Abstract
No córtex dos mamíferos, os neurônios formam redes extremamente complicadas e troca de informações nas sinapses. As alterações na concentração sináptica, bem como a adição / remoção de sinapses, ocorrem de uma forma dependente da experiência, fornecendo a base estrutural de plasticidade neuronal. Como componentes pós-sinápticas das sinapses excitatórias mais no córtex, espinhas dendríticas são consideradas como um bom indicador de sinapses. Tirar vantagens da genética e técnicas de rotulagem fluorescentes, neurônios individuais e suas estruturas sinápticas podem ser rotuladas no cérebro intacto. Aqui apresentamos um protocolo de imagem transcraniana por microscopia de varredura a laser de dois fótons de seguir fluorescente etiquetado espinhas dendríticas pós-sinápticos ao longo do tempo in vivo. Esse protocolo utiliza uma preparação diluída de caveira, que mantém o crânio intactos e evita efeitos inflamatórios provocados pela exposição das meninges e o córtex. Assim, as imagens podem ser adquiridas imediatamente após surgery é realizada. O procedimento experimental pode ser realizado repetidamente durante vários intervalos de tempo variando de horas a anos. A aplicação desta preparação também pode ser expandido para investigar diferentes regiões e camadas corticais, bem como outros tipos de células, em condições fisiológicas e patológicas.
Introduction
O córtex dos mamíferos participa em muitas funções do cérebro, desde o controle da percepção e movimento sensorial abstrair processamento de informação e cognição. Várias funções corticais construir sobre diferentes circuitos neurais, que são feitas de diferentes tipos de neurônios se comunicando e trocando informações nas sinapses individuais. A estrutura e função das sinapses são constantemente a ser modificados em resposta a experiências e patologias. No cérebro maduro, plasticidade sináptica toma a forma de ambas as mudanças de força e adição / remoção de sinapses, jogando um papel importante na formação e manutenção de um circuito neural funcional. As espinhas dendríticas são as componentes pós-sinápticos da maioria das sinapses excitatórias no cérebro de mamíferos. O volume de negócios constante e alterações morfológicas de espinhos são acreditados para servir como um bom indicador de modificações nas conexões sinápticas 1-7.
Dois fótons micro varredura a laserscopy oferece penetração profunda através, preparações espessas e opacas baixo fototoxicidade, o que o torna adequado para imagens ao vivo no cérebro intacto 8. Em combinação com marcação fluorescente, dois fótons de imagem fornece uma ferramenta poderosa para espreitar para o cérebro vivo e siga reorganização estrutural nas sinapses individuais com alta resolução espacial e resolução temporal. Vários métodos têm sido usados para preparar os ratos para imagens ao vivo 9-13. Aqui, descrevemos uma preparação diluída crânio-in vivo de dois fótons de imagem para investigar a plasticidade estrutural das espinhas dendríticas pós-sinápticos no córtex mouse. Usando essa abordagem, os nossos estudos recentes têm representado uma imagem dinâmica de alterações da coluna dendríticas em resposta a habilidade motora aprendendo Com o aumento da disponibilidade de animais transgênicos com subconjuntos de neurônios marcados com fluorescência e rápido desenvolvimento de técnicas in vivo de rotulagem, procedimentos semelhantes descritos aqui também pode ser aplicado para investigaçõesoutros tipos de células e de te regiões corticais, combinadas com outras manipulações, bem como os utilizados em modelos de doenças 16-23.
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Protocol
Aprovação deve ser obtida a partir de instituições de origem antes do início da cirurgia e estudo de imagem. Experimentos descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos da Universidade da Califórnia, em Santa Cruz Institutional Animal Care e do Comitê Use.
1. Cirurgia
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e esterilizar o espaço de trabalho com 70% de álcool completamente antes da cirurgia.
- Anestesiar o rato por intraperitoneal (IP) a injeção de solução anestésica KX (200 mg / kg de ketamina e 20 mg / kg de xilazina) de acordo com o peso corporal do rato Nota:. KX dose pode ser ajustada de acordo com a cepa, a idade eo estado de saúde dos ratos. Veterinária consulta para determinar a dose óptima é também recomendado.
