. Wie postsynaptischen Komponenten der Synapsen in der Großhirnrinde werden dendritische Dornen als eine gute Proxy von Synapsen sein. Unter Vorteile der Mausgenetik und fluoreszierende Markierungstechniken, einzelne Neuronen und ihre synaptischen Strukturen im intakten Gehirn gekennzeichnet werden. Hier haben wir eine transkranielle Bildgebungsprotokoll einzuführen mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie zur fluoreszenzmarkierten postsynaptischen dendritischen Dornen im Laufe der Zeit in vivo zu folgen. Dieses Protokoll verwendet einen ausgedünnten Schädel Zubereitung, die den Schädel intakt hält und vermeidet inflammatorische Effekte durch die Exposition der Hirnhäute und die Rinde verursacht. Daher können Bilder sofort nach su erworben werdenrgery durchgeführt wird. Das experimentelle Verfahren kann wiederholt über verschiedene Zeitintervalle im Bereich von Stunden bis zu Jahren durchgeführt werden. Die Anwendung dieser Zubereitung kann auch erweitert werden, um verschiedenen kortikalen Regionen und Schichten sowie andere Zelltypen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen, werden.
Introduction
Die Säugetier Kortex beteiligt sich an zahlreichen Hirnfunktionen, von der Sinneswahrnehmung und Bewegungssteuerung, um abstrakte Informationsverarbeitung und Kognition. Verschiedene kortikaler Funktionen bauen auf verschiedenen neuronalen Schaltkreisen, die aus verschiedenen Arten von Neuronen, die Kommunikation und den Austausch von Informationen an einzelnen Synapsen gemacht. Die Struktur und Funktion der Synapsen werden kontinuierlich in Abhängigkeit von Erfahrungen und Pathologien modifiziert. In reifen Gehirn nimmt die Form der synaptischen Plastizität beider Stärke Veränderungen und Hinzufügen / Entfernen von Synapsen, spielen eine wichtige Rolle in Bildung und Aufrechterhaltung eines funktionellen neuronalen Schaltkreisen. Dendriten sind die postsynaptischen Komponenten der Mehrzahl der Synapsen im Gehirn von Säugetieren. Die Konstante Umsatz-und morphologische Veränderungen von Stacheln dienen wahrscheinlich als ein guter Indikator für Veränderungen in der synaptischen Verbindungen 1-7 dienen.
Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikropie bietet tiefe Penetration durch dicke, undurchsichtige Vorbereitungen und geringe Phototoxizität, die es für die Live-Darstellung im intakten Gehirn 8 geeignet ist. In Kombination mit Fluoreszenzmarkierung, bietet zwei-Photonen-Imaging ein leistungsfähiges Werkzeug, um in das lebende Gehirn zu spähen und folgen strukturelle Reorganisation an einzelnen Synapsen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Es wurden verschiedene Methoden verwendet, um Mäuse für Live-Imaging 9-13 vorzubereiten. Hier beschreiben wir eine dünnten Schädel Herstellung von in vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung, um die strukturelle Plastizität der postsynaptischen dendritischen Dornen in der Maus Kortex zu untersuchen. Mit diesem Ansatz haben unsere jüngsten Studien ein dynamisches Bild von dendritischen Dorn sich in Reaktion auf motorischen Lern Mit zunehmender Verfügbarkeit von transgenen Tieren mit fluoreszenzmarkierten neuronalen Teilmengen und schnelle Entwicklung der in-vivo-Markierungstechniken dargestellt, können hier beschriebenen ähnliche Verfahren auch angewendet werden, Untersuchungen zute anderen Zelltypen und kortikalen Regionen, zusammen mit anderen Behandlungen, wie auch in Krankheitsmodellen 16-23 verwendet.
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Protocol
Genehmigung braucht, um von zu Hause aus Institutionen vor Beginn der Operation und bildgebenden Studie gewonnen werden. In dieser Handschrift beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften von der University of California, Santa Cruz Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt.
1. Chirurgie
- Autoklav alle chirurgischen Instrumenten und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Alkohol gründlich vor der Operation.
