Abstract
I däggdjur cortex, nervceller bildas extremt komplicerade nätverk och utbyta information på synapser. Förändringar i synaptisk styrka, samt tillsats / avlägsnande av synapser, uppstår i en upplevelse-beroende sätt, vilket ger den strukturella grunden för neuronal plasticitet. Som postsynaptiska komponenter i de excitatoriska synapser i hjärnbarken, är Dendritutskotten anses vara ett bra mått av synapser. Ta fördelarna med mus genetik och fluorescerande märkningsteknik, enskilda nervceller och deras synaptiska strukturer kan märkas i den intakta hjärnan. Här presenterar vi en transkraniell bildprotokoll med två-foton-laserskanning mikroskopi för att följa fluorescerande postsynaptiska Dendritutskotten över tiden in vivo. Detta protokoll använder en tunnas-skalle förberedelse, som håller skallen intakt och undviker inflammatoriska effekter orsakade av exponering av mening och cortex. Därför kan bilderna förvärvas direkt efter surgery utförs. Den experimentella proceduren kan utföras repetitivt över olika tidsintervall som sträcker sig från timmar till år. Tillämpningen av detta preparat kan också byggas ut för att undersöka olika kortikala regioner och lager, samt andra celltyper, under fysiologiska och patologiska tillstånd.
Introduction
Den däggdjur cortex deltar i många hjärnfunktioner, från förnimbara och rörelsekontroll till abstrakta informationsbearbetning och kognition. Olika kortikala funktioner bygger på olika nervbanor, som består av olika typer av nervceller som kommunicerar och utbyter information på enskilda synapser. Strukturen och funktionen av synapser konsekvent att modifieras som svar på erfarenheter och patologier. I den mogna hjärnan, tar synaptisk plasticitet form av både hållfasthets ändringar och tillägg / borttagning av synapser, spelar en viktig roll i bildandet och upprätthållandet av en fungerande neurala kretsar. Dendritutskotten är de postsynaptiska komponenter i majoriteten av excitatoriska synapser i däggdjurshjärnan. Den konstanta omsättning och morfologiska förändringar av ryggar tros tjäna som en god indikator på modifikationer i synapsförbindelser 1-7.
Två-foton laserskanning microscopy erbjuder djup penetration genom täckande produkterna och låg fototoxicitet, vilket gör den lämplig för live-avbildning i den intakta hjärnan 8. I kombination med fluorescerande märkning, ger två-photon imaging ett kraftfullt verktyg för att kika in i den levande hjärnan och följ strukturell omorganisation vid enskilda synapser med hög rumslig och tidsmässig upplösning. Olika metoder har använts för att framställa möss för live-avbildning 9-13. Här beskriver vi en tunnas-skalle beredning av in vivo två-photon avbildning för att utreda den strukturella plasticitet postsynaptiska Dendritutskotten i musen cortex. Med hjälp av denna metod, har våra nya studier visade en dynamisk bild av dendritiska ryggraden förändringar som svar på motorisk inlärning Med ökande tillgången av transgena djur med fluorescerande neuronala delmängder och snabb utveckling av in vivo märkningsteknik, kan liknande förfaranden som beskrivs här också tillämpas att undersökte andra celltyper och kortikala regioner i kombination med andra manipulationer, samt användas i sjukdomsmodeller 16-23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkännande måste inhämtas från hemmainstitutioner före början av operationen och imaging study. Experiment som beskrivs i detta manuskript har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler från University of California, Santa Cruz Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Kirurgi
- Autoklavera alla kirurgiska instrument och sterilisera arbetsytan med 70% alkohol noga innan operationen.
- Bedöva musen genom intraperitoneal (IP) injektion av KX bedövningsmedel lösning (200 mg / kg ketamin och 20 mg / kg xylazin) enligt musens kroppsvikt. Obs: KX Dosen kan justeras beroende på stam, ålder och hälsotillstånd av mössen. Veterinär samråd för att fastställa den optimala dosen rekommenderas också.
