Abstract
En la corteza de los mamíferos, las neuronas forman redes muy complicadas y el intercambio de información en las sinapsis. Los cambios en la fuerza sináptica, así como la adición / eliminación de sinapsis, se producen de una manera dependiente de la experiencia, que proporciona la base estructural de la plasticidad neuronal. Como componentes postsinápticos de las sinapsis excitatorias más en la corteza, las espinas dendríticas se considera que son un buen indicador de las sinapsis. Tomando ventajas de la genética del ratón y técnicas de marcaje fluorescente, neuronas individuales y de sus estructuras sinápticas pueden ser etiquetados en el cerebro intacto. Aquí presentamos un protocolo de imágenes transcraneal utilizando dos fotones microscopía de escaneo láser para seguir la etiqueta fluorescente espinas dendríticas postsináptica a través del tiempo en vivo. Este protocolo utiliza una preparación de cráneo adelgazado, que mantiene el cráneo intacto y evita efectos inflamatorios causados por la exposición de las meninges y la corteza. Por lo tanto, las imágenes pueden ser adquiridas inmediatamente después dose realiza rgery. El procedimiento experimental se puede realizar de forma repetitiva durante diversos intervalos de tiempo que van desde horas hasta años. La aplicación de esta preparación también se puede ampliar para investigar diferentes regiones y capas corticales, así como otros tipos de células, en condiciones fisiológicas y patológicas.
Introduction
La corteza de los mamíferos participa en muchas funciones cerebrales, de la percepción sensorial y el movimiento de control de abstraer el procesamiento de información y la cognición. Varias funciones corticales se basan en diferentes circuitos neuronales, que se componen de diferentes tipos de neuronas que se comunican e intercambian información en las sinapsis individuales. La estructura y la función de las sinapsis están siendo modificados constantemente en respuesta a las experiencias y patologías. En el cerebro maduro, la plasticidad sináptica toma la forma de ambos cambios de resistencia y la adición / eliminación de sinapsis, que juega un papel importante en la formación y mantenimiento de un circuito neuronal funcional. Las espinas dendríticas son los componentes postsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitadoras en el cerebro de los mamíferos. La constante rotación y los cambios morfológicos de las espinas se cree que servirá como un buen indicador de las modificaciones en las conexiones sinápticas 1-7.
Dos fotones de escaneo láser microscopy ofrece una penetración profunda a través, preparaciones opacas gruesas y baja fototoxicidad, que lo hace adecuado para las imágenes en directo en el cerebro intacto 8. En combinación con marcaje fluorescente, dos fotones de imágenes proporciona una poderosa herramienta para mirar en el cerebro vivo y siga reorganización estructural en las sinapsis individuales con alta resolución espacial y temporal. Varios métodos han sido utilizados para preparar los ratones para formación de imágenes en vivo 9-13. Aquí se describe una preparación de cráneo adelgazado de imágenes in vivo de dos fotones para investigar la plasticidad estructural de las espinas dendríticas postsinápticos en la corteza del ratón. Con este enfoque, los estudios recientes han representado una imagen dinámica de los cambios de la espina dendrítica en respuesta a las habilidades motoras de aprendizaje Con el aumento de la disponibilidad de animales transgénicos con subconjuntos neuronales marcados con fluorescencia y el rápido desarrollo de las técnicas in vivo de etiquetado, los procedimientos similares a los descritos aquí se pueden aplicar también de investigaciónTE otros tipos de células y regiones corticales, en combinación con otras manipulaciones, así como se utiliza en modelos de enfermedad 16-23.
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Protocol
Aprobación necesita ser obtenido de instituciones de origen antes del inicio de la cirugía y estudio de imágenes. Los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos de la Universidad de California, Santa Cruz Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
1. Cirugía
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y esterilizar el área de trabajo con un 70% de alcohol a fondo antes de la cirugía.
- Se anestesia el ratón por inyección intraperitoneal (IP) de solución anestésica KX (200 mg / kg de ketamina y 20 mg / kg de xilazina) de acuerdo con el peso corporal del ratón Nota:. Dosificación KX puede ser ajustado de acuerdo a la cepa, edad, y estado de salud de los ratones. También se recomienda la consulta veterinaria para determinar la dosis óptima.
