Summary
Мы описываем использование флуоресцентного репортера вируса коровьей оспы, который позволяет в режиме реального времени измерения вирусной инфекционной и экспрессии генов через выражение стадии конкретных спектрально различных репортеров флуорофорами. Мы подробно метод пластина основе для точного определения стадии, на которой репликация вируса поражается в ответ на небольшой торможения молекулы.
Abstract
Поксвирусы представляют собой семейство двухцепочечной ДНК вирусов, которые включают активные человеческих патогенов, таких как обезьян, моллюск contagiousum и вирус Contagalo. Семья также включает в себя вирус оспы, оспы. Из-за сложности поксвирусной репликации, многие вопросы все еще остаются относительно их стратегии экспрессии генов. В этой статье мы расскажем концептуализации и использование рекомбинантных вирусов осповакцины, которые позволяют в режиме реального времени измерения одного и нескольких стадиях вирусной экспрессии генов в формате высокой пропускной. Это возможно за счет использования спектрально различных флуоресцентных белков в качестве репортеров для каждой из трех стадий репликации вируса. Эти вирусы обеспечивают высокую отношение сигнал-шум, сохраняя при этом характер экспрессии этапе, позволяющие плиты на основе анализов и микроскопические наблюдения размножения вируса и репликации. Эти инструменты имеют использует для противовирусной открытия, исследования вируса-хозяина взаимодействия, и эволюционной биология.
Introduction
Традиционно, выражение вирус изучается с помощью молекулярных методов (например, северная блоттинга, вестерн-блоттинга, микрочипов гибридизации, и т.д.) Биология 1. Хотя эти методы способны обеспечить подробную информацию относительно классификации изменений экспрессии отдельных мРНК или белков, они, как правило, не поддаются реального времени и высокой пропускной процессов. Альтернативные подходы с помощью флуоресцентной основе журналистам были применены ранее при работе с поксвирусов; Однако, их развитие и использование, был мотивирован разнообразных целей. Несколько таких методов были разработаны для отбора рекомбинантных вирусов 2,3. Эти методы выразить EGFP при правильном включении и экспрессии экзогенной ДНК из рекомбинантных коровьей клонов. Аналогичным образом, несколько штаммов вируса осповакцины, стабильно экспрессирующие растворимый EGFP или GFP с метками белки, экспрессированные под нативного промотора коровьей оспы были широко использованы. Это типчески используется для количественной запись вируса и репликации во время на основе антител нейтрализации анализов, химическую ингибирование, или сравнение противовирусной эффективности 4-6. В то время как эти вирусы оказались полезными, они ограничены в своей способности обеспечить подробную информацию о точке торможения из-за их использования одного неоднозначного начале / конце вирусного промотора. Предыдущие методы также использовали EGFP белка с субоптимальными сигнал-шум характеристик.
Из-за сложности поксвирусной репликации и отсутствием существующих инструментов, доступных для анализа изменений в режиме реального времени в экспрессии вирусных генов, мы разработали набор одно-и многоступенчатый репортер вирусов 7,8. Как описано в предыдущих публикациях, эти вирусы выразить один, два, или три спектрально различных флуоресцентных белков из родных промоутеров коровьей во время рано, промежуточные или поздно этапы инфекции. Эти вирусы могут быть намред качестве индикаторов прогресса репликации вируса с помощью флуоресцентного микроскопа, и они одинаково хорошо подходит для высокой пропускной пластина-и-ридер на основе анализов. Эти вирусы очень легко использовать вместо вируса дикого типа, растет с аналогичными кинетики достичь эквивалентные титры 7. В ходе планирования и создания этих вирусов, гораздо внимание было уделено в выборе флуорофоры, которые имеют высокий сигнал-фон характеристики с превосходной эффективности складной для облегчения надежную количественную с быстрым обратной связи с изменениями в выражении (Венера, mCherry и TagBFP). Кроме того, комбинации вирусных промоутеров были выбраны, которые производят высокую точность, однозначное выражение этап конкретных, предоставляя информацию о полном диапазоне рано (C11R промоутер), промежуточный (G8R промотор) и поздний (F17R промоутер) экспрессию генов, в отличие от неоднозначной ранний / поздний промоторы.
