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Immunology and Infection

जीन एक्सप्रेशन के सभी चरणों में वायरल फंक्शन बढ़ाता के लिए चेचक रिपोर्टर वायरस

Published: May 15, 2014 doi: 10.3791/51522
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Boston University School of Medicine

Summary

हम प्रेतसंबंधी अलग संवाददाता fluorophores के मंच विशिष्ट अभिव्यक्ति के माध्यम से वायरल संक्रामकता और जीन अभिव्यक्ति की वास्तविक समय माप सक्षम बनाता है एक फ्लोरोसेंट संवाददाता चेचक वायरस के उपयोग का वर्णन. हम विस्तार सही वायरस प्रतिकृति छोटे अणु अवरोध के जवाब में प्रभावित होता है, जिस पर मंच की पहचान करने के लिए एक प्लेट आधारित विधि.

Abstract

Poxviruses सक्रिय मानव ऐसे monkeypox के रूप में रोगजनकों, कोमलार्बुद contagiousum, और Contagalo वायरस शामिल है कि डबल असहाय डीएनए वायरस का एक परिवार है. परिवार भी चेचक वायरस, शीतला शामिल हैं. कारण poxvirus प्रतिकृति की जटिलता के कारण, कई सवाल अभी भी उनके जीन अभिव्यक्ति की रणनीति के बारे में रहते हैं. इस लेख में हम एक उच्च throughput प्रारूप में वायरल जीन अभिव्यक्ति का एक और कई चरणों की वास्तविक समय की माप है कि सक्षम पुनः संयोजक चेचक वायरस की अवधारणा और उपयोग का वर्णन. इस वायरल प्रतिकृति के तीन चरणों में से प्रत्येक के लिए संवाददाताओं के रूप में प्रेतसंबंधी अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग के माध्यम से सक्षम है. मंच विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न, सक्रिय करने के प्लेट आधारित assays और वायरस प्रचार और नकल की सूक्ष्म टिप्पणियों को बनाए रखना है, जबकि ये वायरस एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदान करते हैं. ये उपकरण एंटीवायरल खोज, वायरस मेजबान बातचीत का अध्ययन, और विकासवादी जैव के लिए उपयोग करता हैसना हुआ.

Introduction

परंपरागत रूप से, वायरस अभिव्यक्ति आणविक जीव विज्ञान तकनीक (जैसे उत्तरी सोख्ता, पश्चिमी सोख्ता, माइक्रोएरे संकरण, आदि) 1 का उपयोग का अध्ययन किया जाता है. इन तरीकों व्यक्ति mRNAs या प्रोटीन की अभिव्यक्ति परिवर्तन के वर्गीकरण के संबंध में विस्तृत जानकारी प्रदान करने में सक्षम हो रहे हैं, वे आम तौर पर वास्तविक समय और उच्च throughput प्रक्रियाओं के लिए उत्तरदायी नहीं हैं. Poxviruses साथ कार्य करते समय प्रतिदीप्ति आधारित संवाददाताओं का उपयोग वैकल्पिक तरीकों पहले से लागू किया गया है; हालांकि, उनके विकास और उपयोग के विभिन्न उद्देश्य से प्रेरित किया गया है. कई ऐसे तरीकों पुनः संयोजक वायरस 2,3 के चयन के लिए डिजाइन किए गए थे. इन तकनीकों में उचित समावेश और पुनः संयोजक चेचक क्लोन से एक्सोजेनस डीएनए की अभिव्यक्ति पर EGFP व्यक्त करते हैं. इसी तरह, कई चेचक उपभेदों stably घुलनशील EGFP व्यक्त या एक देशी चेचक प्रमोटर के तहत व्यक्त GFP टैग प्रोटीन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है. ये typ हैंically वायरस प्रवेश और प्रतिकृति एंटीबॉडी आधारित निराकरण assays के दौरान, रासायनिक अवरोध, या antiviral प्रभाव को 4-6 की तुलना यों इस्तेमाल किया. इन वायरस उपयोगी साबित हुए हैं, वे कारण एक भी अस्पष्ट देर / जल्दी वायरल प्रमोटर के अपने उपयोग के लिए निषेध की बात के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता में सीमित कर रहे हैं. पिछले विधियों भी suboptimal संकेत करने वाली शोर विशेषताओं के साथ EGFP प्रोटीन का इस्तेमाल किया है.

कारण poxvirus प्रतिकृति और वायरल जीन अभिव्यक्ति में वास्तविक समय में परिवर्तन परख उपलब्ध मौजूदा उपकरणों की कमी की जटिलता के कारण, हम एकल और बहु मंच संवाददाता वायरस 7,8 के एक कमरे का विकास किया है. पिछले प्रकाशनों में वर्णित है, इन वायरस, जल्दी संक्रमण में मध्यवर्ती, या देर चरणों के दौरान एक, दो, या देशी चेचक प्रमोटरों से तीन प्रेतसंबंधी अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं. ये वायरस हमें हो सकता हैएक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग वायरस प्रतिकृति प्रगति के संकेतक के रूप में एड और वे उच्च throughput प्लेट और पाठक आधारित assays के लिए समान रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है. ये वायरस बराबर titers 7 तक पहुँचने के लिए इसी तरह कैनेटीक्स के साथ बढ़ रही है, जंगली प्रकार के वायरस के स्थान पर प्रयोग करने में आसान हैं. योजना और इन वायरस के निर्माण के दौरान, बहुत देखभाल अभिव्यक्ति (वीनस, mCherry और TagBFP) में परिवर्तन करने के लिए तेजी से प्रतिक्रिया के साथ विश्वसनीय मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए बेहतर तह दक्षता के साथ उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि विशेषताओं है कि fluorophores के चयन में लिया गया था. इसके अतिरिक्त, वायरल प्रमोटरों के संयोजन अस्पष्ट के विपरीत, उच्च निष्ठा, स्पष्ट चरण विशिष्ट अभिव्यक्ति, (C11R प्रमोटर) जल्दी की पूरी रेंज के बारे में जानकारी प्रदान करने, मध्यवर्ती (G8R प्रमोटर) और देर से (F17R प्रमोटर) जीन अभिव्यक्ति का उत्पादन जो चुने गए जल्दी / देर प्रमोटरों.