- Realice una prueba de toe-pinch periódicamente presionando los dedos del ratón y de la comprobación de una respuesta refleja para supervisar el estado de anestesia.Asegúrese de que el ratón esté totalmente anestesiado antes de iniciar la cirugía Nota:. Durante las sesiones de formación de imágenes prolongados, comprobar el estado de la anestesia del ratón periódicamente, administrar KX adicional si es necesario.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo durante la cirugía.
- Afeitarse la cabeza del ratón utilizando una hoja de afeitar para exponer el cuero cabelludo.
- Esterilizar el área afeitada limpiando la piel con la alternancia de algodón con alcohol y betadine. Retire todos los recortes de pelo residuales.
- Aplique suavemente ungüento para los ojos para lubricar los dos ojos, por lo tanto, la prevención del daño permanente causado por la deshidratación durante el experimento.
- Hacer una incisión recta a lo largo de la línea media del cuero cabelludo, y mover la piel lateralmente hacia los bordes del cráneo.
- Retire el tejido conectivo unido al cráneo.
2. Diluido-cráneo Preparación
- Identificar la región de imagen basada en ster. coordenadas eotaxic Nota: Trate de evitar los grandes vasos sanguíneos, lo que la penetración de luz bloque y difuminar las estructuras proyectadas. Se observa mejor vasculatura cuando el cráneo es húmeda con solución salina estéril.
- Utilice el micro taladro de alta velocidad para diluir una región circular de cráneo (0,5-1,0 mm de diámetro). Mueva el taladro paralelo a la superficie del cráneo, en vez de sostener contra el cráneo y presionando hacia abajo. Taladro hasta tanto la capa de hueso compacto exterior y la capa esponjosa media se eliminan Nota:. Para evitar daños causados por el sobrecalentamiento, evitar el contacto prolongado entre la broca y el cráneo.
- Continuar el adelgazamiento de la capa de hueso compacto interior con una cuchilla microquirúrgica en el centro de la región de perforación-adelgazado. Mantenga la cuchilla microquirúrgica en un ángulo de aproximadamente 45 ° para raspar el cráneo sin presionar hacia abajo contra el cráneo hasta que un afinado de manera uniforme pequeña región (200-300 micras de diámetro) con un espesor de aproximadase obtiene LY 20-30 micras. Debido a la auto-fluorescencia del cráneo, el espesor se puede medir mediante el escaneo de la distancia entre la superficie superior e inferior del cráneo bajo el microscopio de dos fotones Nota:. Aunque un espesor cráneo de menos de 20 micras proporciona una buena calidad de imagen, no es recomendable porque hace que el proceso de adelgazamiento en posteriores sesiones de re-proyección de imagen difícil. Para evitar el exceso de adelgazamiento, el espesor del cráneo necesita ser comprobada periódicamente durante la cirugía (ver Discusión).
3. Inmovilización
- Retire con cuidado los restos de los huesos.
- Coloque una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato en cada borde de la abertura central de la placa de cabeza estéril, que ha sido tratado en autoclave (véase la Figura 1). Mantenga la placa de cabeza firmemente contra el cráneo con la región adelgazada situado en el centro de la abertura Nota:. Si el pegamento contamina el R adelgazadaegión por accidente, retire con cuidado con la cuchilla microquirúrgica.
- Tire suavemente de la piel de los lados del cráneo hasta los bordes de la abertura central de la placa de cabeza.
- Espere aproximadamente 10 minutos hasta que la placa de cabeza está bien adherida al cráneo.
- Coloque la placa de cabeza en dos bloques laterales de la placa de sujeción y apriete los tornillos en los bordes de la placa de cabeza para inmovilizar el ratón sobre la placa de sujeción (véase la Figura 1) Nota:. Asegúrese de que no hay piel o los bigotes entre la placa de cabeza y los bloques antes de apretar los tornillos. Una buena preparación inmovilizada no debe mostrar ningún movimiento observable del cráneo bajo el microscopio de disección cuando la parte posterior del animal se dio unos golpecitos suavemente.
- . Enjuagar el cráneo expuesto con solución salina para eliminar el pegamento no polimerizado Nota: Es importante eliminar cualquier pegamento restante, como pegamento no polimerizado difumina las imágenes y los daños objetivos de microscopio <./ Li>
4. Imaging
- Tome una foto de la vasculatura del cráneo expuesta con la región adelgazada como mapa 1, que se utiliza para la ubicación de la zona visualizada en las sesiones de formación de imágenes posteriores (véase la Figura 2).