- Realizar um teste toe-pitada periodicamente, pressionando os dedos do rato e verificação de uma resposta reflexa para monitorar o estado de anestesia.Certifique-se de que o mouse está totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia Nota:. Durante as sessões de imagem prolongados, verificar o estado de anestesia do rato periodicamente, administrar KX adicional se necessário.
- Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo durante a cirurgia.
- Raspar a cabeça do rato usando uma lâmina de barbear para expor o couro cabeludo.
- Esterilizar a área raspada, limpando a pele com a alternância de compressas embebidas em álcool e betadine. Remova todos os recortes de cabelo residuais.
- Gentilmente aplicar pomada para lubrificar os olhos, prevenindo danos permanentes causados pela desidratação durante o experimento.
- Fazer uma incisão em frente ao longo da linha média do couro cabeludo, e mover-se lateralmente para a pele das bordas do crânio.
- Remover o tecido conectivo anexado ao crânio.
2. Diluído crânio-Preparação
- Identificar a região de imagem baseado em ster. coordenadas eotaxic Nota: Tente evitar grandes vasos sanguíneos, que a penetração da luz do bloco e esbater as estruturas fotografadas. Vasculatura é melhor observado quando o crânio é úmido com solução salina estéril.
- Utilize o micro broca de alta velocidade para diluir uma região circular de crânio (0,5-1,0 mm de diâmetro). Mover a broca paralela à superfície do crânio, em vez de segurar o contra o crânio e pressionando para baixo. Broca até tanto a camada de osso compacto exterior ea camada de osso esponjoso meio são removidos Nota:. Para evitar danos causados por superaquecimento, evitar o contato prolongado entre a broca eo crânio.
- Continuar desbaste da camada interna do osso compacto com uma lâmina microcirúrgica no centro da região de desbaste-broca. Segurar a lâmina microcirúrgica a um ângulo de aproximadamente 45 ° para raspar o crânio sem pressionar contra o crânio até uma uniformemente diluído pequena região (200-300 mM de diâmetro) com uma espessura de aproximadamentely 20-30 mM é obtido. Devido à auto-fluorescência do crânio, a espessura pode ser medida por digitalizar a distância entre a superfície superior e inferior do crânio sob o microscópio de dois fotões Nota:. Embora uma espessura do crânio de menos de 20 mM proporciona uma boa qualidade de imagem, não é recomendado, porque torna o processo de afinamento em sessões de re-imagem subseqüentes difícil. Para evitar o excesso de desbaste, a espessura do crânio precisa ser verificado periodicamente durante a cirurgia (ver Discussão).
3. Imobilização
- Remova cuidadosamente os restos de osso.
- Colocar uma pequena gota de cola de cianoacrilato sobre cada extremidade da abertura central da placa de cabeça estéril, que foi autoclavado (ver Figura 1). Manter a placa de cabeça firmemente contra o crânio com a região adelgaçada localizada no centro da abertura Nota:. Se a cola contamina o r diluídoegion por acidente, remova-a com cuidado com a lâmina de microcirurgia.
- Suavemente puxar a pele a partir dos lados do crânio para os bordos da abertura central da placa de cabeça.
- Espera aproximadamente 10 min, até que a placa de cabeça é também ligado ao crânio.
- Coloque a placa de cabeça em dois blocos laterais da placa de retenção e, em seguida, aperte os parafusos ao longo das bordas da placa de cabeça para imobilizar o mouse sobre a placa de retenção (ver Figura 1) Nota:. Certifique-se de que não existe pele ou bigodes entre a placa de cabeça e os blocos antes de apertar os parafusos. Uma boa preparação imobilizada não deve apresentar movimento observável do crânio sob o microscópio de dissecação, quando a parte de trás do animal é afagou suavemente.
- . Lavar o crânio exposto com solução salina para remover cola não polimerizada Nota: É importante remover qualquer cola restante, como cola não polimerizada borra imagens e danos microscópio objetivos <./ Li>
4. Imagem
- Tire uma foto da vasculatura do crânio exposta com a região diluído como Mapa 1, que é usado para mudar a região fotografada em sessões de imagem subseqüentes (ver Figura 2).