ये वायरस inve के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैआद्य poxvirus, चेचक वायरस के जीवन चक्र stigating. ज्यादातर अध्ययन के अपने लंबे इतिहास के बावजूद अभी भी मेजबान वायरस बातचीत के बारे में ज्ञात नहीं है. चेचक immunomodulatory हैं और विरोधी की मेजबानी जिनमें से कई की 200 से अधिक अद्वितीय प्रोटीन, उत्पादन, जटिल है. संक्रमण पर, चेचक वायरस तुरंत जल्दी mRNA प्रतिलेखन शुरू होता है. इस virion पैकेजिंग के दौरान वायरल जीनोम पर लोड और बाद में संक्रमण जब तक एक रुका हुआ राज्य में आयोजित की गई है कि एक शाही सेना पोलीमरेज़ और प्रतिलेखन कारक से मदद की है. यह जल्दी अभिव्यक्ति मुख्य रूप से मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली (mRNA decapping, dsRNA ज़ब्ती, और प्रलोभन रिसेप्टर प्रोटीन के साथ ही apoptosis की inhibitors, तनाव प्रतिक्रिया, और टोल, आईएल, और NF-κB संकेतन) और जीनोम प्रतिकृति के दमन के लिए आवश्यक प्रोटीन पैदा करता है. प्रारंभिक अभिव्यक्ति भी मध्यवर्ती अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक प्रतिलेखन कारक पैदा करता है. इंटरमीडिएट अभिव्यक्ति देर चरण प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति भी शामिल है. यहअभिव्यक्ति झरना परिपक्व चेचक virion की पूरी विधानसभा के लिए आवश्यक हैं जो संक्रमण की देर चरणों के दौरान संरचनात्मक और enzymatic वायरस प्रोटीन के उत्पादन की ओर जाता है.

फ्लोरोसेंट संवाददाता वायरस के हमारे सेट poxvirus जीव विज्ञान की समझ में किए जाने के लिए तेजी से प्रगति के लिए अनुमति देता है. विषाणु विज्ञान के क्षेत्र में सबसे आम है और समय लेने वाली विधियों में से एक विकास परख है. यह आम तौर पर, कोशिकाओं को संक्रमित संक्रमित कोशिकाओं lysing द्वारा उपचार, फसल कटाई के वायरस की एक श्रृंखला अभिनीत, और पट्टिका परख द्वारा परिणामस्वरूप वायरल अनुमापांक बढ़ाता शामिल है. यहाँ वर्णित संवाददाता वायरस का उपयोग आसानी से assayed और समानांतर में प्रदर्शन के लिए कई उपचार के बीच तुलना की जा सकती है कि वायरस के विकास की वास्तविक समय माप की अनुमति देता है. हम अभिकर्मकों के इस सेट दवा उपचार, आरएनएआई कश्मीर के जवाब में वायरल जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान करने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाएगा उम्मीदnockdown, या मेजबान रेंज प्रतिबंध.

यह विधि भी ब्याज की विशेष रूप से परिभाषित लक्ष्य के चरणों के लिए उच्च throughput विरोधी वायरल दवा स्क्रीन के लिए अनुमति देता है, पहले से उपलब्ध की तुलना में एक बड़े पैमाने पर उच्च सामग्री विश्लेषण में सक्षम बनाता है. Poxvirus संक्रमण का मुकाबला करने के लिए कई संभावित उपचार पहचान की गई है, केवल एफडीए poxvirus संक्रमण के इलाज के लिए प्रभावी उपचार अचक्रीय phosphonate न्यूक्लीओसाइड, cidofovir, और चेचक प्रतिरक्षा ग्लोब्युलिन 9,10 के साथ इलाज कर रहे हैं मंजूरी दे दी. 1977 11 में चेचक के उन्मूलन के बावजूद, poxviruses मानव स्वास्थ्य 12 के लिए एक महत्वपूर्ण खतरा बने हुए हैं. शीतला वायरस के खिलाफ बड़े पैमाने पर टीकाकरण की समाप्ति के अन्य poxviruses 13 के लिए बढ़ा संवेदनशीलता के लिए प्रेरित किया. उदाहरण के लिए, पहले से टीकाकरण द्वारा संरक्षित मध्य अफ्रीका के क्षेत्रों monkeypox वायरस के संक्रमण के 14 में वृद्धि का सामना कर रहे हैं. महत्वपूर्ण चिंता का विषय भी कर दिया गया हैशीतला वायरस की जानबूझकर रिलीज करने के लिए अव्यक्त संवेदनशीलता के बारे में उठाया. कारण वर्तमान में उपलब्ध सीमित उपचार के लिए उपन्यास उपचार के विकास के लिए एक तत्काल आवश्यकता है. ये संवाददाता वायरस वायरल प्रतिकृति के एक विशिष्ट चरण के निषेध के लिए तेजी से और उच्च throughput छोटे अणु अवरोध करनेवाला स्क्रीनिंग अनुमति देते हैं. निषेध का फिलहाल नहीं लक्ष्य वायरल अभिव्यक्ति चरणों inhibitors कि लक्ष्य की पहचान में वृद्धि हुई शक्ति के साथ संयोजन के उपचारों के विकास की सुविधा होगी.

