Abstract
포유류의 피질에서 신경 세포는 매우 복잡한 네트워크와 시냅스에서 정보 교환을 형성한다. 시냅스 강도뿐만 아니라, 시냅스의 추가 / 제거의 변화, 신경 가소성의 구조적 기초를 제공하고, 환경 의존적으로 발생한다. 피질에서 가장 흥분성 시냅스의 시냅스 구성 요소로, 돌기 쪽은 시냅스의 좋은 프록시로 간주됩니다. 마우스 유전학과 형광 라벨 기법, 개별 뉴런과 자신의 시냅스 구조의 촬영 장점은 그대로 뇌에 표시 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 시간이 지남에 형광 표지 시냅스 돌기 쪽을 따라 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 두개 영상 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜은 그대로 두개골을 유지하고 수막의 노출과 피질에 의한 염증 효과를 방지 얇게 두개골 준비를 활용합니다. 따라서, 이미지는 SU 직후에 취득 할 수있다rgery이 수행된다. 실험 절차는 시간부터 년까지 다양한 시간 간격들에 걸쳐 반복하여 수행 될 수있다. 이 혼합물을 또한 생리적 및 병리 적 조건에서, 다른 피질 영역과 층뿐만 아니라, 다른 세포 유형을 조사하기 위해 확장 될 수있다.
Introduction
포유류의 피질 감각 지각과 운동 제어에서 추상적 인 정보 처리 및 인식, 많은 뇌 기능에 참여하고 있습니다. 다양한 대뇌 피질의 기능은 신경 세포의 다른 종류의 통신 및 개별 시냅스에서 정보를 교환하기로 구성되어 다른 신경 회로에 구축 할 수 있습니다. 시냅스의 구조 및 기능은 일관 경험 및 병리에 대한 응답으로 수정되고있다. 성숙한 뇌에서 시냅스 가소성 형성과 기능적 신경 회로의 유지에 중요한 역할을 수행, 강도 변화와 시냅스의 추가 / 제거를 두의 형태를 취한다. 돌기 쪽은 포유류 뇌의 흥분성 시냅스의 대부분의 시냅스 구성 요소입니다. 지속적인 매출 및 척추의 형태 학적 변화는 시냅스 연결 1-7 수정의 좋은 지표 역할을 것으로 추정된다.
이광자 레이저 스캐닝 마이크로SCOPY 두꺼운 불투명 준비하고 그대로 뇌 8 라이브 영상에 적합하게 낮은 광독성을 통해 깊은 침투를 제공합니다. 형광 표시와 함께, 두 광자 영상은 살아있는 뇌 들여다 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 개별 시냅스의 구조 개편을 수행 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 다양한 방법은 실시간 이미징 9-13 생쥐를 제조하는데 사용되었다. 여기, 우리는 마우스 피질에서 시냅스 돌기 쪽의 구조적 가소성을 조사하기 위해 생체 내 두 광자 이미징 얇게 두개골 준비에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여, 우리의 최근의 연구는 형광 표지 된 신경 세포의 하위 집합 및 생체 표지 기술의 급속한 발전과 함께 형질 전환 동물의 증가 가용성 학습 운동 기능에 대한 응답으로 돌기 척추 변화의 동적 인 그림을 묘사 한, 여기에 설명 된 절차와 유사한 절차도 적용 할 수 있습니다 investiga하기TE 다른 세포 유형 및 피질 영역, 다른 조작과 결합뿐만 아니라, 16-23은 질병 모델에서 사용했다.
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Protocol
승인은 수술 및 이미징 연구의 개시 전에 홈 기관에서 얻을 수 있어야합니다. 이 논문에 기술 된 실험은 캘리포니아 대학 산타 크루즈 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 규정에 따라 수행되었다.
1. 수술
- 모든 수술 도구를 압력솥 철저하게 수술 전 70 % 알코올로 작업 영역을 소독.
- KX 마취 용액 (200 ㎎ / kg 케타민 20 ㎎ / kg 자일 라진)을 복강 내 (IP) 주사하여 마우스를 마취 마우스의 체중에 따라 주 :. KX 투여는 건강 상태는 스트레인, 연령에 따라 조절 될 수 있고, 마우스. 최적의 복용량을 결정하는 수의 상담도 추천합니다.