- Coloque el ratón bajo el microscopio de formación de imágenes. Ubicar la zona adelgazada bajo un objetivo de aire 10 veces usando epifluorescencia y mover el área más delgada para el centro de la vista.
- Añadir una gota de solución salina en la parte superior del cráneo y cambiar a la objetivo 60X, que ha sido enjuagado con agua estéril. Seleccione una región donde las espinas dendríticas individuales están claramente visualizadas junto dendritas. Identificar y etiquetar la región correspondiente en el mapa 1 comparando vasculatura entre la vista de epifluorescencia y la foto vasculatura.
- Sintonice la longitud de onda del láser de dos fotones de acuerdo con los fluoróforos. Por ejemplo, 920 nm para YFP; 890 nm para GFP; 1000 nm para DsRed y tdTomato 24.
- Adquirir pilas de imágenes con 2pasos micras a lo largo del eje z usando el objetivo 60X. Esta pila de imagen cubre un área de 200 x micras aproximadamente 200 micras (512 x 512 píxeles) y se utiliza como mapa 2 para el traslado durante las sesiones de formación de imágenes posteriores (véase la Figura 2).
- Adquirir nueve pilas de imágenes en el mapa 2 se utiliza el zoom digital de 3X. Cada pila de imagen cubre un área aproximada de 70 m x 70 m (512 x 512 píxeles), con 0,7 m pasos a lo largo del eje z Nota:. La intensidad del láser debe estar por debajo de 40 mW cuando se mide en muestras para reducir al mínimo la fototoxicidad.
5. Recuperación
- Tras las imágenes, separe con cuidado la placa de cabeza del cráneo.
- Limpiar a fondo el cráneo y la piel para eliminar todo el pegamento restante Nota:. Cualquier pegamento que queda en la piel causará irritaciones y retrasar la cicatrización de la piel, mientras que el pegamento que queda en el cráneo provocará la erosión del cráneo y unngiogenesis en la capa de hueso recién crecido, por lo que la posterior reubicación y reconstrucción de imagen difícil.
- Enjuague el cráneo y la piel con solución salina varias veces.
- Suturar el cuero cabelludo con sutura quirúrgica estéril.
- Mantenga al animal en una almohadilla térmica en una jaula separada. Administrar analgésico buprenorfina (0,1 mg / kg) por vía subcutánea para mitigar el dolor post-operatorio. Volver al animal a la jaula después de la recuperación completa. Vigilar estrechamente el animal (marque al menos una vez al día) hasta que la incisión haya sanado y se retiran las suturas. Administrar las inyecciones posteriores de buprenorfina analgésica si es necesario.
6. Creación de imágenes
- Repita los pasos 1.1 a 1.8.
- Repita los pasos 3.1 a 3.6
- Localice región previamente fotografiado al comparar el patrón de vascularización a Mapa 1 y el patrón de ramificación dendrítica a Mapa 2.
- Si se realiza la creación de las imágenes dentro de 1 semana, repita el paso 2.3 para quitar la fina capa de hueso recién crecido en la parte superior de la re adelgazadaregión utilizando la cuchilla microquirúrgica. Si reimaging se realiza después de más de 1 semana, repita los pasos tanto de 2.2 y 2.3 Nota:. La capa de hueso recién crecido consiste en una estructura menos condensada en comparación con la capa de hueso compacto original, que conduce a una menor calidad de imagen. Por lo tanto, para adquirir la misma calidad, es necesario diluir el cráneo ligeramente más de la sesión de formación de imágenes anterior.
- Ajuste la posición y la orientación para obtener pilas de imágenes que coinciden previamente tomadas pilas de imágenes en el microscopio de dos fotones.
- Adquirir imágenes como en el paso 4.6.
- Repita los pasos 5.1 a 5.5 después de la impresión.