ज्यादा प्रत्येक चरण के जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन देख द्वारा चेचक कोशिका जीव विज्ञान के बारे में बटोरा जा सकता है. रासायनिक या एक संक्रमित मेजबान सेल की आनुवंशिक हेरफेर से क्षीणन आम तौर पर कम वायरल titers के संदर्भ में व्यक्त किया जाता है. हालांकि, वायरल अभिव्यक्ति झरना के प्रत्येक चरण में परिवर्तन की तुलना करके, एक वायरस फिटनेस प्रभाव है कि कैसे की एक और पूरी समझ प्राप्त कर सकते हैंएक विशेष उपचार द्वारा एड. ये आंकड़े पारंपरिक वायरस टिटर उत्पादन के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी, लेकिन और अधिक विस्तृत यंत्रवत जानकारी के साथ ही उच्च throughput क्षमताओं 7 प्रदान करने के लिए दिखाया गया है.

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Protocol

1. प्लेट कोशिकाओं

  1. थाली से HELA कोशिकाओं को अलग कर देना और लगभग 2.0 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल विकास मीडिया (DMEM, 2 मिमी एल भरमार, 10% FBS) में पतला. एक काले रंग की दीवारों, स्पष्ट फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली (20,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में 100 μl / अच्छी तरह से बांटना.
  2. + 5% सीओ 2 के एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मिला हुआ जब तक 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.

2. कोशिकाओं को संक्रमित

  1. वायरस पतला और कोशिकाओं को संक्रमित.
    1. पिघलना TrpV (ट्रिपल वायरस, अर्ली वीनस, मध्यवर्ती mCherry, स्वर्गीय TagBFP) और PLV (प्रोमोटर कम वीनस) फ्लोरोसेंट वायरस और 5 मिनट के लिए sonication का उपयोग disaggregate. वैकल्पिक रूप से, कच्चे तेल वायरस शेयरों संक्रमण मीडिया में 0.25 मिलीग्राम / एमएल trypsin साथ 1:1 मिलाया और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated किया जा सकता है.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस संक्रमण मीडिया (DMEM, 2 मिमी एल भरमार, 2% FBS) में कच्चे तेल वायरस शेयरों पतला. उच्च MOI संक्रमण (10 pfu / सेल) के लिए, pfu / एमएल 5 एक्स 10 4 संभालने 1.0 10 x 7 के लिए वायरस शेयर पतलाअच्छी तरह से कोशिकाओं / और 50 μl के एक inoculum मात्रा. TrpV साथ प्रत्येक उपचार और प्रत्येक उपचार के लिए विशिष्ट पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए खाते में PLV साथ ही इलाज के लिए एक और 3 को दोहराने के कुओं के लिए 3 को दोहराने के कुओं से संक्रमण पर योजना.
    3. संक्रमण मीडिया में 50 μl / अच्छी तरह पतला वायरस जोड़कर कुओं को संक्रमित. इस समय = 0 घंटे बाद संक्रमण (0 HPI) के रूप में परिभाषित किया गया है.
  2. संक्रमण मीडिया में वांछित उपचार यौगिकों पतला. सभी को उपचार के लिए एक एकल 2x मास्टर मिश्रण कमजोर पड़ने बनाया और वेल्स (50 μl प्रत्येक के साथ छह 96 कुओं के लिए जैसे 350 μl कुल मात्रा) को दोहराने के लिए लागू किया जाना चाहिए.
    1. संक्रमण मीडिया में प्रयोगात्मक यौगिकों पतला.
    2. संक्रमण मीडिया में वाहन नियंत्रण विलायक (जैसे पीबीएस, DMSO) पतला. नोट: प्रयोगात्मक यौगिकों (जैसे के लिए आवेदन के रूप में अपने IBT शेयर DMSO के साथ बनाया है और एक अंतिम concentratio में प्रयोग किया जाता है, तो वाहन नियंत्रण विलायकों के इसी तरह के अंतिम सांद्रता इस्तेमाल किया जाना चाहिए1 μl के एनएस / एमएल, तो वाहन पर नियंत्रण के रूप में 1 μl / एमएल) में अकेले DMSO का उपयोग करें.
    3. संक्रमण मीडिया में नियंत्रण यौगिकों पतला. अनुशंसित नियंत्रण यौगिकों शामिल हैं: 3.6 माइक्रोन (1 ग्राम / एमएल) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (ARAC), 50 माइक्रोन (11.7 ग्राम / एमएल) आइसटिन β-thiosemicarbazone (आई बी टी), 60 माइक्रोन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) रिफैम्पिसिन, या 5 माइक्रोन (1.9 माइक्रोग्राम / एमएल) अनुसूचित जनजाति 246 8,15,16. उम्मीद प्रभाव के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें. नोट: यह अच्छी तरह से पहले से ही मात्रा के लिए एक 1:1 के अनुपात में जोड़ा जाता है के बाद से दो बार (2x) वांछित अंतिम एकाग्रता इस कमजोर पड़ने बनाते हैं.
  3. तुरंत वायरस के बाद इसके अलावा, 2.2 कदम में पतला के रूप में वांछित उपचार और नियंत्रण युक्त 50 μl संक्रमण मीडिया जोड़ें. नोट: प्रारंभिक चरण अभिव्यक्ति से पहले निषेध के लिए परख के लिए, यौगिक (ओं) या तो पतला वायरस inoculum (कदम 2.1.2) को सीधे जोड़ा जा सकता है या (कदम 2.1.3 से पहले) के संक्रमण से पहले कोशिकाओं को होस्ट करने के लिए.
  4. एक 37 और # में 6-24 घंटा सेते176, सी इनक्यूबेटर + 5% सीओ 2.