Эти вирусы могут быть использованы в качестве инструмента для INVEstigating жизненный цикл прототипа поксвирусной, вирус коровьей оспы. Многое до сих пор не известно о хозяине-вируса взаимодействия, несмотря на свою долгую историю изучения. Коровьей оспы является сложной, выпускающее более 200 уникальных белков, многие из которых являются иммуномодулирующее и принимающих антагонистическими. При заражении вирус коровьей оспы немедленно начинает транскрипцию мРНК раннее. Этому способствует РНК-полимеразы и транскрипционных факторов, которые были загружены на вирусного генома в ходе вириона упаковки и не состоявшихся в приостановленном состоянии до последующей инфекции. Это раннее выражение в основном производит белки, необходимые для подавления иммунной системы хозяина (мРНК decapping, секвестрации дцРНК, и приманки рецепторных белков, а также в качестве ингибиторов апоптоза, реакции стресс, и Toll, IL, и сигнализации NF-kB) и геном репликации. Рано выражение также производит транскрипционные факторы, необходимые для промежуточного выражения. Промежуточный выражение включает экспрессию конце факторов этап транскрипции. Этовыражение каскад приводит к производству структурных и ферментативных белков вируса на поздних стадиях инфекции, которые необходимы для полной сборки зрелого коровьей оспы вириона.
Наш набор флуоресцентных репортер вирусов позволяет быстро добиться прогресса в понимании поксвирусной биологии. Один из наиболее распространенных и трудоемких методов в области вирусологии является анализ роста. Это обычно включает инфицировать клетки, принятие ряд процедур, вирус уборочной лизированием инфицированные клетки, и количественной полученный титр вируса на бляшек. Использование репортерных вирусы, описанные здесь позволяет в режиме реального времени измерение роста вируса, который может быть легко проанализированы и сравнены между многочисленных процедур, выполняемых параллельно. Мы предполагаем этот набор реагентов будет использоваться в различных протоколов для определения изменений в экспрессии вирусного гена в ответ на обработку препарата, RNAi кnockdown или диапазон хозяин ограничение.
Этот метод также позволяет проводить анализ высокого содержания в большем масштабе, чем ранее доступные, что позволяет с высокой пропускной противовирусных лекарств для экранов конкретно определенных целевых стадий интерес. В то время как многочисленные потенциальные обработки по борьбе поксвирусной инфекции были выявлены, только FDA одобрило терапии эффективные для лечения поксвирусной инфекции являются ациклические фосфонатный нуклеозид, Цидофовир, и лечение с иммуноглобулин коровьей оспы 9,10. Несмотря на ликвидации оспы в 1977 году 11, поксвирусы остаются серьезной угрозой для здоровья человека 12. Прекращение широкого вакцинации против вируса натуральной оспы привело к повышенной восприимчивости к другим поксвирусов 13. Например, регионы Центральной Африке ранее защищенные вакцинации переживают всплеск вирусных инфекций Обезьянья 14. Значительное беспокойство также был, заданный в отношении скрытой предрасположенности к преднамеренного высвобождения вируса натуральной оспы. В связи с ограниченностью методов лечения в настоящее время, существует настоятельная потребность в разработке новых методов лечения. Эти вирусы репортер позволяют быстро и высокопроизводительного скрининга малую молекулу ингибитора для ингибирования определенной стадии вирусной репликации. Идентификация ингибиторов, предназначенных вирусные этапы экспрессии в настоящее время не является целью торможения будет способствовать развитию комбинированной терапии с повышенной эффективностью.
Многое можно почерпнуть о биологии коровьей оспы клеток, наблюдая изменения в экспрессии генов для каждого этапа,. Ослабление в химической или генетической манипуляции с инфицированной клетки-хозяина, как правило, выражается в виде сокращения вирусных титров. Тем не менее, путем сравнения изменения в каждой стадии вирусной экспрессии каскада, можно получить более полное понимание того, как вирус подготовка является воздействиеред конкретным лечения. Эти данные, как было показано, хорошо коррелирует с традиционным выхода титра вируса, но предоставить более подробную информацию механистическую, а также высокой пропускной способности 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Пластина клеток
- Диссоциируют HeLa клетки от пластины и разбавленной в питательной среде (DMEM, 2 мМ L-избытком, 10% FBS) в приблизительно 2,0 × 10 5 клеток / мл. Внесите 100 мкл / лунку в черном стенками, ясный плоским дном 96-луночный планшет (20000 клеток / лунку).