- Anesthetize die Maus durch intraperitoneale (IP) Injektion von KX Anästhesielösung (200 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin) nach der Mauskörpergewicht. Hinweis: KX Dosierung kann je nach Stamm, Alter angepasst und Gesundheitsstatus der Mäuse. Veterinär Beratung, die optimale Dosis zu bestimmen ist ebenfalls empfehlenswert.
- Führen Sie eine Zehe-Pinch-Test in regelmäßigen Abständen durch Drücken der Maus die Zehen und die Überprüfung für eine reflexive Reaktion auf die Anästhesie-Status überwachen.Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig vor Beginn der Operation betäubt. Hinweis: Bei längerer Imaging-Sitzungen, überprüfen Sie den Status der Anästhesie Maus regelmäßig, verwalten zusätzlichen KX wenn nötig.
- Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur während der Operation zu erhalten.
- Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einer Rasierklinge die Kopfhaut aus.
- Sterilisieren Sie die rasierte Fläche durch Abwischen der Haut mit Alkohol-Pads und Wechsel betadine. Entfernen Sie alle Resthaarabschnitten.
- Augensalbe, beide Augen zu schmieren vorsichtig anwenden, damit verhindert bleibende Schäden durch Austrocknung während des Experiments verursacht.
- Machen Sie einen geraden Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut, und bewegen Sie die Haut seitlich zu den Rändern des Schädels.
- Entfernen Sie das Bindegewebe am Schädel befestigt.
2. Verdünnt Schädel-Vorbereitung
- Identifizieren Sie den Abbildungsbereich auf Basis von ster. eotaxic Koordinaten Hinweis: Versuchen Sie, große Blutgefäße, die Blocklichteinfall zu vermeiden und verwischen die abgebildeten Strukturen. Gefäßsystem lässt sich am besten beobachten, wenn der Schädel ist feucht mit steriler Kochsalzlösung.
- Verwenden Sie den High-Speed-Mikrobohrer dünne einem kreisförmigen Bereich von Schädel (0,5 bis 1,0 mm Durchmesser). Bewegen Sie den Bohrer parallel zur Schädeloberfläche, anstatt hielt es gegen den Schädel und nach unten drücken. Drill, bis sowohl die äußere kompakte Knochenschicht und der Mittel spongiösen Knochenschicht entfernt werden. Hinweis: Um Schäden durch Überhitzung zu vermeiden, sollten längeren Kontakt zwischen dem Bohrmeißel und dem Schädel.
- Weiterhin Verdünnen des inneren kompakten Knochenschicht mit einer mikrochirurgischen Klinge in der Mitte der Drill verdünnten Bereich. Halten Sie die mikro Klinge in einem Winkel von etwa 45 ° um den Schädel ohne Niederdrücken gegen den Schädel, bis eine gleichmäßig verdünnte kleinen Bereich (200-300 &mgr; m Durchmesser) mit einer Dicke von ungefähr kratzenly 20-30 &mgr; m erhalten wird. . Aufgrund der Eigenfluoreszenz des Schädels, kann die Dicke durch Abtasten des Abstandes zwischen der oberen und unteren Oberfläche des Schädels unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop gemessen werden Hinweis: Obwohl ein Schädel Dicke von weniger als 20 um eine gute Bildqualität, es wird nicht empfohlen, weil es die Ausdünnungsprozess in nachfolgenden Re-Imaging-Sitzungen schwierig. Eine Überverdünnung zu verhindern, die Dicke des Schädels muß während der Operation periodisch überprüft werden (siehe Diskussion).
3. Immobilisierung
- Knochentrümmer vorsichtig entfernen.
- Setzen Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber an jeder Kante der Mittelöffnung der sterilen Kopfplatte, die seit autoklaviert hat (siehe Abbildung 1). Halten Sie die Kopfplatte fest gegen den Schädel mit dem verdünnten Bereich in der Mitte der Öffnung befindet Hinweis:. Wenn der Kleber verunreinigt die ausgedünnten region durch Unfall, entfernen Sie ihn vorsichtig mit der mikrochirurgischen Klinge.