- Posicione o mouse sob o microscópio de imagem. Localize a área diluído sob um objetivo ar 10X utilizando epifluorescência e mover a área mais fino do centro da vista.
- Adicionar uma gota de solução salina no topo do crânio e mudar para o objectivo 60X, que tenha sido lavado com água esterilizada. Selecione uma região onde espinhas dendríticas individuais são claramente visualizado juntamente dendritos. Identificar e rotular a região correspondente no mapa 1, comparando vasculatura entre a visão de epifluorescência ea foto vasculatura.
- Ajustar o comprimento de onda do laser de dois fotões de acordo com os fluoróforos. Por exemplo, 920 nm para YFP; 890 nm para GFP; 1.000 nm para DsRed e tdTomato 24.
- Adquira pilhas de imagens com 2passos iM ao longo do eixo z com o objectivo de 60X. Esta pilha imagem cobre uma área de 200 x mM mM de aproximadamente 200 (512 x 512 pixels) e é usado como mapa 2 para o internamento durante as sessões de imagem subseqüentes (ver Figura 2).
- Adquirir nove pilhas de imagens dentro de mapa 2 usando o zoom digital de 3X. Cada pilha de cobre uma área aproximada de 70 um x 70 um (512 x 512 pixels), com 0,7 mM etapas ao longo do eixo-z Nota:. A intensidade do laser deve ser inferior a 40 mW, quando medido em amostras de minimizar fototoxicidade.
5. Recuperação
- Na sequência de imagens, retire cuidadosamente a placa da cabeça do crânio.
- Limpe bem o crânio ea pele para remover toda a cola restante Nota:. Qualquer cola remanescente na pele causará irritação e retardar a cicatrização da pele, enquanto que qualquer cola restante no crânio causará erosão do crânio e umangiogenesis na camada óssea recém-crescido, fazendo realocação subseqüente e re-imaging difícil.
- Lavar o crânio ea pele várias vezes com solução salina.
- Suture o couro cabeludo com sutura cirúrgica estéril.
- Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento em uma gaiola separada. Administrar analgésico buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea para mitigar a dor pós-operatória. Devolver o animal para a gaiola para casa após recuperação completa. Monitorar o animal de perto (verifique pelo menos uma vez por dia) até que a incisão é curado e suturas são removidas. Administrar injeções subseqüentes de buprenorfina analgésico, se necessário.
6. Re-imagem
- Repita os passos de 1,1-1,8.
- Repita os passos de 3,1-3,6
- Localize região anteriormente imaginado, comparando o padrão de vascularização ao Mapa 1 eo padrão dendrítico ramo ao Mapa 2.
- Se recriação é realizada dentro de 1 semana, repetir o passo 2.3 para remover uma fina camada de tecido ósseo recém-cultivadas no topo da re afinadagião usando a lâmina microcirúrgica. Se recriação é realizada depois de mais de uma semana, repetir os passos tanto 2.2 e 2.3 Nota:. A camada de osso recentemente crescido consiste de uma estrutura menos condensada em comparação com a camada de osso original compacto, levando a uma redução da qualidade da imagem. Portanto, para obter a mesma qualidade, é necessário diluir o crânio ligeiramente mais do que a sessão de imagem anterior.
- Ajuste a posição e orientação para obter pilhas de imagens que correspondem anteriormente tomadas pilhas de imagens sob o microscópio de dois fotões.
- Adquirir imagens como no Passo 4.6.
- Repita os passos de 5,1-5,5 após imagem.