- Инкубируйте клетки в течение 24 часов, пока сливной в инкубаторе 37 ° C ± 5% СО 2.
2. Инфицировать клетки
- Развести вирус и заразить клетки.
- Оттепель TRPV (Трехместный вирус; Рано Венера, средний mCherry, поздний TagBFP) и PLV (Промоутер-менее Венера) люминесцентные вирус и разбивке помощью ультразвука в течение 5 минут. Альтернативно, сырой запасов вируса могут быть смешаны с 1:01 0,25 мг / мл трипсина в средах инфекции и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин.
- Развести сырой запасами вируса в 37 ° C инфекции СМИ (DMEM, 2 мм L-перенасыщения, 2% FBS). Для высоких инфекций МВД (10 КОЕ / клетку), разбавить вирус запас до 1,0 х 10 7 PFU / мл предполагая 5 х 10 4клеток / лунку и объем инокулят 50 мкл. План на заражение 3 дублирующие лунки для каждой обработки с TRPV и еще 3 повторных скважин для такой же обработке с PLV для учета фоновой флуоресценции, характерные для каждой обработки.
- Infect скважин путем добавления 50 мкл / лунку вирус с разведением в средах инфекции. Это определяется как время = 0 ч после заражения (0 HPI).
- Развести желаемых соединений лечения в инфекционных СМИ. Для всех процедур одного 2x мастер разбавления смесь должны быть сделаны и применяются для репликации скважин (например, 350 мкл Общий объем в течение шести 96 скважин с 50 мкл каждого).
- Развести экспериментальные соединения в инфекции СМИ.
- Развести транспортного средства управления растворителе (например, PBS, ДМСО) в инфекции массовой информации. Примечание: Подобные конечные концентрации транспортного средства контроля растворителей следует использовать применительно для экспериментальных соединений (например, если ваш IBT складе производится с ДМСО и использовали в конечной concentratioнс 1 мкл / мл, а затем использовать только ДМСО в 1 мкл / мл, как управления транспортным средством).
- Развести управления соединений в инфекции СМИ. Рекомендуемые соединения управления включают в себя: 3,6 мкм (1 мкг / мл) 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (AraC), 50 мкм (11,7 мкг / мл) изатин β-тиосемикарбазон (IBT), 60 мкМ (50 мкг / мл) рифампицин, или 5 мкм (1,9 мкг / мл) ST-246 8,15,16. Смотреть Представитель результаты ожидаемых эффектов. Примечание: сделать этот раствор при дважды (2x) желаемой конечной концентрации с ней добавляют в соотношении 1:1 по объему уже в скважине.
- Сразу после добавления вируса, добавить 50 мкл инфекции средах, содержащих желаемые процедуры и управления как разбавленный на шаге 2.2. Примечание: Для анализа на ингибирование экспрессии перед ранней стадии, соединение (ы) может быть добавлен непосредственно в разбавленном вируса инокулята (шаг 2.1.2) или к клеткам-хозяевам до заражения (перед стадией 2.1.3).
- Выдержите 6-24 ч в 37 & #176, С-инкубатор + 5% СО 2.
3. Fix клетки
- Fix клетки добавлением 100 мкл 8% параформальдегида в инфекции СМИ уже в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин в защищенном от света. Примечание: Рекомендуется добавить 2x PFA (8%) непосредственно к инфекции СМИ для предотвращения аэрозолизации инфекционного вируса коровьей оспы, которые могут возникнуть, если высокого титра СМИ инвертируется непосредственно в сточных блюдо до фиксации.
- Удалить фиксатор путем обращения пластину в блюдо отходов.
- Добавить 100 мкл комнатной температуре PBS.
- Уплотнение тарелку с оптически прозрачной клейкой пленкой. Примечание: Плиты можно хранить при температуре 4 ° С, если не прочитать немедленно. Будьте уверены, чтобы вернуться запечатанные листы до комнатной температуры, прежде чем читать, чтобы предотвратить конденсацию от искажения измерений спектрофотометра.