3. कोशिकाओं को ठीक करें

  1. अच्छी तरह से पहले से ही प्रत्येक में संक्रमण मीडिया के लिए 100 μl 8% paraformaldehyde जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें. प्रकाश से सुरक्षित 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. नोट: यह उच्च टिटर मीडिया पूर्व निर्धारण के लिए बेकार डिश में सीधे उलटा है तो हो सकता है, जो संक्रामक चेचक की aerosolization को रोकने के लिए सीधे संक्रमण मीडिया को 2x पीएफए ​​(8%) जोड़ने की सिफारिश की है.
  2. अपशिष्ट डिश में थाली inverting द्वारा लगानेवाला निकालें.
  3. कमरे के तापमान पीबीएस के 100 μl जोड़ें.
  4. ऑप्टिकली स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली सील. नोट: तुरंत पढ़ नहीं अगर प्लेट्स 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर माप विकृत से संक्षेपण को रोकने के लिए पढ़ने से पहले कमरे के तापमान को सील प्लेटें वापस करने के लिए सुनिश्चित करें.

4. वायरस विकास यों

  1. समापन बिंदु mCherry के लिए वीनस, 587:610 के लिए 515:530 में प्रतिदीप्ति, और 415:457 च उपायया TagBFP (उत्तेजना: एनएम में उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य). चार मापन हर चैनल के लिए अनुकूलित लाभ सेटिंग्स का उपयोग अच्छी तरह से प्रति औसतन किया जाना चाहिए. नोट: उपयुक्त उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य अपनी थाली पाठक के विशिष्ट मॉडल और फिल्टर विशेषताओं के आधार पर भिन्न हो सकता है. यह हर चैनल के लिए TrpV और PLV के बीच सबसे बड़ा अंतर नहीं है, जहां बिंदु निर्धारित करने के लिए एक तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन स्कैन प्रदर्शन करके अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है.
  2. प्रयोगों के बीच तुलना की सुविधा के लिए कच्चे डेटा मानक के अनुसार.
    1. प्रत्येक चैनल के लिए दोहराने TrpV और PLV कुओं का मतलब निर्धारित करते हैं.
    2. प्रत्येक उपचार के लिए मतलब TrpV संक्रमित प्रयोगात्मक माप से मतलब PLV संक्रमित पृष्ठभूमि माप घटाएँ.
    3. अच्छी तरह से वाहन केवल मूल्य से प्रत्येक पृष्ठभूमि घटाया मूल्य विभाजित करके डेटा मानक के अनुसार.
    4. एक प्रयोग कई बार, विचरण का एक तरह से विश्लेषण (एक तरह से एनोवा) परीक्षण और कई ग दोहराया गया है एक बारomparison परीक्षण के बाद उपचार के किसी भी चैनल के लिए प्रत्येक वाहन ही उपचार से एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है, तो यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है.

5. वैकल्पिक प्रोटोकॉल: काइनेटिक प्लेट Assays

  1. उपचार के अलावा के माध्यम से सभी चरणों को पूरा करें (2.3 कदम).
  2. प्लेट पाठक कक्ष में चिपकने वाला फिल्म और जगह के साथ सील थाली 37 डिग्री सेल्सियस तक equilibrated नोट: विशेष देखभाल अनुचित सेल तनाव और संक्षेपण को रोकने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लगातार प्लेटें रख लिया जाना चाहिए. गतिज assays के लिए, यह 5% सीओ 2 के अलावा बिना उचित पीएच बनाए रखने के लिए एक बफर मध्यम (सोडियम बाइकार्बोनेट और HEPES) का उपयोग करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
  3. सेट प्लेट रीडर बाद में समय अंक की संतृप्ति को रोकने के लिए मैन्युअल रूप से प्राप्त करें. नोट: सटीक लाभ अनुकूलन ऐसी ही परिस्थितियों में एक endpoint assays के प्रदर्शन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
  4. 8-24 HPI के लिए प्रति घंटा की रीडिंग मोल और सिमी का उपयोग कर मानक के अनुसारसमापन बिंदु परख में के रूप में लोकप्रिय प्रक्रिया (4.2 कदम).
  5. व्यक्तिगत समय अंक में पहले वर्णित समापन बिंदु परख के रूप में इसी तरह के तरीकों का उपयोग कर सांख्यिकीय महत्व के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.