- Utför en toe-nypa testet regelbundet genom att trycka på musens tår och kontroll för en reflexiv svar att övervaka anestesi status.Se till att musen är helt bedövad innan operationen Anm. Vid långvarig avbildning sessioner, kolla musens anestesi status regelbundet, administrera ytterligare KX vid behov.
- Placera musen på en värmedyna för att bibehålla kroppstemperatur under operationen.
- Raka huvudet av musen med hjälp av ett rakblad att exponera hårbotten.
- Sterilisera rakade området genom att torka av huden med omväxlande spritsuddar och Betadine. Ta bort eventuella rester av hår-klipp.
- Försiktigt ögonsalva för att smörja båda ögonen, därför att förhindra permanent skada orsakas av uttorkning under experimentet.
- Gör ett rakt snitt längs mittlinjen i hårbotten, och flytta hud sidled mot kanterna av skallen.
- Avlägsna bindväv fäst vid skallen.
2. Förtunnad-skallen Förberedelser
- Identifiera bildområdet utifrån ster. eotaxic koordinater Anm: Försök att undvika stora blodkärl, vilket kvarter ljuspenetrering och sudda ut avbildade strukturer. Kärlsystemet observeras bäst när skallen är fuktig med steril koksaltlösning.
- Använd höghastighetsmikroborr för tunt en cirkulär region i skallen (0,5-1,0 mm i diameter). Flytta borr parallell med skallen ytan, istället för att hålla den mot skallen och trycka ner. Borra tills både den yttre kompakt ben skiktet och mellan svampig ben lagret tas bort. OBS: För att undvika skador på grund av överhettning, undvika långvarig kontakt mellan borrkronan och skallen.
- Fortsätt gallring den inre kompakt ben lager med en mikrokirurgisk blad i mitten av borr-förtunnad region. Håll mikrokirurgiska bladet i en vinkel av cirka 45 ° för att skrapa skallen utan att trycka ned mot skallen tills en jämnt förtunnad liten region (200-300 ^ m diameter) med en tjocklek av ungefärligly 20-30 | im erhålles. På grund av den auto fluorescens av skallen, kan tjockleken mätas genom avläsning av avståndet mellan övre och undre ytan av skallen under två-foton-mikroskop. Obs: även om en skalle tjocklek av mindre än 20 ^ m ger god bildkvalitet, Det rekommenderas inte eftersom det gör gallring processen i efterföljande re-avbildning sessioner svårt. För att undvika en alltför stor förtunning, behöver tjockleken av skallen som ska kontrolleras regelbundet under kirurgi (se Diskussion).
3. Immobilisering
- Ta försiktigt bort ben skräp.
- Placera en liten droppe cyanoakrylatlim på varje kant hos den centrala öppningen av den sterila huvudplatta, som har autoklaverats (se figur 1). Håll huvudet plattan tätt mot skallen med den förtunnade region som ligger i centrum av öppningen. Obs: Om limmet förorenar den uttunnade region av misstag, ta bort det försiktigt med mikrokirurgisk blad.
- Dra försiktigt ut huden från sidorna av skallen till kanterna av den centrala öppningen av huvudplatta.
- Vänta ca 10 min tills huvudplattan är väl fäst på skallen.
- Placera huvudplattan på två sidostenar i kylmagasinet och dra sedan åt skruvarna över kanterna på huvudplattan för att immobilisera musen på anläggningen plattan (se figur 1). Obs: Se till att det inte finns någon hud eller morrhår mellan huvudplattan och blocken innan skruvarna dras åt. En bra immobiliserade preparat bör inte visa några observerbara rörelse av skallen under dissekera mikroskop när baksidan av djuret försiktigt klappade.
- . Skölj det exponerade skallen med koksaltlösning för att avlägsna opolymeriserat lim OBS: Det är viktigt att ta bort eventuella kvarvarande lim, som opolymeriserad lim suddar bilder och skadestånd mikroskop mål <./ Li>
4. Imaging
- Ta ett foto av kärlsystemet i den exponerade skallen med förtunnad regionen Karta 1, som används för att flytta den avbildade regionen i efterföljande avbildning sessioner (se figur 2).