- Ziehen Sie die Haut von den Seiten des Schädels, um die Kanten der Mittelöffnung der Kopfplatte.
- Warten Sie etwa 10 Minuten, bis die Kopfplatte ist gut mit dem Schädel befestigt.
- Legen Sie die Kopfplatte auf zwei Seitenblöcke der Halteplatte und die Schrauben über die Kanten der Kopfplatte festziehen, um die Maus auf der Halteplatte zu immobilisieren (siehe Abbildung 1). Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es keine Haut-oder Schnurrhaare zwischen die Kopfplatte und die Blöcke vor dem Anziehen der Schrauben. Eine gute Vorbereitung sollte immobilisierten keine beobachtbare Bewegung des Schädels unter dem Binokular zu zeigen, wenn der Rücken des Tieres streichelte sanft ist.
- . Spülen ausgesetzt Schädel mit Kochsalzlösung, um nicht polymerisierte Klebstoff entfernen Hinweis: Es ist wichtig, um alle verbleibenden Klebstoff zu entfernen, wie nichtpolymerisierten Leim verwischt Bilder und Schäden Mikroskopobjektive <./ Li>
4. Imaging
- Nehmen Sie ein Foto von dem Gefäßsystem des Schädels ausgesetzt mit der verdünnten Bereich als Karte ein, die verwendet wird, um die abgebildeten Region in den folgenden Imaging-Sitzungen zu verlegen (siehe Abbildung 2).
- Platzieren Sie die Maus unter dem Mikroskop Bildgebung. Suchen Sie den verdünnten Bereich unter einem 10X Luftziel mit Epi-Fluoreszenz und bewegen Sie den dünnsten Bereich in den Mittelpunkt der Ansicht.
- Fügen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf der Oberseite des Schädels und wechseln Sie in das 60X Objektiv, das mit sterilem Wasser gespült wurde. Wählen Sie eine Region, wo einzelne dendritische Dornen sind klar entlang Dendriten visualisiert. Identifizieren und beschriften Sie die entsprechende Region auf der Karte 1 durch den Vergleich zwischen der Gefäß epifluoreszenten Ansicht und der Gefäß Foto.
- Tune die Zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge nach der Fluorophore. Zum Beispiel 920 nm für YFP; 890 nm für GFP; 1000 nm für DsRed und tdTomato 24.
- Erwerben Bildstapeln mit 2um Schritte auf Verwendung des 60X Ziel der z-Achse. Dieses Bild Stapel umfasst eine ca. 200 um x 200 um Bereich (512 x 512 Pixel) und wird als Karte 2 für die Verlagerung bei der anschließenden Imaging-Sitzungen verwendet wird (siehe Abbildung 2).
- Erwerben neun Bildstapel in Karte 2 mit 3fach digitalem Zoom. Jeder Bildstapel umfasst eine Fläche von ungefähr 70 um x 70 um (512 x 512 Pixel), mit 0,7 &mgr; m Schritten längs der z-Achse. Hinweis: Die Intensität des Lasers sollte unter 40 mW, wenn an Proben gemessen, um Phototoxizität zu minimieren.
5. Rettung
- Nach der Bebilderung, sanft lösen Sie die Kopfplatte aus dem Schädel.
- Den Schädel und die Haut den ganzen restlichen Kleber entfernen, gründlich reinigen. Hinweis: Alle restlichen Kleber auf der Haut Reizungen verursachen und verlangsamen die Heilung der Haut, während der verbleibende Kleber auf dem Schädel wird die Erosion der Schädel und verursachen einengiogenesis in der neu gewachsenen Knochenschicht, so dass anschließende Umzug und Re-Imaging schwierig.
- Spülen Sie den Schädel und die Haut mit Kochsalzlösung mehrmals.
- Nähen Sie die Kopfhaut mit sterilen chirurgischen Naht.
- Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen in einem separaten Käfig. Verwalten Analgetikum Buprenorphin (0,1 mg / kg) subkutan an postoperativen Schmerzen zu mildern. Bringen Sie das Tier zum eigenen Käfig nach vollständiger Genesung. Überwachen Sie die Tier eng (mindestens einmal täglich kontrollieren), bis der Schnitt verheilt und Nähte entfernt werden. Verwalten folgenden Injektionen von Buprenorphin analgetisch, wenn nötig.