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Representative Results
Em YFP-H linha de camundongos 25, proteína fluorescente amarela expressa em um subconjunto de neurônios piramidais da camada V, que projetam seus dendritos apicais para as camadas superficiais do córtex. Através da preparação diluída de caveira, os segmentos dendríticas fluorescentemente marcadas podem ser repetitivamente trabalhada sob microscópio de dois fotões durante vários intervalos de imagem, variando de horas a meses. Aqui, mostramos um exemplo de uma imagem de quatro vezes as mesmas dendritos mais de 8 dias no córtex motor de um rato de 1 mês de idade, onde espinhas individuais, bem como filopodios pode ser claramente visualizadas ao longo do dendrito. Geralmente, a profundidade de pilhas de imagem é de cerca de 100-200 mM de superfície pial. Várias análises podem ser realizadas com base nessas imagens. Por exemplo, a formação da coluna, de eliminação e de rotação pode ser quantificada por comparação de imagens de diferentes sessões. Densidade Spine pode ser calculado dividindo-se o número de espinhos por o comprimento do dendritsegmento ic. As alterações da motilidade e morfologia da coluna também pode ser analisado.
Figura 1. Placas de imobilização sob medida de preparação diluída crânio-para dois fótons em imagens vivo. (A) Uma fotografia da placa de cabeça, que é feito de dois ou três lâminas de barbear coladas, com bordas afiadas cobertas por fitas. (B) Uma fotografia da placa de suporte, que consiste de uma placa de aço inoxidável, dois blocos de aço inoxidável, dois parafusos, e dois espaçadores.
Figura 2. Transcraniana dois fótons de imagem através de uma preparação diluída crânio-no córtex motor do rato,
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Discussion
Para se obter uma preparação bem sucedida diluído-crânio, várias etapas deste protocolo são cruciais. 1) A espessura do crânio. O osso do crânio tem uma estrutura de sanduíche, com duas camadas de osso compacto de alta densidade e uma camada intermédia de osso esponjoso de baixa densidade. Embora o micro-broca de alta velocidade é adequado para a remoção das camadas exteriores do osso compacto e osso esponjoso, a lâmina microcirúrgica é ideal para o desbaste da camada interna do osso compacto. À medida que a espessura e a rigidez dos aumentos do crânio durante o desenvolvimento, a imagiologia de ratos adultos requer mais osso a ser removido a fim de obter imagens de boa qualidade. A área diluído apresenta um aspecto transparente sólido e proporciona uma boa qualidade de imagem quando a espessura do crânio é de aproximadamente 20-30 mM. A espessura do crânio devem ser verificados periodicamente durante o processo de desbaste como o excesso de desbaste torna o processo de afinamento em sessões de recriação de imagem subseqüentes difícil. 2) O tamanho da região diluído.É importante estabelecer uma configuração diluído crânio-estável, onde uma cavidade tipo cone é alcançado. A arquitetura da região diluído com um tamanho adequado evita causar danos ao córtex e ajuda a diluir em sessões de re-imagem subseqüentes. Recomenda-se para tornar a área de fundo (cerca de 200-300 um de diâmetro) da região adelgaçada menor do que a abertura de topo (cerca de 0,5-1,0 mm de diâmetro). 3) A estabilidade das imagens. Uma preparação bem imobilizado ajuda a melhorar a qualidade de imagem, reduzindo a artefactos de movimento induzido por respiratórias. É importante manter o crânio seca e desprovida de tecido conjuntivo e de detritos de osso antes da placa superior é fixada para o crânio. Cola extra também pode ser aplicado para preencher as lacunas ainda existentes entre a placa de cabeça e do crânio. Além disso, tendo como alvo uma área longe da grande vascularização também minimiza os movimentos causados pelo bombeamento do sangue.