4. Количественная роста вируса
- Измерьте конечной точки флуоресценцию 515:530 для Венеры, 587:610 для mCherry и 415:457 еили TagBFP (Возбуждение: Длина волны излучения в нм). Четыре измерения должны быть в среднем на лунку, используя оптимизированные настройки усиления для каждого канала. Примечание: Соответствующий длина волны излучения может отличаться в зависимости от конкретной модели и фильтров характеристик вашего ридере. Это может быть определено опытным путем, выполняя сканирование длины волны излучения для определения точки, где есть наибольшая разница между TRPV и PLV для каждого канала.
- Нормализация необработанные данные, чтобы облегчить сравнение между экспериментами.
- Для каждого канала, определить среднее реплик TRPV и PLV скважин.
- Вычтите средние PLV-инфицированных фоновых измерений от средних TRPV-инфицированных экспериментальных измерений для каждой обработки.
- Нормализовать данные путем деления каждого фонового вычитается значение на значение для транспортного средства только хорошо.
- После того, как эксперимент был повторен несколько раз, односторонний дисперсионный анализ тест (односторонний ANOVA) и несколько грomparison пост-тест может быть выполнен, чтобы определить, если любой из методов лечения отражает статистически значимое отличие от лечения для транспортного средства только для каждого канала.
. 5 Альтернативный протокол: кинетические Plate Анализы
- Выполните все шаги через добавлением лечения (шаг 2.3).
- Печать пластина с клейкой пленкой и поставить в планшет-ридер камеры доведены до 37 ° С Примечание: Особое внимание должно быть принято, чтобы сохранить пластины последовательно при 37 ° С, чтобы предотвратить чрезмерную нагрузку клеток и образование конденсата. Для Кинетические анализы, это особенно важно использовать буферной среде (бикарбонат натрия и HEPES) для поддержания надлежащего рН без добавления 5% CO 2.
- Набор планшет-ридере получить вручную, чтобы предотвратить насыщение поздних временных точках. Примечание: Точная оптимизация усиления может быть получена путем выполнения анализов конечных точек в аналогичных условиях.
- Приобретать почасовые показания для 8-24 HPI и нормализовать с помощью аналогичПроцедура LAR как в конечной точке анализа (шаг 4.2).
- Точки индивидуального времени могут быть проанализированы на статистическую значимость с использованием аналогичных методов, как описано ранее конечной точки анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве примера в типичном использовании этих вирусов, вирус тройной флуоресценции-репортер был использован для сравнения точку торможения нескольких четко определенных ингибиторов поксвирусных.
HeLa клетки высевают в культуре ткани обрабатывали черные стенами четкие плоским дном 96-луночных и инкубировали в течение ночи. Конфлюэнтные монослоя были заражены при множественности инфекции (MOI) 10, используя либо тройной репортер вирус (TRPV; Таблица 1) или промотор-менее Венера (PLV), как описано на тарелке карте (рис. 1). Заражение сред, содержащих процедуры был добавлен, чтобы получить конечную концентрацию 0,1% ДМСО, 3,6 мкМ (1 мкг / мл) AraC, 50 мкм (11,7 мкг / мл) IBT, 5 мкм (1,9 мкг / мл) ST-246 или 60 мкМ (50 мкг / мл) Рифампицин в трех экземплярах. 0,1% ДМСО использовали в качестве контроля транспортного средства, так как все ингибитора запасы были использованы в 1 мкл / мл в ДМСО. Планшет вернулся к 37 ° C incubatoг до 18 HPI. Клетки фиксировали в течение 15 минут добавлением 100 мкл 8% PFA во все лунки и хранится в PBS в защищенном от света, пока не считывали на планшет-ридере. Показания флуоресценции проводили с использованием планшет-ридера Tecan Infinite M1000 и я-программное управление (v1.5.14.0) донными чтения 4 пункта на лунку в возбуждении: длин волн излучений 515:530, 587:610, 415:457 нм для Венеры , mCherry и TagBFP флуорофоры, соответственно. До окончательных измерений, прирост был оптимизирован, чтобы позволить максимальный сигнал без насыщения датчиков (прирост был, как правило, 235, 255, 235 для зеленого, красного и синего измерений, соответственно).