6. Reimaging
- Wiederholen Sie die Schritte 1,1-1,8.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6
- Suchen Sie zuvor abgebildeten Region durch den Vergleich der Gefäßmuster auf Karte 1 und die dendritische Verzweigungsmuster zu Karte 2.
- Wenn Re-Imaging wird innerhalb von 1 Woche durchgeführt, wiederholen Sie Schritt 2.3, um die dünne Schicht der neu gewachsenen Knochen auf dem ausgedünnten wieder entfernenRegion mit Hilfe der mikrochirurgischen Klinge. Wenn Re-Imaging wird nach mehr als 1 Woche durchgeführt, wiederholen Sie die Schritte sowohl 2.2 und 2.3. Hinweis: Die neu gewachsenen Knochenschicht besteht aus einem weniger kondensierten Struktur im Vergleich zum ursprünglichen kompakte Knochenschicht, was zu einer reduzierten Bildqualität. Deshalb, um die gleiche Qualität zu erwerben, ist es notwendig, dünne Schädel etwas mehr als der bisherige Bildgebungssitzung.
- Stellen Sie die Position und Ausrichtung zu Bildstapeln, die zuvor unter dem Bildstapel Zwei-Photonen-Mikroskop übereinstimmen erhalten.
- Bilder zu erfassen, wie in Schritt 4.6.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5 nach der Abbildung.
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Representative Results
In YFP-H Linie Mäusen 25 drückt gelb fluoreszierenden Proteins in einer Teilmenge der Schicht V pyramidalen Neuronen, die ihren apikalen Dendriten auf den oberflächlichen Schichten des Cortex projizieren. Durch den ausgedünnten Schädel Herstellung die fluoreszierend markierten dendritischen Segmente wiederholt unter Zwei-Photonen-Mikroskop über verschiedene Abbildungsintervalle abgebildet werden, im Bereich von Stunden bis Monaten. Hier zeigen wir ein Beispiel eines Vier-Zeitabbildung der gleichen Dendriten über 8 Tage im motorischen Cortex einer Maus 1 Monat alt, wo einzelne Dornen sowie Filopodien deutlich entlang der Dendriten visualisiert werden. In der Regel ist die Tiefe der Bildstapel ungefähr 100-200 &mgr; m von der Pia-Oberfläche. Verschiedene Analysen können auf der Grundlage dieser Bilder durchgeführt werden. Beispielsweise kann der Dorn Aufstellung Eliminierung und Umsatz durch Vergleichen von Bildern von verschiedenen Sitzungen quantifiziert werden. Wirbelsäule Dichte kann durch Teilen der Anzahl von Dornen durch die Länge der Dendrit berechnet werdenic-Segment. Veränderungen der Wirbelsäule Motilität und Morphologie können auch analysiert werden.
Abbildung 1. Maßgeschneiderte Immobilisierung Platten ausgedünnten Schädel Vorbereitung für die Zwei-Photonen-in-vivo-Bildgebung. (A) Ein Foto von der Kopfplatte, die aus zwei oder drei Rasierklingen zusammengeklebt, mit scharfen Kanten von Bändern überzogen wird. (B) Ein Foto von der Halteplatte, die von 1 Edelstahlplatte, 2 Edelstahl-Blöcke, 2 Schrauben und 2 Abstandhalter besteht.