- Placera musen under avbildning mikroskop. Leta upp den uttunnade området under en 10X luft mål med hjälp epifluorescence och flytta den tunnaste området till mitten av vyn.
- Lägg en droppe saltlösning på toppen av skallen och växla till 60X objektiv, som har rengjorts med sterilt vatten. Välj en region där enskilda Dendritutskotten är tydligt visualiseras längs dendriter. Identifiera och märka motsvarande region på kartan 1 genom att jämföra kärl mellan epifluorescent vyn och kärl foto.
- Ställ de två-photon laser våglängd enligt fluoroforer. Till exempel, 920 nm för YFP; 890 nm för GFP; 1000 nm för DsRed och tdTomato 24.
- Förvärva bildstaplar med 2ìm steg längs z-axeln med hjälp av 60X objektiv. Denna bild stack omfattar en ca 200 ìm x 200 ìm område (512 x 512 bildpunkter) och används som karta 2 för omlokalisering under efterföljande avbildning sessioner (se figur 2).
- Förvärva nio bildstaplar i Karta 2 med 3x digital zoom. Varje bildstapel täcker en yta av 70 ^ m x 70 ^ m (512 x 512 pixlar), med 0,7 ^ m steg längs z-axeln. Anm: Intensiteten hos lasern bör vara lägre än 40 mW, mätt vid prov för att minimera fototoxicitet.
5. Återvinning
- Efter bildbehandling, försiktigt loss huvudplattan från skallen.
- Rengör skallen och huden för att ta bort alla kvarvarande lim Anm. Eventuellt kvarvarande lim på huden kommer att orsaka irritationer och bromsa hudens läkning medan eventuellt återstående lim på skallen orsakar erosion av skallen och enngiogenesis i den nyligen vuxit ben lager, vilket gör efterföljande flytt och åter avbildning svårt.
- Skölj skallen och huden med saltlösning ett flertal gånger.
- Sutur hårbotten med steril kirurgisk sutur.
- Hålla djuret på en värmedyna i en separat bur. Administrera buprenorfin analgetikum (0,1 mg / kg) subkutant för att lindra postoperativ smärta. Tillbaka djuret till hemmet buren efter fullständig återhämtning. Övervaka djuret noggrant (se minst en gång dagligen) tills snittet är läkt och suturer tas bort. Administrera efterföljande injektioner av buprenorfin smärtstillande om det behövs.
6. Reimaging
- Upprepa steg från 1,1 till 1,8.
- Upprepa steg från 3,1 till 3,6
- Leta tidigare avbildat område genom att jämföra kärlmönstret på Karta 1 och dendritiska grenen mönster till Karta 2.
- Om reimaging utförs inom 1 vecka, upprepa steg 2,3 för att ta bort det tunna lagret av nyligen vuxit ben ovanpå den förtunnade region med användning av mikrokirurgiska bladet. Om reimaging sker efter mer än 1 vecka, upprepa steg både 2.2 och 2.3 Anm. Den nyligen vuxit ben lagret består av en mindre kondenserad struktur jämfört med den ursprungliga kompakt ben lager, vilket leder till minskad bildkvalitet. Därför, för att få samma kvalitet, är det nödvändigt att tunna skallen något mer än föregående avbildning session.
- Justera läge och orientering för att få bildstaplar som tidigare matchar tagna bildstaplar under två-photon mikroskop.
- Hämta bilder som i steg 4,6.