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Representative Results

इन वायरस के विशिष्ट उपयोग का एक उदाहरण के रूप में, ट्रिपल प्रतिदीप्ति संवाददाता वायरस कई अच्छी तरह से परिभाषित poxvirus inhibitors के निषेध की बात तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

HELA कोशिकाओं काली दीवारों स्पष्ट फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें इलाज और रातोंरात incubated टिशू कल्चर में चढ़ाया गया. (TrpV, 1 टेबल) मिला हुआ monolayers ट्रिपल संवाददाता वायरस का उपयोग 10 के संक्रमण की बहुलता (MOI) में संक्रमित थे या प्रमोटर कम वीनस थाली मानचित्र (चित्रा 1) पर विस्तृत रूप में (PLV). उपचार युक्त संक्रमण मीडिया 0.1% DMSO, 3.6 माइक्रोन (1 ग्राम / एमएल) की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ा गया है ARAC, 50 माइक्रोन (11.7 ग्राम / एमएल) IBT, 5 माइक्रोन (1.9 माइक्रोग्राम / एमएल) अनुसूचित जनजाति-246 या 60 माइक्रोन तीन प्रतियों में (50 माइक्रोग्राम / एमएल) रिफैम्पिसिन. सभी शेयरों DMSO में 1 μl / मिलीलीटर में इस्तेमाल किया गया अवरोध करनेवाला के बाद से 0.1% DMSO के वाहन पर नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्लेट एक 37 डिग्री सेल्सियस incubato को लौट रहा थाआर 18 HPI तक. सभी सेल वेल्स को 100 μl 8% पीएफए ​​के अलावा द्वारा 15 मिनट के लिए तय की और एक प्लेट रीडर पर पढ़ने जब तक प्रकाश से सुरक्षित पीबीएस में संग्रहीत किया गया. प्रतिदीप्ति रीडिंग एक Tecan अनंत M1000 प्लेट रीडर का उपयोग किया जाता है और उत्तेजना में अच्छी तरह से प्रति नीचे पढ़ने 4 अंक मैं नियंत्रण सॉफ्टवेयर (v1.5.14.0) थे: 515:530 का उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, 587:610, वीनस के लिए 415:457 एनएम , mCherry, और TagBFP fluorophores, क्रमशः. पहले अंतिम माप के लिए, लाभ (लाभ क्रमशः, हरे, लाल और नीले रंग की माप के लिए आम तौर पर 235, 255, 235 था) सेंसर की संतृप्ति के बिना अधिक से अधिक संकेत की अनुमति के लिए अनुकूलित किया गया था.

चित्रा 1
चित्रा 1. करोड़ के लिए इस्तेमाल थाली संक्रमण 96 अच्छी तरह से और छोटे अणु इसके अलावा इस योजना का 96 अच्छी तरह से थाली. चित्र पर संक्रमण और दवा उपचार के प्रतिनिधि लेआउटप्रतिनिधि परिणाम खा रहा है. ट्रिपल फ्लोरोसेंट वायरस (TrpV, हल्के भूरे रंग) जल्दी वीनस, मध्यवर्ती mCherry, और देर TagBFP या प्रमोटर कम वीनस (PLV, गहरे भूरे) व्यक्त तीन प्रतियों कॉलम में उपयोग किया जाता है. 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (ARAC), β-thiosemicarbazone (iBT) आइसटिन, रिफाम्पिसिन, अनुसूचित जनजाति 246 और परीक्षण किया एकाग्रता के साथ DMSO के वाहन पर नियंत्रण का अधिकार पर संकेत कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्रत्येक को दोहराने के लिए रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) प्रत्येक चैनल के लिए सामान्यीकृत थे. सबसे पहले, PLV वेल्स के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रत्येक दवा योगदान पृष्ठभूमि तीव्रता के लिए खाते में प्रत्येक उपचार के लिए TrpV कुओं का मतलब तीव्रता से घटाया गया था. इसके बाद, इस मूल्य DMSO के इलाज TrpV कुओं का मतलब तीव्रता (जंगली प्रकार विकास) घटाया पृष्ठभूमि से विभाजित किया गया था. ज्ञात पुलिस के साथ उपचार के बाद प्राप्त परिणामxvirus inhibitors पहले प्रकाशित निष्कर्ष और कार्रवाई की उनकी समझ में आ तंत्र के अनुरूप था. जल्दी जीन प्रतिलेखन और मध्यवर्ती जीन की अभिव्यक्ति के लिए संक्रमण की समाप्ति के डीएनए प्रतिकृति 17 की आवश्यकता के लिए दिखाया गया है. और मध्यवर्ती की एक पूर्ण अभाव और देर अभिव्यक्ति (0.4% और इलाज DMSO के 0.3%, इस के अनुरूप, ARAC, डीएनए प्रतिकृति के एक अवरोध करनेवाला, जल्दी जीन अभिव्यक्ति में एक नाटकीय वृद्धि (चित्रा 2 DMSO के इलाज जल्दी अभिव्यक्ति की 210%) से पता चला क्रमशः मध्यवर्ती और देर अभिव्यक्ति,, चित्रा 2). कार्रवाई की सटीक व्यवस्था IBT के लिए निर्धारित नहीं है, यह dsRNA, RNase एल मार्ग और apoptosis 18-20 की सक्रियता की मात्रा में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप, पढ़ने के माध्यम से प्रतिलेखन को बढ़ावा देने के लिए सोचा है. एक उत्तरोत्तर गंभीर phenotype जिसमें मनाया गया IBT उपचार के जवाब में मध्यवर्ती और देर अभिव्यक्ति अकेले DMSO (24.7% की तुलना में काफी कम थेऔर DMSO के 2.9% क्रमशः, मध्यवर्ती और देर अभिव्यक्ति के लिए इलाज, चित्रा 2). एक सुसंगत, लेकिन सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं कमी जल्दी प्रतिदीप्ति भी मनाया गया; हालांकि यह यह इस वजह से यह बाद में समय बिंदु पर IBT प्रेरित apoptosis (18 HPI पर DMSO के 74.0%) होने की संभावना. Arac और IBT के विपरीत, poxvirus दवाओं ST-246 और रिफाम्पिसिन दोनों virion विधानसभा और परिपक्वता 15,16 दौरान देर जीन अभिव्यक्ति के बाद रोकना. या रिफैम्पिसिन (107.6%,; कोशिकाओं ST-246 (चित्रा 2 100.9%, 98.5%, और जल्द ही इलाज DMSO के 94.5%, मध्यवर्ती और देर अभिव्यक्ति, क्रमशः) के साथ या तो इलाज किया गया जब जीन अभिव्यक्ति में कोई बदलाव नहीं सभी चरणों के दौरान देखा गया 104.2%, और जल्द ही इलाज DMSO के 106.5%, मध्यवर्ती और देर अभिव्यक्ति, क्रमशः).