Abbildung 2. Transkranielle Zwei-Photonen-Imaging durch einen ausgedünnten Schädel Vorbereitung in der Maus-motorischen Kortex,
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Discussion
Um eine erfolgreiche dünnten Schädel Präparat zu erhalten, sind mehrere Schritte in diesem Protokoll entscheidend. 1) Die Dicke des Schädels. Die Schädelknochen hat eine Sandwich-Struktur mit zwei Schichten aus kompaktem Knochen mit hoher Dichte und einer Mittelschicht aus Low-Density-spongiösen Knochen. Während der Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer ist geeignet zum Entfernen der äußeren Schichten der kompakte Knochen und spongiösen Knochen, ist die mikrochirurgische Klinge ideal zum Verdünnen des inneren Schicht aus kompaktem Knochen. Da die Dicke und Steifigkeit der während der Entwicklung der Schädel zunimmt, Abbildung von erwachsenen Mäusen erfordert mehr Knochen, um Bilder von guter Qualität zu erhalten, entfernt werden. Die ausgedünnten Bereich weist eine transparente Fest Aussehen und bietet eine gute Bildqualität, wenn die Dicke des Schädels ist etwa 20-30 um. Der Schädel Stärke sollte während der Verdünnungsprozess regelmäßig überprüft werden, wie über-Verdünnung macht die Ausdünnungsprozess in den folgenden Re-Imaging-Sitzungen schwierig. 2) Die Größe des dünnen Bereichs.Es ist wichtig, eine stabile dünnten Schädel-Konfiguration, wobei eine kegelförmige Hohlraum erreicht herzustellen. Die Architektur des verdünnten Bereich mit einer geeigneten Größe verhindert, dass Schäden an der Rinde und hilft Verdünnung in nachfolgenden Re-Imaging-Sitzungen. Es wird empfohlen, den Bodenbereich (etwa 200-300 &mgr; m im Durchmesser) des verdünnten Bereichs kleiner als die obere Öffnung (etwa 0,5-1,0 mm im Durchmesser) zu machen. 3) Die Stabilität der Bilder. Ein gut immobilisiert Vorbereitung hilft, die Bildqualität durch die Reduzierung der Atem-induzierten Bewegungsartefakten zu verbessern. Es ist wichtig, um den Schädel trocken und frei von Bindegewebe und Knochentrümmer zu halten, bevor die Kopfplatte auf dem Schädel befestigt. Extra-Kleber kann auch angewendet werden, um die verbleibenden Lücken zwischen der Kopfplatte und dem Schädel zu füllen. Außerdem Targeting eine Fläche von großen Gefäß minimiert auch die Bewegungen von Blut pumpt verursacht.
Untersuchung der Änderungen in den BHin der lebenden Tiere mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Zwei-Photonen-Mikroskopie erfordert die Erzeugung eines optischen Fenster. Neben den ausgedünnten Schädel Vorbereitung können fluoreszenzmarkierte Strukturen auch durch Entfernen der Schädel und mit einem Deckglas (in der Regel 3-5 mm im Durchmesser), die eine klare Bildfenster 10, 13 bietet ersetzen visualisiert werden. Während beide ausgedünnten Schädel-und Open-Schädel-Bildgebung Protokolle werden im Großen und Ganzen für in vivo-Imaging-Studien angewendet wird, hat jede Methode ihre Vor-und eignet sich für verschiedene experimentelle Designs. Zum Beispiel ist der offene Schädel Zubereitung nützlich für Studien, die relativ große Bereiche des Gehirns (z. B. Durchmesser von 5 mm) zu untersuchen und erfordern viele Bildgebungsvorgängen mit kurzen Intervallen (dh Tage). Sobald der Schädelfenster erfolgreich implantiert wird, ist keine weitere Operation erforderlich. Jedoch ist eine postoperative Zeitraum (üblicherweise etwa 1 Monat) vor der ersten Abbildungs erforderlichenSitzung, um mögliche Entzündungsreaktionen verursacht durch eine Operation zu verbessern. Bildwiedergabe unmöglich wird, wenn die Schädelfenster durch Nachwachsen des Knochens und / oder Verdickung der Meningen blockiert. Im Gegensatz dazu können die Tiere mit einem ausgedünnten Schädel Zubereitung unmittelbar nach der ersten Operation abgebildet werden, so dass es geeignet für die chronische Bildgebung von kleinen Tieren (z. B. 2 Wochen alt). Es ist geeignet für die Untersuchung mit bildgebenden langen Intervallen (dh Monate bis Jahre), da der Knochen nachwachsen und Dauer Verdickung ist nicht problematisch. Jedoch wird wieder Verdünnung der Schädel üblicherweise für