- 마우스의 발가락을 눌러 마취 상태를 모니터링 할 수 재귀 응답을 확인하여 주기적으로 발가락 핀치 테스트를 수행합니다.마우스가 완전히 수술을 시작하기 전에 마취되어 있는지 확인합니다주의 :. 장시간 영상 세션 동안, 필요한 경우 추가 KX를 리다, 주기적으로 마우스의 마취 상태를 확인합니다.
- 수술 동안 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 마우스를 배치.
- 두피를 노출하는 면도날을 사용하여 쥐의 머리를 면도.
- 알코올 패드와 베타 딘을 교대로 피부를 닦아 면도 영역을 소독. 잔여 머리를 잘라낸를 제거합니다.
- 조심스럽게 따라서 실험 기간 동안 탈수로 인한 영구적 인 손상을 방지, 두 눈을 윤활 눈 연고를 적용합니다.
- 두피의 중간 선을 따라 직선 절개를 확인하고, 두개골의 가장자리를 향해 옆으로 피부를 이동합니다.
- 두개골에 부착 된 결합 조직을 제거합니다.
2. 시닝 두개골 준비
- STER에 근거 촬상 영역을 식별. eotaxic 좌표 참고 : 큰 혈관, 블록 등의 침투를 방지하고 몇 군데 구조를 흐리게하십시오. 두개골은 멸균 식염수 촉촉한 때 혈관이 최고의 관찰된다.
- 두개골 (0.5 ~ 1.0 mm 직경)의 얇은 원형 영역에 고속 마이크로 드릴을 사용합니다. 오히려 두개골에 대해 그것을 잡고 아래로 눌러보다 두개골 표면에 드릴 평행 이동합니다. 드릴은 외부 컴팩트 뼈의 층과 중간 해면골 층까지 모두 제거됩니다 참고 :. 과열로 인한 손상을 방지하려면, 드릴 비트와 두개골 사이의 장기간의 접촉을 피할 것.
- 드릴 얇게 지역의 중심에 미세 수술 블레이드 내부 컴팩트 뼈 층을 얇게 계속합니다. 균등 대략의 두께로 작은 영역 (200 ~ 300 μm의 직경)를 얇게 할 때까지 머리에 아래로 누르지 않고 두개골을 긁어 약 45 °의 각도로 미세 수술 날을 잡고LY 20 ~ 30 μm의를 얻을 수있다. . 인해 두개골의 자동 형광으로, 두께는 이광자 현미경 주 미만의 두개골 상부 및 하부면 사이의 거리를 스캐닝함으로써 측정 될 수있다 : 20μm 미만의 두개골 두께가 좋은 화상 품질을 제공하지만 그것은 이후의 재 이미징 세션의 숱이 과정을 어렵게하기 때문에하지 않는 것이 좋습니다. 지나치게 숱이 방지하기 위해, 두개골의 두께는 (토론 참조) 수술하는 동안 정기적으로 점검 할 필요가있다.
3. 고정화
- 조심스럽게 뼈 파편을 제거합니다.
- 압력 가마로 소독 된 멸균 헤드 판의 중심 개구의 각 가장자리에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 방울 (그림 1 참조)를 놓습니다. . 개구부의 중심 주에있는 얇아진 영역과 두개골에 단단히 머리 판을 잡고 : 접착제가 얇아진 연구를 오염 시키면사고로 egion, 미세 수술 칼날로 조심스럽게 제거합니다.
- 부드럽게 헤드 판의 중심 개구의 가장자리에 두개골의 측면으로부터 피부를 당겨.
- 헤드 플레이트가 아니라 두개골에 부착 될 때까지 약 10 분을 기다립니다.
- (그림 1 참조) 보유 판의 두 가지 측면 블록 헤드 플레이트를 위치하게 한 후, 고정 플레이트에 마우스를 고정시키기 머리 판의 가장자리에 나사를 조입니다 참고 :. 사이에 피부 나 수염이 없는지 확인합니다 나사를 조이기 전에 머리 판과 블록. 동물의 뒤 부드럽게 쓰다듬어 때 양호한 고정화 제제 해부 현미경 두개골 전혀 관찰 움직임을 표시 안된다.
- . 미 중합 접착제를 제거하기 위해 식염수로 노출 된 두개골을 씻어 주 : 미 중합 접착제 이미지를 흐리게하고 손해 목표를 현미경으로 그것은 남아있는 접착제를 제거하는 것이 중요합니다 <./ 리>
4. 이미징
- (그림 2 참조) 이후의 영상 세션에서 몇 군데 지역을 재배치하는 데 사용되는지도 1로 희석 영역과 노출 된 두개골의 혈관의 사진을 가져 가라.