चित्रा 2
.. ओंग> चित्रा 2 स्टेज poxvirus एंटीवायरल दवाओं से उत्पन्न अवरोध का HELA कोशिकाओं को संक्रमित और प्रतिनिधि परिणाम में वर्णित के रूप में इलाज किया गया (RFU रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों दिखा खंड ए) चार्ट, पृष्ठभूमि प्रत्येक उपचार और सामान्यीकृत के लिए PLV विकास के आधार पर प्रत्येक चैनल घटाया. जल्दी (हरे रंग के लिए TrpV + DMSO)) के लिए, मध्यवर्ती (लाल), और देर से (नीला) वायरल अभिव्यक्ति. प्रकोष्ठों 0-18 HPI के लिए संकेत दिया यौगिकों की उपस्थिति में बड़े हो रहे थे. मानक विचलन के साथ मतलब प्रत्येक तीन प्रतियों में प्रदर्शन चार जैविक प्रतिकृति के लिए दिखाया गया है. 18 HPI पर प्रत्येक अच्छी तरह से उपचार की (*** पी <0.0005, * <0.05 पी) एक नमूना टी परीक्षण प्रत्येक उपचार और DMSO चैनल जोड़ी के लिए प्रदर्शन किया गया और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद तारक से चिह्नित कर रहे हैं. बी) छवियों. सभी छवियों को एक Zeiss 200M epifluorescence माइक्रोस्कोप और इसी पहुंचा जोखिम पर 10X उद्देश्य से कब्जा कर लिया गया. Scalebar = 100 माइक्रोन.files/ftp_upload/51522/51522fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एक नए छोटे अणु या वायरस उत्परिवर्ती की निरोधात्मक प्रभाव की खोज जब ऐतिहासिक, कम MOI (0.01-0.1 pfu / सेल) और उच्च MOI का एक संयोजन (5-10 pfu / सेल) विकास assays उपयोग किया जाता है. कोशिकाओं का केवल एक उप शुरू में संक्रमित है के बाद से एक कम MOI में, समग्र निरोधात्मक प्रभाव अक्सर भी मामूली निषेध द्वारा अतिरंजित हैं. एक वायरस हिचकते है, जिस पर एक संक्रमण चक्र के दौरान बिंदु को परिभाषित करने की कोशिश कर रही है कि सभी कोशिकाओं को अपनी प्राथमिक inoculum से संक्रमित होते हैं, के रूप में एक उच्च MOI संक्रमण होने की संभावना अधिक उपयुक्त है. 3 चित्र में दिखाया प्रयोग 1 = एक कम MOI में संक्रमित थे कि कुओं का एक सेट के अलावा के साथ चित्रा 2 के रूप में प्रदर्शन किया गया था. बाद transcriptionally कार्य करता है कि एक अवरोध करनेवाला के रूप में, अनुसूचित जनजाति 246 जीन अभिव्यक्ति के किसी भी स्तर को प्रभावित नहीं करना चाहिए ; हालांकि, यह जब कोशिकाओं का केवल एक उप infecte है कि स्पष्ट हैडी (चित्रा 3, moi = 1) अभिव्यक्ति के सभी चरणों (38.4%, 48.9%, और 100.9%, 98.5%, और MOI के लिए 94.5% की तुलना में DMSO के 52.9% का स्पष्ट निषेध है = 1 बनाम MOI = 10 क्रमशः, जल्दी मध्यवर्ती और देर अभिव्यक्ति की संक्रमण स्तर,, चित्रा 3). अनुसूचित जनजाति के 246 से परिपक्व virion गठन की 100% निषेध मानते हुए, इस 10 संक्रमण, और कोशिकाओं के बीच कहीं 50 और 70% उत्पादकता MOI = 1 संक्रमण के दौरान संक्रमित थे = कोशिकाओं की 100% MOI से संक्रमित थे मतलब है.

चित्रा 3
चित्रा 3. स्पष्ट अनुसूचित जनजाति 246 निषेध पर संक्रमण के स्तर का प्रभाव. उच्च दोनों के साथ चित्रा 2 के रूप में संक्रमित HELA कोशिकाओं (MOI 10 =) और कम ST-246 के साथ इलाज TrpV (MOI = 1). रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU; पृष्ठभूमि हर चैनल आधारित ओ घटायाn PLV जल्दी (हरे रंग के लिए TrpV + DMSO के लिए प्रत्येक उपचार और सामान्यीकृत) के लिए विकास), मध्यवर्ती (लाल), और देर से (नीला) MOI = 1 या MOI या तो संक्रमित कोशिकाओं में वायरल अभिव्यक्ति 10 = और 20 माइक्रोन अनुसूचित जनजाति के साथ इलाज 246. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

