Abstract
哺乳類の大脳皮質では、神経細胞がシナプスで非常に複雑なネットワークや情報交換を形成している。シナプス強度、ならびにシナプスの追加/削除の変化は、神経可塑性の構造的基礎を提供する、経験依存的な様式で起こる。大脳皮質で最も興奮性シナプスのシナプス後構成要素として、樹状突起棘はシナプスの良いプロキシであると考えられている。マウス遺伝学および蛍光標識技術、個々のニューロンのシナプスの構造およびそれらの撮影の利点は、無傷の脳内で標識することができる。ここでは、 生体内での経時的蛍光標識後シナプス樹状突起棘に追従する二光子レーザー走査顕微鏡を用いて、経頭蓋撮影プロトコルを導入する。このプロトコルは、完全な頭蓋骨を保持し、髄膜および皮質の曝露によって引き起こされる炎症作用を回避間引き頭蓋骨の準備を利用する。そのため、画像はSUの直後に取得することが可能rgeryが実行されます。実験手順は、数時間から数年の範囲の様々な時間間隔で繰り返し行うことができる。この調製物の適用はまた、生理学的および病理学的条件下で、異なる皮質領域、層、ならびに他の細胞型を調査するために拡張することができる。
Introduction
哺乳類の大脳皮質は、知覚と運動制御から抽象情報処理や認知に、多くの脳機能に参加しています。種々の皮質の機能は、個々のシナプスで情報を通信し、交換する異なるタイプのニューロンから構成されている異なる神経回路上に構築。シナプスの構造および機能は、一貫して経験や病状に応じて変更される。成熟した脳では、シナプス可塑性、機能性神経回路の形成と維持に重要な役割を果たして、両方の強さが変化し、シナプスの追加/削除の形をとる。樹状突起棘は、哺乳類の脳における興奮性シナプスの大多数のシナプス後要素である。一定の売上高および棘の形態学的変化は、シナプス結合1-7において変更が良い指標となると考えられている。
二光子レーザー走査マイクロSCOPYは厚く、不透明な準備と、無傷の脳8でのライブイメージングのために適しています、低光毒性を通じて深い浸透を提供しています。蛍光標識との組み合わせでは、2光子イメージングは、生きている脳に覗くと、高い空間分解能と時間分解能を有する個々のシナプスにおける構造的な再編成を追跡する強力なツールを提供しています。様々な方法がライブイメージングのために9-13匹のマウスを作製するために使用されている。ここでは、マウスの皮質におけるシナプス後樹状突起棘の構造的可塑性を調べるためのin vivo二光子イメージングの間引き頭蓋骨の調製を記載する。このアプローチを使用して、我々の最近の研究では、蛍光標識された神経細胞のサブセットおよびin vivo標識技術の急速な発展に伴い、トランスジェニック動物の増加可用性を使用した学習運動技能に応じて、樹状突起棘の変更のダイナミックな絵を描かれているが、ここで説明するのと同様の手順を適用することもできますinvestigaへteの他の細胞型および皮質領域、他の操作と組み合わせ、ならびに疾患モデル16-23で使用した。
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Protocol
承認は、手術およびイメージング調査の開始前にホーム機関から取得する必要がある。この原稿に記載された実験は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校施設内動物管理使用委員会からのガイドラインと規則に従って行った。
1。手術
- すべての手術器具をオートクレーブ徹底的に手術前に70％アルコールでワークスペースを殺菌。
- KX麻酔溶液（200 mg / kgのケタミンおよび20 mg / kgのキシラジン）の腹腔内（IP）注射によりマウスを麻酔マウスの体重に応じて注：KXの投与量は、健康状態は、歪み、年齢に応じて調整されてもよく、マウスの。最適な用量を決定するために獣医の相談にもお勧めします。
- マウスの足の指を押し、麻酔の状態を監視するために反射的応答を確認することにより、定期的につま先のピンチテストを実行します。マウスが完全に手術を開始する前に麻酔をかけていることを確認してください。長時間のイメージングセッション中、必要に応じて追加のKXを管理、定期的に、マウスの麻酔状態を確認してください。
- 手術中体温を維持するために、加熱パッドの上にマウスを置く。
- 頭皮を露出させるためにカミソリの刃を使用して、マウスの頭部を剃る。
- アルコールパッドとベタジン交互で皮膚を拭いて剃毛面積を殺菌。残留髪の切り抜きを削除します。
- そっとそのため実験中に脱水症状に起因する永久的な損傷を防止し、両眼を潤滑する眼軟膏を適用します。
- 頭皮の正中線に沿ってまっすぐに切開を行い、頭蓋骨の端に向かって横方向に皮膚を移動します。
- 頭蓋骨に付着した結合組織を除去します。
2。間引き頭蓋骨の準備