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Representative Results
En YFP-H línea de ratones 25, proteína fluorescente amarilla expresa en un subconjunto de neuronas piramidales capa de V, que se proyectan sus dendritas apicales de las capas superficiales de la corteza. A través de la preparación de calavera adelgazado, los segmentos dendríticas marcados con fluorescencia pueden ser repetitivamente reflejados bajo el microscopio de dos fotones a través de varios intervalos de formación de imágenes, que van desde horas a meses. Aquí se muestra un ejemplo de una imagen en cuatro ocasiones de las mismas dendritas más de 8 días en la corteza motora de un ratón 1 mes de edad, donde las espinas individuales, así como filopodios se pueden visualizar claramente a lo largo de la dendrita. Por lo general, la profundidad de las pilas de imágenes es de aproximadamente 100 a 200 micras de la superficie pial. Varios análisis se pueden realizar sobre la base de estas imágenes. Por ejemplo, la formación de la columna vertebral, la eliminación y la rotación se pueden cuantificar mediante la comparación de imágenes a partir de diferentes sesiones. Densidad de la espina puede calcularse dividiendo el número de espinas por la longitud de la dendritsegmento de IC. Los cambios de la motilidad y la morfología de la columna vertebral también se pueden analizar.
Figura 1. Planchas de inmovilización por encargo de la preparación de calavera adelgazado por dos fotones de imágenes in vivo. (A) Una fotografía de la placa de la cabeza, que se compone de dos o tres hojas de afeitar pegadas entre sí, con los bordes afilados cubiertos por cintas. (B) Una fotografía de la placa de sujeción, que consiste en 1 placa de acero inoxidable, a 2 cuadras de acero inoxidable, 2 tornillos y 2 espaciadores.
Figura 2. Transcraneal dos fotones de imágenes a través de una preparación de cráneo adelgazado en la corteza motora del ratón,
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Discussion
Para obtener una exitosa preparación de calavera adelgazado, varios pasos de este protocolo son cruciales. 1) El espesor del cráneo. El hueso craneal tiene una estructura de sándwich, con dos capas de hueso compacto de alta densidad y una capa intermedia de hueso esponjoso de baja densidad. Mientras que el micro taladro de alta velocidad es adecuado para la eliminación de las capas externas de hueso compacto y el hueso esponjoso, la cuchilla microquirúrgica es ideal para el adelgazamiento de la capa interior de hueso compacto. Como el espesor y la rigidez del cráneo aumenta durante el desarrollo, de formación de imágenes de ratones adultos requiere más hueso que ser eliminado con el fin de obtener imágenes de buena calidad. La zona adelgazada exhibe un aspecto sólido transparente y proporciona una buena calidad de imagen cuando el espesor del cráneo es de aproximadamente 20-30 micras. El espesor del cráneo debe ser revisado periódicamente durante el proceso de adelgazamiento como el exceso de adelgazamiento hace que el proceso de adelgazamiento en las sesiones de creación de imágenes posteriores difícil. 2) El tamaño de la región adelgazada.Es importante establecer una configuración de cráneo adelgazado estable, donde se consigue una cavidad en forma de cono. La arquitectura de la región adelgazada con un tamaño adecuado evita causar daños a la corteza y ayuda adelgazamiento en posteriores sesiones de re-formación de imágenes. Se recomienda para hacer el área inferior (aproximadamente 200-300 micras de diámetro) de la región adelgazada más pequeño que la abertura superior (aproximadamente 0,5-1,0 mm de diámetro). 3) La estabilidad de las imágenes. Una preparación así inmovilizada-ayuda a mejorar la calidad de la imagen mediante la reducción de artefactos de movimiento inducida respiratorias-. Es importante mantener el cráneo seco y desprovisto de tejido conectivo y restos de hueso antes de que la placa de cabeza está unida en al cráneo. El pegamento adicional también se puede aplicar para llenar los vacíos que quedan entre la placa de cabeza y el cráneo. Además, apuntando a una zona alejada de grandes vasos también minimiza los movimientos provocados por el bombeo de la sangre.