- 영상 현미경으로 마우스를 놓습니다. 표면 형광을 사용하여 10X 공기 목적에 따라 얇아진 영역을 찾아보기의 중앙에 얇은 영역을 이동합니다.
- 두개골의 상단에 식염수 한 방울을 추가하고 멸균 수로 세척 된 60X 목표로 전환. 각각의 돌기 쪽이 명확하게 수상 돌기를 따라 시각화하는 지역을 선택합니다. 식별 및 epifluorescent보기와 혈관의 사진 사이에 혈관을 비교하여지도 1에 해당하는 지역을 라벨.
- 형광에 따른 튜닝 이광자 레이저 파장. 예를 들어, YFP 920 nm의; GFP에 대한 890 nm의; DsRed를하고 tdTomato 24 1,000 nm의.
- 2 이미지 스택 획득60X 목표를 사용하여 Z 축을 따라 μm의 단계. 이 이미지 스택은 약 200 ㎛ × 200 ㎛의 영역 (512 X 512 픽셀)를 커버하고 (그림 2 참조) 이후의 영상 세션에서 이전에지도 2로 사용됩니다.
- 배 디지털 줌을 사용하여지도 2 내에서 아홉 이미지 스택을 획득. . 각각의 이미지 스택은 z 축 주에 따라 0.7 μm의 단계를, 70 μm의 X 70 μm의 (512 X 512 픽셀)의 대략적인 지역을 커버 : 광독성을 최소화하기 위해 샘플을 측정했을 때 레이저의 강도는 40 mW의 이하이어야한다.
5. 복구
- 영상에 따라 부드럽게 두개골에서 머리 판을 분리합니다.
- 철저하게 두개골과 나머지 모든 접착제를 제거하기 위해 피부를 청소 참고 :. 피부에 남아있는 접착제는 자극의 원인과 두개골에 남아있는 접착제는 두개골의 침식의 원인이됩니다 동안 피부의 치유 속도를 느리게합니다ngiogenesis 새로 성장 뼈의 층에서, 이후의 재배치 및 재 이미징 어려운 만들기.
- 두개골과 생리 식염수를 여러 번로 피부를 씻어.
- 무균 수술 봉합과 두피를 봉합.
- 별도의 케이지에 가열 패드에있는 동물을 유지. 수술 후 통증을 완화하기 위해 피하 부 프레 노르 핀의 진통 (0.1 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수 있습니다. 전체 복구 홈 케이지에 동물을 반환합니다. 절개 부위가 치유되고 봉합이 제거 될 때까지 (적어도 하루에 한 번 확인) 밀접하게 동물을 모니터링합니다. 필요한 경우 부 프레 노르 핀 진통제의 후속 주사를 관리 할 수 있습니다.
6. 재 이미징
- 반복 1.1-1.8 단계를.
- 반복 3.1-3.6 단계를
- 1지도하는 혈관 패턴과 2를지도하는 수지상 분기 패턴을 비교하여 이전에 몇 군데 지역을 찾습니다.
- 재 이미징이 일주 내에서 수행되는 경우, 박형화 재 위에 새로 자란 뼈의 얇은 층을 제거하는 단계 2.3를 반복미세 수술 블레이드를 사용하여 기온. 재 이미징 이상 일주 한 후에 수행된다면, 단계 2.2 및 2.3를 반복 모두 참고. 새로 자란 뼈 층은 축소 화상 품질 선도 일본어 치밀골 층에 비해 더 적은 응집 구조로 구성된다. 따라서, 동일한 품질을 확보하기 위해서는 이전 촬상 세션보다 약간 얇은 스컬하는 것이 필요하다.
- 이전 이광자 현미경 영상 스택을 찍은 이미지와 일치 스택을 얻기 위해 위치 및 방향을 조정한다.
- 단계 4.6에서와 같이 이미지를 획득.
- 반복 영상 후 5.1-5.5 단계를.