नाम विवरण रेफरी.
TrpV ट्रिपल वायरस; C11R (प्रारंभिक) वीनस पदोन्नत,
G8R (इंटरमीडिएट) पदोन्नत mCherry, F17R (स्वर्गीय) mTagBFP पदोन्नत 		7
PLV प्रोमोटर कम वीनस
ईवी C11R (प्रारंभिक) वीनस पदोन्नत
चतुर्थ G8R (इंटरमीडिएट) वीनस पदोन्नत
एल.वी. F17R (स्वर्गीय) वीनस पदोन्नत
IREV G8R (इंटरमीडिएट) पदोन्नत mCherry और C11R (प्रारंभिक) वीनस पदोन्नत
LREV F17R (स्वर्गीय) पदोन्नत mCherry और C11R (प्रारंभिक) वीनस पदोन्नत
एलआर F17R (स्वर्गीय) mCherry पदोन्नत
mCherry-A4L देर व्यक्त वायरल कोर प्रोटीन A4L वीनस की fluorophore एन टर्मिनल संलयन

प्रतिदीप्ति संवाददाता वायरस का वर्णन चेचक वायरस रिपोर्टर उपभेदों की तालिका 1. सूची. टेबल.

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Discussion

यहाँ, हम वायरस नकल की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, वास्तविक समय प्रतिक्रिया उपाय प्रदान करता है जो एक बहुमंज़िला चेचक संवाददाता वायरस (TrpV), के व्यावहारिक उपयोग का वर्णन किया है. अच्छी तरह से परिभाषित poxvirus inhibitors का उपयोग करके, हम TrpV प्रत्येक अवरोध करनेवाला के लिए कार्रवाई की समझ में आ तंत्र के साथ सुसंगत तरीके से प्रतिक्रिया करता है कि दिखाने के लिए सक्षम थे. TrpV वायरस वायरस चरण प्रगति के बारे में सबसे व्यापक जानकारी प्रदान करता है, दो चरण (IREV, LREV) और एकल चरण (ईवी, चतुर्थ, एल.वी.) वायरस भी इष्टतम प्रोटीन तह का लाभ ले रही है, इसी का इस्तेमाल किया जा सकता है, स्थिरता, वीनस की fluorophore और बेहतर संकेत करने वाली शोर अनुपात.

इस प्रोटोकॉल में सबूत की अवधारणा परख एक सरल, उच्च throughput थाली परख में जाना जाता poxvirus inhibitors से प्रभावित वायरल जीन अभिव्यक्ति के मंच की पहचान करने की व्यवहार्यता को इंगित करता है. यह परख त्वरित, व्यापक जांच पूरी करने के लिए बढ़ाया जा सकता हैअज्ञात रासायनिक पुस्तकालयों के रूप में अच्छी तरह से. वायरस वायरल जीवन चक्र के किसी भी चरण कि ब्लॉक यौगिकों के विशिष्ट पहचान के लिए अनुमति देता है, कम MOI में छोटे अणु इलाज कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. inhibitors तो (पूर्ण जीन अभिव्यक्ति पर उन पर कोई वायरस फैल) जीन अभिव्यक्ति या विधानसभा मध्यवर्ती, या देर से, करने के लिए जल्दी, प्रवेश (कोई जीन अभिव्यक्ति) से हिचकते वायरस जीवन चक्र के चरण निर्धारित करने के लिए कई Mois पर TrpV का उपयोग कर जांच की जा सकती है. हम सफलतापूर्वक Monkeypox 8 सहित कई poxviruses, के खिलाफ गतिविधि के साथ एक नया विरोधी poxviral अवरोध करनेवाला की पहचान करने के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है.

हम एक प्लेट पाठक प्रारूप में इन वायरस का उपयोग करने के लिए जानकारी प्रदान की है, यह भी उतना ही अच्छा सूक्ष्म परीक्षण के लिए अनुकूल है. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के माध्यम से संक्रमण और प्रेक्षण में उपयोगी हो सकता है, जो वायरल चरण प्रगति की एक सेल से सेल परीक्षा के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2B देखें)इस तरह के एक ऊतक के संक्रमण, या वायरल या बैक्टीरियल संक्रमण सह स्थितियों में के रूप में एक मिश्रित संस्कृति सेल की स्थापना,. इन वायरस एंटीवायरल स्क्रीनिंग 8 के उद्देश्य के लिए बनाया गया है, जबकि इसके साथ ही, हम उन्हें चेचक वायरस के जीवन चक्र की जांच बुनियादी अनुसंधान में बराबर उपयोगिता का होने की उम्मीद है. उदाहरण के लिए, इन वायरस आसानी से कमी या तो परंपरागत तकनीक का उपयोग कर संशोधित या वायरल प्रोटीन overexpress जा सकता है; वायरस के जीन की अभिव्यक्ति और प्रसार के कैनेटीक्स तो वायरल प्रतिलेखन के सभी चरणों के लिए वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकती है.

वायरस मेजबान बातचीत की जांच के रूप में अच्छी तरह से इन रिपोर्टर वायरस के उपयोग से लाभ उठा सकते हैं. इन पत्रकारों ऐसे कुछ प्राथमिक सेल लाइनों, परिधीय रक्त leukocytes, या मुक़्तलिफ़ प्रजातियों 21,22 के रूप में गैर अनुमोदक सेल प्रकार के संक्रमण के दौरान पूरा वायरल प्रतिकृति के मंच की तेजी से पहचान देते हैं. सूचना इस का उपयोग करने से इकट्ठेउपकरण हमारे poxvirus मेजबान रेंज प्रतिबंध कारकों के ज्ञान और वायरल इम्युनो modulatory प्रोटीन का कार्य आगे होगा. वायरस भी एक पूरे जीनोम पैमाने स्क्रीन या एक निर्देशित छोटे पुस्तकालय स्क्रीन में या तो में, संक्रमण के लिए आवश्यक मेजबान कारकों की पछाड़ना से हिचकते वायरस नकल की अवस्था की पहचान करने के लिए उपयोगी हो जाएगा.