Investigación de los cambios en el sujetadoren los animales con una alta resolución espacial y temporal utilizando microscopía de dos fotones viviendo requiere la generación de una ventana óptica. Además de la preparación de calavera adelgazado, estructuras marcados con fluorescencia también se pueden visualizar mediante la eliminación de la calavera y su sustitución por una cubierta de vidrio (generalmente de 3-5 mm de diámetro) que proporciona una ventana de proyección de imagen clara 10, 13. Mientras tanto adelgazado-cráneo y protocolos de formación de imágenes de cráneo abierto se aplican ampliamente para estudios in vivo de imágenes, cada método tiene sus propias ventajas y es adecuado para diferentes diseños experimentales. Por ejemplo, la preparación y el cráneo abierto es útil para los estudios que investigan relativamente grandes áreas del cerebro (por ejemplo, de diámetro 5 mm) y requieren muchas sesiones de formación de imágenes con intervalos cortos (por ejemplo, días). Una vez que la ventana del cráneo se implanta con éxito, no se requiere cirugía adicional. Sin embargo, se requiere un período posterior a la cirugía (por lo general de aproximadamente 1 mes) antes de la primera proyección de imagensesión para mejorar posibles respuestas inflamatorias causadas por la cirugía. Reconstrucción de imagen se vuelve imposible cuando la ventana craneal está bloqueado por el nuevo crecimiento del hueso y / o engrosamiento de las meninges. En contraste, los animales con una preparación de cráneo adelgazado se pueden obtener imágenes inmediatamente después de la cirugía inicial, por lo que es más adecuado para la formación de imágenes crónica de los animales más jóvenes (por ejemplo, 2 semanas de edad). Es conveniente para la investigación con intervalos largos de imagen (es decir, meses o años), ya que el nuevo crecimiento del hueso y duramadre engrosamiento no es problemático. Sin embargo, re-adelgazamiento del cráneo suele ser necesaria para posteriores sesiones de re-proyección de imagen (incluso con 2 días de intervalo), debido a la regeneración ósea. Por otra parte, la capa de hueso recién crecido consiste en una estructura menos condensada en comparación con el hueso compacto original, reduciendo en gran medida la transparencia de la región cráneo-adelgazado. Por lo tanto, para adquirir la misma calidad de las imágenes, es necesario para eliminar completamente la capa de hueso recién crecido. Y talttempts por lo general conducen a el espesor final del cráneo en la formación de imágenes posterior más delgada que la preparación anterior. Dado que el grosor del cráneo se había preparado a 20-30 micras en la sesión inicial de formación de imágenes, dejando poco espacio para re-adelgazamiento, los tiempos totales de imagen de la preparación de calavera adelgazado es por lo general menos de 5 veces. Recientemente, un nuevo enfoque experimental llamado pulido y reforzado adelgazado-skull (puertos) se ha desarrollado para combinar ambas preparaciones adelgazadas-and-cráneo abierto 11, 26, 27.
Hasta ahora, la mayoría de imágenes in vivo en la corteza se ha realizado utilizando líneas de ratones transgénicos que expresan EGFP o YFP bajo neuronal promotor Thy1 específica. Estos ratones transgénicos expresan proteínas fluorescentes escasamente en un subconjunto, pero población mixta de neuronas corticales 25. Dado que muchas líneas de evidencia sugieren que la experiencia que dependen de la plasticidad estructural que ocurre en seletipos de células ctive de circuitos bien definidos, lo que es importante para etiquetar y la imagen de una manera específica del tipo de célula. Hasta la fecha, se han aplicado muchos métodos para lograr este objetivo. Por ejemplo, las neuronas piramidales en diferentes capas corticales pueden ser objetivo de actuar en el útero de la electroporación en etapas embrionarias definidos 28, 29. Del mismo modo, la inyección de vectores virales ingeniería genética para expresar una proteína fluorescente también se puede utilizar para marcar las células en diferentes regiones del cerebro 30. Además, muchas líneas de ratones transgénicos que se han generado para conducir la expresión de la recombinasa Cre bajo promotores específicos del tipo de célula 31, 32. La inyección de vectores virales tales como virus adeno-asociado realización gen reportero fluorescente después de un codón de parada floxed en estos ratones ofrece la posibilidad de apuntar a una clase especificada de las neuronas en una región restringida 33. Mediante la combinación de estos nuevos enfoques de etiquetado con nuestra-s adelgazadopreparación Kull, cambios en las conexiones sinápticas de las neuronas corticales se puede investigar por dos fotones de imágenes in vivo en un tipo de células-y / o de manera específica-circuito.
Con la creciente disponibilidad de animales transgénicos con poblaciones de células marcadas fluorescentemente y rápido desarrollo de las técnicas in vivo de etiquetado, procedimientos similares descritos aquí también se pueden aplicar para investigar otros tipos de células (células gliales) y la vasculatura en el cerebro vivo. Combinado con las manipulaciones de comportamiento y modelos de enfermedad, de dos fotones de imágenes in vivo se expandirá enormemente nuestra comprensión de los mecanismos moleculares, celulares y circuitos subyacentes funciones cerebrales.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a James Perna para la ilustración gráfica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud Mental a YZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
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