- アイドルマスターに基づいて撮像領域を特定。eotaxic座標注：大血管、ブロックライトの浸透を回避し、画像化された構造をぼかすようにしてください。頭蓋骨は、滅菌生理食塩水で湿っているとき、血管系は最もよく観察される。
- 頭蓋骨の薄い円形領域（0.5〜直径）に高速マイクロドリルを使用してください。むしろ頭蓋骨に対してそれを保持し、押し下げなく、頭蓋骨の表面にドリル平行に移動。外側の緻密骨層と中間海綿骨層の両方になるまでドリルが削除されます（注）。ドリルビットと頭蓋骨の間に長時間の接触を避けるため、過熱による損傷を防ぐため。
- ドリル薄くなった領域の中心にある顕微刃で内側の緻密骨層を薄くし続ける。均等におおよその厚さの小さな領域（200〜300ミクロン径）に薄くなるまで頭蓋骨に対して押し下げずに頭蓋骨をこすり取る際には、約45度の角度で顕微ブレードを保持するLY、20〜30程度が得られる。による頭蓋骨の自己蛍光を、厚さが二光子顕微鏡下で頭蓋骨の上面と下面との間の距離を走査することによって測定することができる注：20μm未満の頭蓋骨の厚さは、良好な結像品質を提供するが、それはその後の再イメージングセッションで間引き処理を困難にするので、それはお勧めしません。オーバー間伐ないようにするには、頭蓋骨の厚さは、（説明を参照）、手術中に定期的にチェックする必要があります。
3。固定化
- 丁寧に骨片を除去。
- オートクレーブ処理された無菌のヘッドプレートの中央開口部の各エッジにシアノアクリレート接着剤の小滴（ 図1参照 ）を配置します。開口部注意の中心に位置して薄くなった地域で頭蓋骨にしっかりとヘッドプレートを保持する：接着剤が薄くなったRを汚染した場合偶然egion、顕微刃で慎重に取り除いてください。
- 優しくヘッドプレートの中央開口部のエッジに頭蓋骨の側面から肌を引き出します。
- ヘッドプレートはよく頭蓋骨に装着されるまで、約10分待ちます。
- （ 図1を参照）保持板の2の横方向のブロックにヘッドプレートを配置し、保持板上にマウスを固定化するために、ヘッドプレートの縁の上にネジを締め注：。の間には、皮膚やウィスカーがないことを確認してくださいネジを締める前に、ヘッドプレートとブロック。動物の背中を優しく撫でているときは良いの固定化の準備は解剖顕微鏡下で頭蓋骨の観察可能な動きを示さないはずである。
- 。未重合接着剤を除去するために生理食塩水でさらさ頭蓋骨をすすぎ注：未重合接着剤は、画像をぼかしや損傷がある目的を顕微鏡としてそれは、残りの接着剤を除去することが重要である<。/李>
4。イメージング
- （ 図2参照）、その後のイメージングセッションで画像化された領域を再配置するために使用されているマップ1、のように薄くなった領域と露光され頭蓋骨の血管系の写真を撮る。
- イメージング顕微鏡下でマウスを置きます。エピ蛍光を使用して10倍の空気目的の下に薄型化エリアの位置を確認し、ビューの中心に最も薄いエリアを移動します。
- 頭蓋骨の上に生理食塩水を一滴を追加し、滅菌水でリンスされた60Xの対物レンズに切り替える。個々の樹状突起棘がはっきりと樹状突起に沿って視覚化された領域を選択します。落射ビューと血管系写真間の血管系を比較することにより、地図上の1対応する領域を特定し、ラベルを付ける。
- チューン二光子レーザー波長フルオロフォアに記載の方法。例えば、YFPのための920ナノメートル; GFPについて890 nmの;のDsRedとtdTomato 24 1,000 nmの。
- 2で画像スタックを取得60Xの対物レンズを使用して、z軸に沿って以下の手順。この画像スタックは、約200ミクロン×200ミクロンの領域（512×512ピクセル）をカバーし、（ 図2を参照）、その後のイメージングセッション中に再配置するためのマップ2として使用される。
- 3倍デジタルズームを使用して、マップ2内の9画像スタックを取得。各画像スタックは、z軸に沿って0.7μmのステップで、70ミクロンX 70ミクロン（512×512ピクセル）のおおよその領域をカバーしています（注）。光毒性を最小限にするために、サンプルで測定した場合、レーザーの強度は40ミリワット以下でなければならない。
5。復旧
- イメージングの後、静かに頭蓋骨からヘッドプレートを取り外す。
- 徹底的に頭蓋骨と、残りのすべての接着剤を除去するために、皮膚をきれい注：お肌に残りの接着剤は炎症を引き起こし、頭蓋骨に残っている接着剤は頭蓋骨の浸食となりますしながら、皮膚の治癒が遅くなります新しく成長した骨層にngiogenesis、その後の移転と再結像が困難になる。
- 生理食塩水で数回頭蓋骨と皮膚を洗い流す。
- 無菌手術用縫合糸で頭皮を縫合。