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Representative Results
YFP-H 라인 쥐 25에서 노란색 형광 단백질이 대뇌 피질의 표면 층에 자신의 혀끝의 수상 돌기를 돌출 레이어 V 피라미드 신경의 부분 집합에 표현한다. 얇게 두개골 준비를 통해, 형광 표지 된 수지상 세그먼트 반복적 시간에서 달에 이르기까지, 다양한 영상 간격을 통해 두 광자 현미경으로 몇 군데 있습니다. 여기에서 우리는 개인의 척추뿐만 아니라 filopodia 명확하게 수상 돌기를 따라 시각화 할 수있는 1 개월 마우스의 운동 피질에있는 8 일 동안 같은 수상 돌기의 네 시간 영상의 예를 보여줍니다. 일반적으로, 화상 스택 깊이 pial 표면으로부터 약 100 내지 200 μM이다. 각종 분석은 이러한 이미지에 기초하여 수행 될 수있다. 예를 들어, 척추 형성, 제거 및 회전율은 다른 세션에서 이미지를 비교함으로써 정량화 될 수있다. 척추 밀도는 dendrit의 길이에 의해 가시의 수를 나누어 계산 될 수있다IC 세그먼트. 척추의 운동성 및 형태의 변화도 분석 할 수 있습니다.
그림 1. 생체 내 이미징에서 두 광자에 대한 시닝 두개골 준비 주문품 고정 플레이트. (A) 테이프에 의해 덮여 날카로운 모서리와 함께 붙어 두 개 또는 세 개의 면도날로되어 머리 판의 사진. (B) 1 스테인레스 강판, 스테인레스 스틸 2 블록, 나사 2 개, 2 스페이서로 구성되어 유지 판의 사진.
그림 2. 마우스의 운동 피질에 얇게 두개골 준비를 통해 경 두개 두 광자 이미징,
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Discussion
성공적인 얇게 두개골 준비를 얻으려면,이 프로토콜의 몇 가지 단계가 매우 중요하다. 1) 두개골의 두께. 두개골 뼈이 고밀도 치밀골의 층과 저밀도 해면골의 중간층과 함께 샌드위치 구조를 갖는다. 고속 마이크로 드릴 치밀골과 해면골의 외부 층을 제거하기에 적합한 반면, 미세 수술 블레이드 치밀골의 내부 층을 얇게 이상적이다. 개발하는 동안 두개골의 두께가 증가하고 강성으로, 성인 쥐의 촬상 좋은 품질의 이미지를 얻기 위해서 제거되어야 할 더 많은 골을 요구한다. 얇아진 영역은 투명 고체 외관을 나타내고 두개골의 두께는 약 20 ~ 30 ㎛의 경우 양호한 이미징 품질을 제공한다. 지나치게 숱이 이후의 재 이미징 세션의 숱이 어려운 과정을 만들면서 두개골의 두께는 얇아 과정 중에 주기적으로 확인해야합니다. 2) 박막화 영역의 크기.이 원추 형상의 캐비티를 실현하고 안정된 박막화 두개골 구성을 확립하는 것이 중요하다. 적당한 크기로 얇게 영역의 구조는 외피에 손상을 일으키는 것을 방지하고 후속 재 촬상 세션 얇게 돕는다. 그것은 상부 개구 (직경 약 0.5 ~ 1.0 mm)보다 작은 박편 지역의 바닥 면적 (직경 약 200 ~ 300 μm의)를 확인하는 것이 좋습니다. 3) 이미지의 안정성. 잘 고정화 제제는 호흡 유도 움직임 아티팩트를 감소시켜 화질을 개선하는 것을 돕는다. 그것은 머리 플레이트가 두개골에 부착되기 전에 건조하고 결합 조직과 뼈 파편은없는 두개골을 유지하는 것이 중요합니다. 여분의 접착제는 또한 헤드 판과 두개골 사이 남은 갭을 채우기 위해 적용 할 수있다. 또, 거리에 큰 혈관에서 영역을 대상으로하면 혈액 펌핑으로 인한 움직임을 최소화한다.