nachfolgende Re-Imaging-Sitzungen erforderlich (auch mit 2-tägigen Intervallen) durch den Knochen nachwachsen. Darüber hinaus ist die neu gewachsenen Knochenschicht aus einem weniger kondensierte Struktur im Vergleich zu der ursprünglichen kompakten Knochens, die Transparenz des ausgedünnten Schädelbereich stark reduziert wird. Deshalb, um die gleiche Qualität der Bilder zu erhalten, ist es notwendig, die neu gewachsenen Knochenschicht vollständig zu entfernen. Und ein solchespaar Versuche der Regel auf die endgültige Dicke des Schädels in der nachfolgenden Abbildungs dünner als die vorherige Herstellung führen. Da der Schädel Dicke hatte in der Anfangsbildgebungssitzung auf 20-30 um hergestellt worden, so dass Raum für begrenzte Wiederverdünnung ist die Gesamtaufnahmezeiten von ausgedünnten Schädel Vorbereitung der Regel weniger als 5-mal. Kürzlich wurde eine neue experimentelle Ansatz namens poliert und verstärkt ausgedünnten Schädel (Ports) wurde entwickelt, um sowohl dünnten und Open-Schädel Vorbereitungen 11, 26, 27 zu kombinieren.
Bisher war die Mehrheit der in-vivo-Bildgebung in der Hirnrinde wurde durchgeführt unter Verwendung von transgenen Mauslinien EGFP oder YFP unter bestimmten neuronalen thy1 Promotor. Diese transgenen Mäuse exprimieren fluoreszierende Proteine dünn in einer Untergruppe, aber Mischpopulation von kortikalen Neuronen 25. Da viele Beweislinien legen nahe, dass erfahrungsabhängige strukturelle Plastizität passiert in selective Zelltypen von definierten Schaltungen ist es wichtig, in einer Zelltyp-spezifischen Weise zu beschriften und Bild. Bisher wurden viele Ansätze angewandt, um dieses Ziel zu erreichen. Zum Beispiel kann pyramidalen Neuronen in verschiedenen kortikalen Schichten durch die Durchführung in utero Elektroporation in definierten Embryonalstadien 28, 29 ausgerichtet sein. In ähnlicher Weise kann der Einspritz virale Vektoren entwickelt, um ein Fluoreszenzprotein exprimieren, auch verwendet, um Zellen in verschiedenen Hirnregionen 30 zu markieren. Darüber hinaus sind viele Linien transgener Mäuse erzeugt wurden, um die Expression von Cre-Rekombinase unter Zelltyp-spezifische Promotoren 31, 32 anzutreiben. Injektion von viralen Vektoren, wie Adeno-assoziierter Virus, fluoreszierenden Reportergens nach einem floxed Stopcodon in diesen Mäusen die Möglichkeit, eine bestimmte Klasse von Neuronen in einem begrenzten Bereich 33 zielen. Durch die Kombination dieser neuen Kennzeichnungs Ansätze mit unserem ausgedünnten sKull Zubereitung, Änderungen in der synaptischen Verbindungen von kortikalen Neuronen durch Zwei-Photonen-Bildgebung in vivo in einem Zelltyp-und / oder schaltungsspezifischen Weise untersucht werden.
Mit der zunehmenden Verfügbarkeit von transgenen Tieren mit fluoreszierend markierten Zellpopulationen und schnelle Entwicklung der in-vivo-Markierungstechniken, wie hier beschriebenen Verfahren können auch angewendet werden, um andere Zelltypen (Gliazellen) und Gefäßsystem im lebenden Gehirn zu untersuchen. In Kombination mit Verhaltens Manipulationen und Krankheitsmodelle, Zwei-Photonen-in-vivo-Bildgebung wird unser Verständnis der molekularen, zellulären und Schaltmechanismen zugrunde liegenden Gehirnfunktionen erheblich erweitern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir danken James Perna für die grafische Darstellung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Mental Health, um YZ unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
References
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
- Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
- Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
- Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
- Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
- Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
- Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
- Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
- Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
- Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
- Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).