एक नई प्रणाली में ये वायरस का उपयोग करने के लिए शुरुआत जब इस प्रोटोकॉल में कई कदम महत्वपूर्ण माना जाना चाहिए. थाली स्वरूप, विकास मीडिया, और सेल प्रकार में अंतर MOI के परिवर्तन, टीका समय, या ऊष्मायन अवधि आवश्यकता हो सकती है. यह उच्च throughput प्रारूप करने के लिए ऊपर स्केलिंग से पहले समापन बिंदु ऊष्मायन समय का अनुकूलन करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है. आदर्श ऊष्मायन समय निर्धारित करने के लिए, एक पायलट गतिज थाली परख (5 कदम देखें) किया जाना चाहिए. एक काइनेटिक परख के दौरान, प्रतिदीप्ति माप 12-24 घंटे के लिए हर घंटे बना रहे हैं और समय इंगित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिस पर जीआरeatest अंतर नियंत्रण और उपचार वायरस अभिव्यक्ति के बीच मनाया जाता है. इस कदम का महत्व IBT, जहां एक स्पष्ट करने के लिए apoptosis नेतृत्व की वृद्धि दर के कारण निषेध, जल्दी अभिव्यक्ति में नहीं सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी है. साथ उपचार में देखा जा सकता है पहले के समय अंक (4-8 HPI) मनाया गया तो संभावना नहीं मनाया अंतर नहीं होगा. इसके अतिरिक्त, एक उपन्यास निरोधात्मक यौगिक परीक्षण कई यौगिक सांद्रता शामिल होना चाहिए. इन प्रतिदीप्ति संवाददाता वायरस के जीन की अभिव्यक्ति में कम से कम परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम हैं, वहीं कई सांद्रता से प्राप्त अतिरिक्त जानकारी उनके समग्र प्रभाव का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

योजना और इन वायरस के निर्माण के दौरान, बहुत देखभाल उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि विशेषताओं 7 है कि fluorophores के चयन में लिया गया था. वीनस प्रोटीन किसी भी अन्य परीक्षण किया स्त्राव की तुलना में काफी बेहतर था की पहचानophore, और इसलिए, ट्रिपल डबल, और एक फ्लोरोसेंट संवाददाता वायरस के विकास में इस्तेमाल किया गया था. इस फ्लोरोफोरे का उपयोग करने के लिए एक सीमा है कि यह पहले से ही संलयन प्रोटीन का एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट संवाददाता युक्त किसी भी सेल लाइन को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है. इन परिस्थितियों में विश्लेषण के समाधान के लिए कई विकल्प वायरस लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (1 टेबल) का उपयोग कर बनाया गया था. F17R देर प्रमोटर या प्राकृतिक A4L देर प्रमोटर से एक mCherry-A4L संलयन प्रोटीन से घुलनशील mCherry या तो व्यक्त करके हम वीनस बिना समान माप पूरा करने में सक्षम हैं. MCherry का उपयोग वीनस प्रोटीन द्वारा प्रदान की गयी लाभ नहीं है हालांकि हम अब हरी व्यक्त सेल लाइनों में माप को समायोजित करने में सक्षम हैं.

संक्षेप में, हम उच्च throughput प्लेट रीडर या उच्च सामग्री इमेजिंग Assa सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के साथ संवाददाता चेचक वायरस का एक सेट विकसित किया हैवाईएस. ये वायरस पारंपरिक तरीकों की तुलना में ज्यादा तेजी से वायरल जीवन चक्र की परीक्षा कर देगा, और बुनियादी विज्ञान के साथ ही लागू एंटीवायरल अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और कोई पेटेंट वायरस या स्क्रीनिंग तरीकों के लिए लंबित हैं.

Acknowledgments

हम सेंट-246 प्रदान करने के लिए SIGA टेक्नोलॉजीज (Corvallis, या) धन्यवाद. DKR बोस्टन विश्वविद्यालय (5T32AI 7309) के लिए प्रतिरक्षा विज्ञान में एक NIH प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. इस काम P41 086180 द्वारा समर्थित किया गया था, एनआईएच RO1AI1096159-01, और RO3 (JHC के लिए).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) Atlanta Biologicals S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut) Gibco 25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates Corning 3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates Corning 3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated Worthington Biochemical Corp. TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) American Bioanalytical AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol SigmaAldrich Co C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol Fisher Scientific NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol SigmaAldrich Co R3501
ST-246, MW= 376 g/mol SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 157-8
TempPlate RT optically clear film USA Scientific 2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985-070

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References

  1. Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
  2. Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
  3. Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
  4. Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
  5. Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
  6. Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
  7. Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
  8. Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
  9. De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
  10. Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
  11. Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
  12. Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
  13. Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
  14. Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
  15. Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
  16. Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
  17. Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
  18. Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
  19. Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
  20. Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
  21. Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
  22. Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).

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इम्यूनोलॉजी अंक 87 चेचक; poxvirus; संक्रमण; वायरस मेजबान बातचीत; स्क्रीन; अवरोध करनेवाला; जीन अभिव्यक्ति; कोशिका जीव विज्ञान; प्रतिदीप्ति; एंटीवायरल; संवाददाता mCherry वीनस TagBFP
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Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression. J. Vis. Exp. (87), e51522, doi:10.3791/51522 (2014).

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