- Upprepa steg från 5,1 till 5,5 efter avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I YFP-H linje möss 25, uttrycker gula fluorescerande protein i en delmängd av lager V pyramidala nervceller, som skjuter sina apikala dendriter till de ytliga lagren i hjärnbarken. Genom förtunnas-skallen förberedelser, kan de fluorescerande dendritiska segment upprepade avbildas i två-photon mikroskop över olika avbildnings intervaller, allt från timmar till månader. Här visar vi ett exempel på en fyrfaldig avbildning av samma dendriter under 8 dagar i motor cortex av en 1 månad gammal mus, där enskilda ryggar samt filopodia klart kan visualiseras längs dendrit. Vanligtvis är djupet av bildstaplar cirka 100-200 nm från pial ytan. Olika analyser kan utföras baserat på dessa bilder. Till exempel kan ryggraden bildning, eliminering och omsättningen kvantifieras genom att jämföra bilderna från olika sessioner. Spine densitet kan beräknas genom att dividera antalet ryggar genom längden av dendritic-segmentet. Förändringar i ryggraden motilitet och morfologi kan också analyseras.
Figur 1. Skräddarsydda immobilisering plattor av tunnas-skalle förberedelse för två-photon in vivo imaging. (A) Ett fotografi av huvudplattan, som är gjord av två eller tre rakblad limmas ihop, med skarpa kanter som omfattas av band. (B) Ett fotografi av innehavet plattan, som består av 1 rostfri plåt, 2 block av rostfritt stål, 2 skruvar och 2 distanser.
Figur 2. Transkraniell två-photon avbildning genom en tunnas-skalle förberedelse i musen motoriska cortex,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att få en framgångsrik förtunnas-skallen förberedelser, flera steg i detta protokoll är avgörande. 1) Tjockleken av skallen. Den skallbenet har en sandwichkonstruktion, med två lager av hög densitet kompakt ben och ett mellanskikt av låg densitet svampiga ben. Medan höghastighetsmikroborr är lämpliga för avlägsnande av de yttre skikten av kompakt ben och spongiösa benet, är det mikrokirurgiska bladet perfekt för gallring det inre skiktet av kompakt ben. Eftersom tjockleken och styvheten hos skallen ökar under utvecklingen, avbildning av vuxna möss kräver mer benet som skall avlägsnas för att erhålla bilder av god kvalitet. Den förtunnade area uppvisar en transparent fast utseende och ger god bildkvalitet när tjockleken av skallen är cirka 20-30 jim. Skallen tjocklek bör kontrolleras regelbundet under gallringsprocessen som över gallring gör gallringsprocessen i efterföljande reimaging sessioner svårt. 2) Storleken på den uttunnade regionen.Det är viktigt att etablera en stabil förtunnas-skallen-konfiguration, där en kon-liknande hålighet uppnås. Arkitekturen i förtunnad region med en lämplig storlek förhindrar att orsaka skada på cortex och hjälper gallring i efterföljande re-imaging sessioner. Det rekommenderas att göra botten yta (cirka 200-300 nm i diameter) av den förtunnade regionen är mindre än den övre öppningen (ungefär 0,5-1,0 mm i diameter). 3) Stabiliteten hos bilderna. En väl immobiliserade preparat bidrar till att förbättra bildkvaliteten genom att minska andnings-inducerad rörelse artefakter. Det är viktigt att hålla skallen torra och saknar bindväv och ben skräp innan huvudplattan är fäst på skallen. Extra lim kan också appliceras för att fylla de återstående luckorna mellan huvudplattan och skallen. Dessutom riktar ett område från stora kärl också minimerar rörelser som orsakas av blodet att pumpa.