- 別々のケージに加熱パッド上に動物を保管してください。術後疼痛を軽減するためにブプレノルフィンの鎮痛薬（0.1 mg / kg）を皮下投与する。完全に回復した後にホームケージに動物を返します。切開が治癒され、縫合糸が削除されるまで、（少なくとも一日一回チェックしてください）密接に動物を監視します。必要に応じてブプレノルフィン鎮痛剤のその後の注射を管理します。
6。再イメージ
- 繰り返して1.1〜1.8を繰り返します。
- 手順を繰り返し3.1から3.6
- 1をマッピングするために、血管系のパターンと2をマッピングするために、樹状分岐パターンを比較することで、以前に撮影領域の位置を確認します。
- 再結像は1週間以内に行われた場合、再薄肉の上に新しく成長した骨の薄層を除去するために、ステップ2.3を繰り返す顕微ブレードを使用して祇園。再結像は1週間以上後に行われた場合、ステップ2.2および2.3の両方を繰り返す注：新しく成長した骨層は画質の低下をもたらす元の緻密骨層に比べて少ない縮合型構造からなる。したがって、同じ品質を取得するためには、頭蓋骨以前撮像セッションよりも若干薄くする必要がある。
- 以前は二光子顕微鏡で画像スタックを取っ一致画像スタックを取得する位置及び姿勢を調整する。
- ステップ4.6のように画像を取得する。
- 繰り返しは、撮影後に5.1から5.5を繰り返します。
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Representative Results
YFP-Hラインマウス25で、黄色蛍光タンパク質は、皮質の表層への先端樹状突起を投影V層錐体細胞のサブセットで表現しています。間引き頭蓋骨の製剤を介して、蛍光標識された樹状セグメントは、繰り返し時間から数ヶ月の範囲の、種々の撮像間隔で二光子顕微鏡で画像化することができる。ここでは、個々の棘だけでなく、糸状仮足は明らかに樹状突起に沿って可視化することができる1ヶ月のマウスの運動皮質での8日間の同じ樹状突起の4時間イメージングの一例を示す。通常、画像スタックの深さは約100〜200μmの軟膜表面からである。種々の分析は、これらの画像に基づいて行うことができる。例えば、スパイン形成、脱離および代謝回転は、異なるセッションからの画像を比較することによって定量することができる。棘密度はdendritの長さによってスパインの数で割ることによって計算することができる。ICセグメント。脊椎の運動性および形態の変化も分析することができる。
図1 ビボイメージングにおける二光子用の間引き頭蓋骨製剤のカスタムメイドの固定プレート。（A）テープで覆われ、鋭いエッジを有する、一緒に接着二、三カミソリ刃で形成されているヘッドプレートの写真。 （B）1ステンレス鋼板で構成されて保持板の写真で、2つのステンレス鋼ブロック、2本のネジ、および2スペーサ。
図2。マウスの運動皮質での間引き頭蓋骨の準備を経て頭蓋2光子イメージング、
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Discussion
成功間引き頭蓋骨の準備を取得するには、このプロトコルにはいくつかのステップが重要である。 1）頭蓋骨の厚さ。頭蓋骨は、高密度緻密骨と低密度海綿骨の中間層の2層、サンドイッチ構造を有する。高速マイクロドリルは緻密骨と海綿骨の外側の層を除去するのに適しているが、顕微ブレードは緻密骨の内側の層を薄くするのに最適です。開発中に頭蓋骨の厚さが増加すると剛性ように、成体マウスのイメージングは、良好な品質の画像を得るために除去するより多くの骨を必要とする。薄くなった領域は、透明な固体の外観を示し、頭蓋骨の厚さは約20〜30程度である場合に、良好な画像品質を提供します。オーバー間伐は、その後の再イメージングセッションで間引き処理を困難にするように頭蓋骨の厚さは間引き処理中に定期的にチェックする必要があります。 2）薄くなった領域のサイズ。これは、円錐状の空洞が達成され、安定した間引き頭蓋骨の構成を確立することが重要である。適当な大きさに薄くなった領域のアーキテクチャは、大脳皮質の損傷を引き起こし、その後の再イメージングセッションで間伐ができます防ぐことができます。それは、一番上の開口部（直径約0.5〜1.0ミリメートル）よりも小さい薄くなった領域の底面積（直径約200〜300μm）を行うことをお勧めします。 3）画像の安定性。ウェル固定化製剤は、呼吸器誘発性運動アーチファクトを低減することによって、画質を向上させることができます。なお、ヘッドプレートが頭蓋骨に取り付けられる前に、乾燥した結合組織および骨の破片を欠く頭蓋骨を維持することが重要である。余分な接着剤はまた、ヘッドプレートと頭蓋骨との間の残りの隙間を埋めるために適用することができる。また、離れて大きな血管系からの領域を標的とすることは、血液ポンプによって引き起こされる動きを最小限に抑えることができます。