Рисунок 1. Представитель расположение инфекций и лекарственной терапии на 96-луночный планшет. Диаграмма 96-а пластина инфекции и небольшой схемы сложения молекула, используемого для кресть репрезентативные результаты. Трехместный люминесцентные вирус (TRPV; светлый серый), выражающая раннее Венера, промежуточный mCherry, и поздно TagBFP или промоутер-менее Венеру (PLV; темнее серый) используются в колонках тройные. 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (AraC), изатин β-тиосемикарбазон (IBT), рифампицин, ST-246 и ДМСО управления транспортным средством с испытанной концентрации указаны на рисунке справа. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Относительные единицы флуоресценции (RFU) на каждой повторности были нормализованы для каждого канала. Во-первых, интенсивность флуоресценции средство для PLV лунок вычитали из средней интенсивности TRPV скважин для каждой обработки, чтобы учесть интенсивность фона, вносимого каждого препарата. Далее, это значение делили на фоне вычитается среднее значение интенсивности ДМСО обработанных TRPV скважин (рост дикого типа). Полученные результаты после лечения с известным роингибиторы xvirus согласуется с ранее опубликованными выводами и их понимал механизма действия. Прекращение транскрипции гена раннего и перехода к экспрессии гена промежуточного было показано, требуют репликации ДНК 17. В соответствии с этим, AraC, ингибитор репликации ДНК, показали резкое увеличение экспрессии раннего гена (210% ДМСО лечить на ранних стадиях выражения; рис. 2) и полное отсутствие промежуточного и поздний выражение (0,4% и 0,3% ДМСО обработанных промежуточный и поздний выражение соответственно; рис. 2). Хотя точный механизм действия не определен для IBT, считается, содействовать чтения через транскрипцию, что приводит к увеличению количества дсРНК, активации РНКазы L пути и апоптоза 18-20. В ответ на лечение IBT постепенно тяжелый фенотип наблюдался в котором промежуточный и поздний выражение были значительно меньше, чем только ДМСО (24,7%и 2,9% ДМСО лечение для среднего и позднего выражения, соответственно; Рисунок 2). Последовательно, но не является статистически значимым рано флуоресценции снижение наблюдалось также; Однако этого, скорее всего из-за IBT-индуцированного апоптоза в этом позднем этапе (74,0% ДМСО при 18 HPI). В отличие от AraC и IBT, поксвирус препараты ST-246 и рифампицин оба ингибируют после конца экспрессии генов во время вириона сборки и созревания 15,16. Никаких изменений в экспрессии генов не наблюдалось на всех этапах, когда клетки обрабатывали либо ST-246 (100,9%, 98,5% и 94,5% ДМСО лечение на ранней стадии, промежуточной и поздней экспрессии соответственно; фиг.2) или рифампицин (107,6%, 104,2%, 106,5% и ДМСО лечение на ранней стадии, промежуточный и поздний выражение, соответственно).
Исторически сложилось так, сочетание низкой MOI (0,01-0,1 PFU / клетка) и высокой MOI (5-10 PFU / клетка) Анализы роста используются при исследовании ингибирующее действие новой малой молекулы или вирусной мутанта. При низкой МВД, габаритные ингибирующие эффекты часто преувеличены даже незначительного торможения, так как только подмножество клеток изначально инфицированы. При попытке определить точку во время инфекции цикла, при котором вирус подавляется, высокая МВД инфекции, скорее всего, более подходящим, так как все клетки заражаются вашей первичной инфекции. Эксперимент показано на фиг.3 проводили, как на рисунке 2, с добавлением множества скважин, которые были инфицированы при более низкой MOI = 1. В качестве ингибитора, который функционирует посттранскрипционно, ST-246 не должен влиять на любую стадию экспрессии генов ; однако, ясно, что, когда только подмножество ячеек infecteд (рис. 3, МВД = 1) есть очевидно ингибирование всех этапах выражения (38,4%, 48,9%, и 52,9% ДМСО по сравнению с 100,9%, 98,5% и 94,5% для МВД = 1 vs МВД = 10 Уровень инфекции раннего, среднего и позднего выражения, соответственно; рис. 3). Предполагая, 100%-ное ингибирование зрелого вириона формирования по ST-246, это означает, 100% клеток были инфицированы MOI = 10 инфекций, а где-то между 50 и 70% клеток были инфицированы продуктивно при MOI = 1 инфекции.