Undersökning av förändringar i behåpå levande djur med hög rumslig och tidsmässig upplösning med hjälp av två-photon mikroskopi kräver generering av ett optiskt fönster. Förutom förtunnas-skallen förberedelser, kan fluorescerande strukturer också visualiseras genom att ta bort skallen och ersätta den med ett täckglas (vanligtvis 3-5 mm i diameter) som ger en tydlig bildåtergivning fönster 10, 13. Medan både tunnas-skalle och öppna skallen avbildningsprotokoll kan användas i stort sett för in vivo imaging studier, har varje metod sina fördelar och är lämplig för olika experimentella design. Till exempel är den öppna skalle preparat användbara för studier som undersöker relativt stora områden i hjärnan (t ex 5 mm i diameter) och som kräver många avbildning sessioner med korta intervall (dvs dagar). När kraniala fönstret framgångsrikt implanteras, är ingen ytterligare operation behövs. Men en efter operationen period (vanligen ca 1 månad) krävs innan den första avbildningsession för att lindra eventuella inflammatoriska reaktioner som orsakas av kirurgi. Re-imaging blir omöjligt när det kraniala fönstret blockeras av återväxt av ben och / eller förtjockning av hjärnhinnorna. I motsats härtill kan djur med en förtunnad-skalle preparat skall avbildas direkt efter den första operationen, vilket gör den mer lämplig för kronisk avbildning av yngre djur (t.ex., 2 veckor gamla). Den är lämplig för utredning med långa avbildningsintervall (dvs. månader till år), eftersom benet återväxt och dura förtjockning är inte problematiskt. Emellertid åter gallring av skallen som normalt krävs för efterföljande re-avbildning sessioner (även med 2 dagars intervall) på grund av benet återväxt. Dessutom består den nyligen vuxit benet lager av en mindre kondenserad struktur jämfört med den ursprungliga kompakt ben, vilket minskar insynen i förtunnas-skallen-regionen. Därför, för att få samma kvalitet på bilderna, är det nödvändigt att helt ta bort den nyligen vuxit benet lager. Och en sådanttempts vanligtvis leda till den slutliga tjockleken av skallen i den efterföljande avbildning tunnare än den tidigare beredningen. Eftersom skallen tjockleken hade varit beredd att 20-30 nm i den ursprungliga avbildning session, lämnar begränsat utrymme för åter gallring, är oftast den totala avbildningstider tunnas-skalle förberedelse mindre än fem gånger. Nyligen, en ny experimentell metod som heter polerad och förstärkt förtunnad-skallen (portar) har utvecklats för att kombinera båda uttunnade-och öppen-skalle preparat 11, 26, 27.
Hittills har de flesta av in vivo imaging i cortex utförts med hjälp av transgena möss som uttrycker EGFP eller YFP i neuronal specifik Thy1 promotor. Dessa transgena möss uttrycker fluorescerande proteiner glest i en undergrupp, men blandad befolkning av kortikala neuroner 25. Eftersom många rader av bevis tyder på att erfarenheten beroende strukturell plasticitet händer i selective celltyperna av väldefinierade kretsar är det viktigt att märka och bild i en cell-typ specifikt sätt. Hittills har många metoder använts för att uppnå detta mål. Till exempel kan pyramidala nervceller i olika kortikala skikt riktas genom att utföra i livmodern elektroporering vid definierade embryonala stadier 28, 29. På samma sätt kan insprutning av virala vektorer för att uttrycka ett fluorescerande protein också användas för att märka celler i olika områden i hjärnan 30. Dessutom har många linjer av transgena möss som tagits fram för att driva uttrycket av Cre-rekombinas enligt celltypspecifikt promotorer 31, 32. Injektion av virala vektorer såsom adeno-associerade virus som bär fluorescerande reportergenen efter en floxade stoppkodon in i dessa möss ger möjlighet att rikta en viss klass av nervceller i ett begränsat område, 33. Genom att kombinera dessa nya märkning metoder med vår förtunnas-skull förberedelse, kan förändringar i synapsförbindelser av kortikala neuroner utredas av två-photon in vivo imaging i en celltyp-och / eller krets-specifikt sätt.
Med den ökande tillgängligheten av transgena djur med kan fluorescensmärkta cellpopulationer och den snabba utvecklingen av in vivo-märkningstekniker, eller liknande förfaranden som beskrivs här också användas för att undersöka andra celltyper (gliaceller) och kärl i den levande hjärnan. I kombination med beteende manipulationer och sjukdomsmodeller, två-photon in vivo imaging kommer att kraftigt utöka vår förståelse av de molekylära, cellulära och krets mekanismerna bakom hjärnfunktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar James Perna för grafisk illustration. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institute of Mental Health till YZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
References
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
- Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
- Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
- Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
- Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
- Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
- Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
- Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
- Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
- Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
- Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).