브래지어의 변화 조사두 광자 현미경을 사용하여 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 동물을 생활에 광학 윈도우의 생성이 필요합니다. 시닝 두개골 제제 이외에, 형광 표지 된 구조는 또한 두개골을 제거하고 맑은 촬상 창 (10), (13)을 제공하는 커버 유리 (직경 보통 3-5 ㎜)로 교체하여 가시화 될 수있다. 시닝 두개골과 오픈 두개골 영상 프로토콜을 모두가 생체 영상 연구에 광범위하게 적용되는 반면, 각각의 방법은 모두 나름의 장점을 가지고 있으며, 다른 실험 설계에 적합하다. 예를 들어, 오픈 두개골 준비는 상대적으로 큰 뇌 영역 (예를 들면 5 mm 직경)을 조사하고 짧은 간격 (즉, 일)로 많은 영상 세션을 필요로 연구에 유용합니다. 두개골 창을 성공적으로 이식되면, 추가 수술이 필요하지 않습니다. 그러나, 수술 후 기간 (일반적으로 대략 1 달) 첫 촬영하기 전에 필요수술로 인한 잠재적 인 염증 반응을 개선하는 세션. 두개골 창 뼈 및 / 또는 수막의 비후 재성장에 의해 차단 될 때 다시 영상은 불가능하게된다. 대조적으로, 얇게 두개골 준비와 동물 (2 주 이전 예) 어린 동물의 만성 이미징을위한 더 적합합니다, 초기 수술 직후 몇 군데 있습니다. 뼈의 재성장과 경질 두껍게 문제가 아니므로 그것은 긴 영상 간격 (년, 즉 개월)과 조사에 적합하다. 그러나 두개골의 재 숱은 보통 다음 이미지 다시 세션에 의한 뼈의 재성장에 (도 2 일 간격)가 필요합니다. 또한, 새로 자란 뼈 층은 크게 시닝 두개골 영역의 투명성을 감소 일본어 치밀골에 비해 덜 축합 구조로 구성된다. 따라서, 이미지의 동일한 품질을 확보하기 위해서는, 완전히 새롭게 성장한 뼈 층을 제거 할 필요가있다. 그리고 이러한ttempts 보통 이전의 제제보다 얇은 후속 이미징 두개골의 최종 두께로 이어질. 두개골의 두께가 다시 숱이 제한적 공간을 떠나, 초기 영상 세션에서 20 ~ 30 μm의 제조 한 이후, 얇게 두개골 준비의 총 영상 시간은 일반적으로 5 배 미만이다. 최근, 광택 및 강화라는 새로운 실험 방법은 얇게 두개골 (포트)를 모두 시닝 오픈 두개골 준비 11, 26, 27을 결합하기 위해 개발되었습니다.
지금까지 피질의 생체 내 이미징의 대부분은 신경 세포의 특정 thy1 프로모터에서 EGFP 또는 YFP을 표현하는 유전자 변형 마우스 라인을 사용하여 수행되었습니다. 이러한 형질 전환 마우스는 띄엄 띄엄 일부에 형광 단백질을 표현하지만, 대뇌 피질의 신경 세포 (25)의 혼합 인구. 증거의 많은 라인은 경험에 의존하는 구조 가소성이 실리에서 발생하는 것이 좋습니다 때문에잘 정의 회로 ctive 세포 유형, 그것은 세포 형 특정 방식으로 라벨을 붙이고 화상에 중요하다. 지금까지, 많은 접근법이이 목표를 달성하기 위해 적용되었다. 예를 들어, 서로 다른 대뇌 피질의 층에있는 피라미드 뉴런은 정의 배아 단계 (28, 29)에서 자궁 일렉트로의 수행 대상이 될 수 있습니다. 마찬가지로, 형광 단백질을 발현하도록 설계 바이러스 벡터의 주입은 또한 다른 뇌 영역 (30)에 세포를 라벨을 사용할 수있다. 또한, 트랜스 제닉 마우스의 행수는 세포 유형 특이 적 프로모터 (31, 32) 아래 크레 재조합 효소의 발현을 구동하기 위해 생성되었다. 이와 마우스로 floxed 종결 코돈 다음 형광 리포터 유전자를 운반하는 아데노 - 관련 바이러스와 같은 바이러스 성 벡터의 주입은 제한된 영역 (33)에 신경 세포의 지정된 클래스를 대상으로 할 수있는 가능성을 제공합니다. 새로운 라벨을 결합하여 우리의 박형-S와 접근컬 소장 준비, 대뇌 피질의 뉴런의 시냅스 연결의 변화는 세포 유형 및 / 또는 회로 특정 방식으로 생체 내 이미징에서 두 광자에 의해 조사 할 수 있습니다.
형질 전환 동물의 증가 가용성과 형광 표지 된 세포 집단과 여기에 설명 된 생체 표지 기술, 유사한 절차의 신속한 개발은 또한 다른 종류의 세포 (아교 세포)와 살아있는 뇌의 혈관을 조사하기 위해 적용 할 수 있습니다. 행동 조작 및 질병 모델, 생체 내 이미징에서 두 광자와 결합 크게 뇌 기능의 기초가되는 분자 세포 및 회로 메커니즘에 대한 우리의 이해를 확장 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 그래픽 제임스 Perna 감사합니다. 이 작품은 YZ에 정신 건강의 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
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