Рисунок 3. Влияние уровня инфекции на кажущуюся торможения ST-246. HeLa клетки, инфицированные как показано на рисунке 2 как с высокой (МВД = 10) и низкой (МВД = 1) TRPV обрабатывают ST-246. Относительные единицы флуоресценции (РФС; фон вычитается каждый о основанную каналан рост PLV для каждого лечения и нормализуется к TRPV + ДМСО) для раннего (зеленый), промежуточный (красный), и в конце (синий) вирусная выражение в клетках, инфицированных на любом МВД = 1 или МВД = 10 и обрабатывают 20 мкМ ST- 246. Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
| Название | Описание | Ссылка |
| TRPV | Трехместный вирус; C11R (Раннее) способствовали Венеру, G8R (средний) способствовало mCherry, F17R (поздний) способствовали mTagBFP | 7 |
| PLV | Промоутер-менее Венера | |
| Е.В. | C11R (Раннее) способствовали Венеру | |
| IV | G8R (средний) способствовало Венера | |
| LV | F17R (поздний) способствовали Венеру | |
| Irev | G8R (средний) способствовало mCherry и C11R (Раннее) способствовали Венеру | |
| LREV | F17R (поздний) способствовали mCherry и C11R (Раннее) способствовали Венеру | |
| LR | F17R (поздний) способствовали mCherry | |
| mCherry-A4L | N-терминал слияние флуорофором VENUS в конце выразил вирусного белка ядра A4L |
Таблица 1. Список штаммов репортер вируса вакцины. Таблица описания флуоресценции репортера вирусы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали практического использования многоступенчатой вакцины репортера вируса в (TRPV), что обеспечивает воспроизводимые в режиме реального времени меры обратной репликации вируса. С помощью четко определенных ингибиторов поксвирус, мы смогли показать, что TRPV отвечает в соответствии с понятном механизме действия для каждого ингибитора. В то время как вирус TRPV предоставляет наиболее полную информацию о вирусной сцене прогрессии, двухступенчатый (Irev, LREV) и одноступенчатой (Е.В., IV, LV) вирусы могут также использоваться аналогичным образом, используя в своих интересах оптимального складывания белка, стабильность, и превосходит отношение сигнал-шум флуорофора Венера.
Доказательство правильности концепции анализа в данном протоколе указывает целесообразность выявления стадии вирусной экспрессии генов осуществляется путем известных ингибиторов поксвирусных в простой, высокой пропускной планшете. Этот анализ может быть продлен для завершения быстрый, всеобъемлющий скринингнеизвестных химических библиотек, а также. Вирусы могут быть использованы для инфицирования низкомолекулярные обработанные клетки при низкой MOI, что позволяет для конкретной идентификации соединений, которые блокируют любую стадию жизненного цикла вируса. Ингибиторы затем могут быть подвергнуты скринингу с использованием TRPV на нескольких MÕIS для определения стадии вирусной жизненного цикла тормозится, въезд (без экспрессии генов), в начале, промежуточный или поздно экспрессии генов или сборка (полный экспрессии генов, но не распространение вируса). Мы использовали эту технику, чтобы успешно идентифицировать новый анти-поксвирусный ингибитор с активностью в отношении нескольких поксвирусов, включая обезьян 8.
В то время как мы предоставили сведения по использованию этих вирусов в формате пластина-читателя, он одинаково хорошо подходит для микроскопического исследования. Инфекция и наблюдение с помощью флуоресцентного микроскопа (см. рис 2B) позволяет для ячейка за ячейкой экспертизы вирусной прогрессии стадии, которые могут быть полезны вУстановка культура смешанного клеток, таких как инфекции ткани, или в вирусных или бактериальных условиях сочетанной инфекции. Кроме того, в то время как эти вирусы были созданы с целью противовирусного скрининга 8, мы ожидаем, что они быть одинаковой полезности в области фундаментальных исследований, расследующей жизненный цикл вируса коровьей оспы. Например, эти вирусы могут быть легко изменены с помощью традиционных методов либо отсутствия или сверхэкспрессировать вирусные белки; кинетика экспрессии гена вируса и распространением то можно контролировать в реальном времени на всех стадиях вирусной транскрипции.