Investigação das alterações no brano de animais com resolução espacial e temporal alta por microscopia de dois fótons vivendo requer geração de uma janela óptica. Além disso a preparação diluída de caveira, estruturas marcadas com fluorescência também pode ser visualizada através da remoção do crânio e substitui-lo com uma cobertura de vidro (usualmente 3-5 mm em diâmetro) que proporciona uma janela de imagem clara 10, 13. Embora ambos diluído-crânio e protocolos de imagem-crânio aberto são aplicadas amplamente para estudos in vivo de imagem, cada método tem suas próprias vantagens e é adequado para diversos modelos experimentais. Por exemplo, a preparação de caveira aberta é útil para estudos que investigam relativamente grandes áreas do cérebro (por exemplo, diâmetro de 5 mm) e requerem muitas sessões de imagem com intervalos curtos (isto é, dia). Uma vez que a janela cranial é implantado com sucesso, sem cirurgia adicional é necessária. No entanto, um período de pós-cirurgia (normalmente cerca de 1 mês), é necessária antes da primeira imagemsessão para atenuar as possíveis respostas inflamatórias causadas por cirurgia. Re-imagem se torna impossível quando a janela craniana é bloqueado por um novo crescimento do osso e / ou espessamento das meninges. Em contraste, os animais com uma preparação-diluído crânio pode ser fotografada imediatamente após a cirurgia inicial, tornando-o mais adequado para imagiologia crónica de animais mais novos (por exemplo, 2 semanas de idade). É apropriado para a investigação com intervalos longos de imagem (ou seja, meses ou anos), já que o crescimento do osso e dura espessamento não é problemática. No entanto, re-desbaste do crânio é geralmente necessária para sessões de re-imagem subseqüentes (intervalos de dia, mesmo com 2), devido ao crescimento do osso. Além disso, a camada de osso recentemente crescido consiste de uma estrutura menos condensada em comparação com o osso compacto inicial, reduzindo a transparência da região do crânio-diluído. Portanto, para obter a mesma qualidade de imagens, é necessário remover completamente a camada de osso recentemente cultivadas. E talttempts geralmente levam à espessura final do crânio no imagiologia posterior mais fina do que a preparação anterior. Uma vez que a espessura do crânio havia sido preparado para 20-30 mM na sessão de imagem inicial, deixando pouco espaço para re-desbaste, os tempos totais de imagem da preparação diluída crânio-é geralmente inferior a 5 vezes. Recentemente, uma nova abordagem experimental chamado polido e reforçado diluído-crânio (portas) foi desenvolvido para combinar ambas as preparações diluído-and-crânio aberto 11, 26, 27.
Até agora, a maioria de imagiologia in vivo, no córtex foi realizado utilizando linhas de ratos transgénicos que expressam a EGFP ou YFP sob neuronal Thy1 promotor específico. Estes ratos transgênicos expressam proteínas fluorescentes esparsamente em um subconjunto, mas população mista de neurônios corticais 25. Uma vez que muitas linhas de evidência sugerem que a plasticidade estrutural dependente da experiência acontece na seletipos celulares CTIVE de circuitos bem definidos, que é importante para etiquetar e imagem de uma forma específica do tipo de célula. Até à data, muitos métodos têm sido aplicados para alcançar este objectivo. Por exemplo, os neurônios piramidais em diferentes camadas corticais pode ser alvo de realização de in utero eletroporação em estágios embrionários definidos 28, 29. Do mesmo modo, a injecção de vectores virais modificados para expressar uma proteína fluorescente também pode ser usado para marcar as células em diferentes regiões do cérebro 30. Além disso, muitas linhas de ratinhos transgénicos que foram gerados para dirigir a expressão da recombinase Cre sob promotores específicos do tipo de célula 31, 32. A injecção de vectores virais, tais como vírus adeno-associados portadores do gene repórter fluorescente na sequência de um codão de paragem em floxed estes ratinhos oferece a possibilidade de atingir uma classe específica de neurónios numa região restringida 33. Ao combinar essas novas abordagens de rotulagem com a nossa-s diluídopreparação Kull, as mudanças nas conexões sinápticas de neurônios corticais pode ser investigado por dois fótons em imagem in vivo em um tipo de célula e / ou forma específica do circuito.
Com o aumento da disponibilidade de animais transgénicos com populações de células marcadas por fluorescência e rápido desenvolvimento de técnicas de marcação in vivo, os procedimentos semelhantes aos descritos aqui também podem ser aplicados para investigar outros tipos de células (células gliais) e vasculatura no cérebro vivo. Combinado com manipulações comportamentais e modelos de doenças, de dois fótons em imagens vivo vai expandir nossa compreensão dos mecanismos moleculares, celulares e circuitos subjacentes às funções cerebrais.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos James Perna para a ilustração gráfica. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Saúde Mental para YZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
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