ブラジャーの変化の調査二光子顕微鏡を用いて、高い空間分解能と時間分解能を有する動物の生体の光学窓の発生を必要とする。間引き頭蓋骨製剤に加えて、蛍光標識された構造は、頭蓋骨を除去し、透明な観察 窓10,13を提供するカバーガラス（直径出荷までの時間2mm）を交換することによって視覚化することができる。間引き頭蓋骨とオープン頭蓋骨イメージングプロトコルの両方がin vivoイメージング研究のために広く適用されていますが、それぞれの方法には独自の利点があり、さまざまな実験デザインに適しています。例えば、オープン頭蓋骨の準備は比較的大きな脳領域（ 例えば 、直径5mm）を調査し、短い間隔（ つまり 、日）で、多くのイメージングのセッションを必要とする研究に有用である。頭蓋窓が正常に移植されると、追加の手術が必要とされない。しかし、手術後の期間（通常は約1ヶ月）は、第1の撮像前に必要とされている手術に起因する潜在的な炎症反応を改善するためのセッション。頭蓋窓が骨および/または髄膜の肥厚の再成長によってブロックされた場合、再撮影が不可能になる。対照的に、間引き頭蓋骨製剤を有する動物（2週齢例えば ）若い動物の慢性的イメージングのための、より適し、最初の手術の直後に画像化することができる。骨の再成長と硬膜の肥厚が問題とならないように、それは、長いイメージング間隔（年すなわちヶ月）での調査に適しています。しかし、頭蓋骨の再間伐は通常、骨の再成長に（でも、2日間隔で）その後の再イメージングセッションのために必要とされている。また、新しく成長した骨の層が大幅に間引き頭蓋骨領域の透明性を低下させる、オリジナルのコンパクトな骨に比べて少ない凝縮構造で構成されています。したがって、同じ画像の品質を獲得するためには、完全に新しく成長した骨層を除去する必要がある。そして、このようなttemptsは通常、前の準備よりも薄く、その後のイメージングで頭蓋骨の最終的な厚さにつながる。頭蓋骨の厚さが再間引きのための限られた余地を残して、初期の撮像セッション中に20〜30程度に調製されたので、間引き頭蓋骨製剤の総撮像時間は、通常、5倍未満である。最近では、洗練され強化された名前の新 しい実験的なアプローチは、間引き頭蓋骨（ポート）の両方間引きとオープン頭蓋骨標本11、26、27を組み合わせて開発された。
これまでに、皮質におけるin vivoイメージングの大部分は、ニューロン特異的THY1プロモーター下でEGFPまたはYFPを発現するトランスジェニックマウス系統を用いて行われた。これらのトランスジェニックマウスは、サブセット内のまばらな蛍光タンパク質を発現するが、皮質ニューロン25の混合集団。証拠の多くの行は、経験依存構造的可塑性がSELEで起こることを示唆しているので明確に定義された回路のctive細胞型は、細胞型特異的様式で標識し、画像が重要である。現在までに、多くのアプローチがこの目標を達成するために適用されている。例えば、異なる皮質層における錐体ニューロンは、定義された胚のステージ28,29にて子宮内エレクトロポレーションで行うことによって標的とすることができる。同様に、蛍光タンパク質を発現するように操作されたウイルスベクターの注入は、異なる脳領域30で細胞を標識するために使用することができる。また、トランスジェニックマウスの行数は、細胞型特異的プロモーター31,32の下にCreリコンビナーゼの発現を駆動するために生成されている。これらのマウスにフロックス終止コドン以下の蛍光レポーター遺伝子を運ぶアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターの注入が制限された領域33のニューロンの特定のクラスを対象とする可能性を提供しています。これらの新しいラベルを組み合わせることにより、私たちの間引きSに近づきカル調製は、皮質ニューロンのシナプス結合の変化は、細胞型及び/又は回路特異的にin vivoイメージング2光子によって調査することができる。
蛍光標識された細胞集団およびin vivo標識化技術の急速な発展に伴い、トランスジェニック動物の増大可用性、ここで説明する同様の手順はまた、生きている脳内の他のタイプの細胞（グリア細胞）および血管系を調査するために適用することができる。行動の操作および疾患モデル、 インビボイメージングにおける二光子と組み合わさ大きく脳機能の基礎となる分子、細胞、回路メカニズムの理解を拡大する。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、図解のためにジェームス·ペルナに感謝します。この作品は、YZに国立精神衛生研究所からの補助金によって支えられて
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
References
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