Исследования вируса-хозяина взаимодействия могут извлечь выгоду из использования этих репортеров вирусов, а также. Эти журналисты позволяют быстро идентифицировать стадии репликации вируса завершена при заражении неразрешающие типов клеток, таких как некоторые первичные клеточные линии, лейкоцитов периферической крови, или расходящихся видов 21,22. Информация, собранная от использования этогоинструмент будет способствовать наши знания о факторах, ограничивающих поксвирус круг хозяев и функцию вирусных белков иммуномодулирующей. Вирусы также будет полезно определить стадию репликации вируса ингибируется нокдаун факторов хозяина, необходимых для инфекции, в любом экране целого генома масштаба или в ориентированном маленьком экране библиотеки.
Несколько шагов в этом протоколе должны быть рассмотрены критической, когда начинают использовать эти вирусы в новой системе. Различия в формате пластины, питательных сред и типа клеток может потребоваться изменение МВД, время прививки, или продолжительность инкубации. Это становится особенно важным для оптимизации конечной точки времени инкубации до масштабирования до формата высокой пропускной. Чтобы определить идеальный время инкубации, пилот кинетическая пластина анализа должны быть выполнены (см. п. 5). Во время кинетического испытани измерения флуоресценции выполнены каждый час в течение 12-24 часов и может быть использован, чтобы точно определить время, в которое грешь разница наблюдается между контролем и выражения вируса лечение. Важность этой стадии можно увидеть в лечении с IBT, где ингибирование за счет увеличения скоростей апоптоза приводит к очевидным, хотя и не статистически значимое снижение в начале выражения. Если наблюдались ранее моменты времени (4-8 HPI) нет, вероятно, будет не наблюдаемая разница. Кроме того, тестирование новый тормозящее соединения должны включать в себя несколько концентрации соединения. Хотя эти флуоресценции репортер вирусы способны обнаруживать минимальные изменения в экспрессии генов, дополнительная информация, полученная нескольких концентрациях может привести к лучшему пониманию их общий эффект.
В ходе планирования и создания этих вирусов, гораздо внимание было уделено в выборе флуорофоры, которые имеют высокие характеристики сигнал-фон 7. Белок Венера была определена как значительно лучше, чем любой другой испытанной фтораophore, и, следовательно, был использован на протяжении всего развития тройных, двойных и одиночных люминесцентных репортер вирусов. Одним из ограничений в использовании этого флуорофор, что она не может быть использована для заражения любой клеточной линии уже содержащий зеленый флуоресцентный корреспонденту слитого белка. Для решения анализа в этих условиях несколько альтернативных вирусы были созданы с использованием красного флуоресцентного белка (табл. 1). Выражая либо растворимый mCherry от F17R поздний промотор или mCherry-A4L гибридного белка из природного A4L поздний промотор мы в состоянии выполнить подобные измерения без Венеры. Хотя использование mCherry не имеют дополнительное преимущество, предоставленную белка Венеры мы сейчас в состоянии вместить измерение в клеточных линиях зелеными-выражения.
Таким образом, мы разработали набор репортер коровьей вирусов с различными приложениями, в том числе высокой пропускной ридере или высокое содержание Асса изображенийYS. Эти вирусы сделает экспертизу жизненного цикла вируса гораздо быстрее, чем традиционные методы, и может быть использован для базовой науки, а также применяется противовирусной исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать и никакие патенты не находятся на рассмотрении на наличие вирусов или методов скрининга.
Acknowledgments
Мы благодарим SIgA технологий (Corvallis, OR) для обеспечения ST-246. ДКР была поддержана учебного гранта NIH в иммунологии в Бостонском университете (5T32AI 7309). Эта работа была частично поддержана P41 086180, NIH RO1AI1096159-01, и RO3 (в JHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S.
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
