Summary
Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.
Abstract
Poxvirüsler aktif insan gibi Monkeypox gibi patojenleri, molluscum contagiousum ve Contagalo virüsü, çift sarmallı DNA virüsleri bir aileyiz. Aile de çiçek virüsü, Variola içerir. Nedeniyle poksvirüs çoğaltma karmaşıklığı, pek çok soru hala gen ekspresyon stratejisine ilişkin kalır. Bu yazıda, bir yüksek verimli bir biçimde viral gen ekspresyonu, tek ve çok sayıda etap gerçek zaman ölçümünü sağlayacak rekombinant vaccinia virüsleri kavramsallaştırılmasını ve kullanımını tarif eder. Bu, viral replikasyon üç aşamada her biri için ayrı bir muhabir olarak, spektral floresan proteinlerinin kullanımı ile etkinleştirilir. Aşama özel ekspresyonu, etkinleştirme plaka bazlı tahliller ve virüs yayılması ve replikasyon mikroskobik gözlemler korurken Bu virüsler yüksek sinyal-gürültü oranını sağlar. Bu araçlar antiviral keşif, virüs-konak etkileşim çalışmaları, ve evrimsel biyo için kullanan varlogy.
Introduction
Geleneksel olarak, virüs ifade moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, Kuzey leke, western blot, mikrodizi hibridizasyon, vb) 1 kullanılarak incelenmiştir. Bu yöntemler bireysel mRNA veya protein ifadesini değiştirir kategorize ile ilgili detaylı bilgi sağlama yeteneğine sahip olsa da, bunlar genellikle gerçek zamanlı ve yüksek verimli işlemlere uygun değildir. Poksvirüslerden çalışırken floresan tabanlı gazetecilere kullanarak alternatif yaklaşımlar önceden uygulanmış; Ancak, onların gelişimi ve kullanımı çeşitli amaçlarla tarafından motive edilmiştir. Bu gibi birkaç yöntem rekombinant virüslerin 2,3 seçimi için tasarlanmıştır. Bu teknikler dahil edilmesi ve uygun rekombinant vaccinia klonlardan eksojen DNA'nın sentezlenmesi üzerine EGFP ifade eder. Benzer şekilde, birçok aşı suşları stabil bir şekilde çözünür EGFP ifade eden ya da yerel bir ineklerdeki çiçek hastalığı promotörün kontrolü altında eksprese GFP-etiketli proteinler, yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tip vardırically virüs giriş ve replikasyon antikor bazlı nötralizasyon deneyleri sırasında, kimyasal önleme veya antiviral etkinliği 4-6 karşılaştırma ölçmek için kullanılır. Bu virüsler yararlı olduğu kanıtlanmış olsa da, onlar yüzünden bir tek muğlak erken / geç viral desteğin onların kullanımına engellenmesi noktası hakkında detaylı bilgi vermek için kendi yeteneği sınırlıdır. Önceki yöntemler de optimal sinyal-gürültü özellikleri ile EGFP protein kullanımı yaptık.
Nedeniyle poksvirüs çoğaltma ve viral gen ifadesinde gerçek zamanlı değişiklikleri tahlil için kullanılabilir mevcut araçların eksikliği karmaşıklığı, biz tek ve çok kademeli muhabiri virüsler 7,8 paketi geliştirdik. Daha önceki yayınlarda tarif edildiği gibi, bu virüsler, erken enfeksiyon içinde bir ara madde ya da geç aşamaları sırasında bir, iki, veya yerel vaccinia promoterler üç ayrı spektral floresan proteinleri ifade eder. Bu virüsler bizi olabilirflöresanlı bir mikroskop kullanılarak virüs replikasyonu ilerleme göstergesi olarak ed ve yüksek verimli ve plaka-okuyucu bazlı tahliller için de aynı derecede uygundur. Bu virüsler eşdeğer titreleri 7 ulaşmak için benzer kinetik ile büyüyen, yabani tip virüs yerine kullanmak kolaydır. Planlama ve bu virüslerin yaratılması sırasında, çok bakım ifadesi (Venüs, mCherry ve TagBFP) değişikliklere hızlı bir geri besleme ile güvenilir ölçümü kolaylaştırmak için üstün katlama verimlilik ile yüksek sinyal-zemin özelliklerine sahip florosforlar seçiminde alındı. Ek olarak, viral promoterlerin kombinasyonları belirsiz aksine, yüksek bağlılık, açık safha spesifik ifadesi, (C11R promoter) erken dizi hakkında bilgi veren, ara madde (G8R promotör) ve geç (F17R promoter) gen ekspresyonunu üreten seçilmiştir erken / geç promoterleri.
Bu virüsler inve için bir araç olarak da kullanılabilirPrototipik çiçek virüsü, vaccinia virüs yaşam döngüsünü stigating. Çok çalışmanın uzun tarihine rağmen hala konak-virüs etkileşimi hakkında bilinen değildir. Vaksiniya immunomodulator ve uzlaşmaz ev sahipliği birçoğu 200 üzerinde benzersiz proteinlerini üreten, karmaşık. Enfeksiyon üzerine, ineklerdeki çiçek hastalığı virüsü erken hemen mRNA transkripsiyonunu başlar. Bu virion paketleme sırasında viral genom üzerinde yüklenir ve daha sonraki enfeksiyonlar kadar durdurulmuş halde yapıldı bir RNA polimeraz ve transkripsiyon faktörleri tarafından kolaylaştırılır. Bu erken ifade esas konakçı bağışıklık sistemi (mRNA Dekapaj, dsRNA sekestrasyon ve yem reseptör proteinleri hem de apoptoz inhibitörleri, stres tepkisi ve Toll, IL, ve NF-KB sinyal) ve genom replikasyon bastırılması için gerekli proteinler üretir. Erken ifade aynı zamanda ara ekspresyon için gerekli transkripsiyon faktörlerini üretir. Ara madde ifade geç aşama transkripsiyon faktörlerinin ortaya çıkarılmasını içerir. Buifade kademeli olgun vaccinia virionun tam montaj için gerekli olan enfeksiyonun geç aşamalarında sırasında yapısal ve enzimatik virüs proteinlerinin üretimine yol açar.
Floresan haberci virüslerinin Bizim grubu poksvirüs biyoloji anlaşılmasında yapılacak hızlı bir ilerleme sağlar. Viroloji alanında en yaygın ve zaman alıcı bir yöntemlerden biri büyüme deneyidir. Bu, tipik olarak, hücrelerin enfekte enfekte hücreleri lize ile tedaviler, hasat virüs bir dizi yürürlüğe koymak ve plak tahlili ile elde edilen viral titresi miktarının içerir. Burada açıklanan raportör virüs kullanılarak kolayca deneye tabi tutulur ve paralel olarak gerçekleştirilen işlemler arasında çok sayıda mukayese edilebilir virüs büyüme gerçek zaman ölçümünü sağlar. Bu reaktifler, bu dizi ilaç tedavisi, RNAi k tepki olarak viral gen ekspresyonunda değişiklikler belirlenmesi için çeşitli protokoller kullanılacak öngörmeknockdown, veya konak aralığı kısıtlama.
Bu yöntem de ilginç spesifik olarak tanımlanmış hedef aşamaları için yüksek verimli bir anti-viral ilaç ekranlar için izin veren, önceden mevcut olandan daha büyük bir ölçekte, yüksek içerik analizini sağlar. Çiçek virüsü enfeksiyon ile mücadele etmek için çok sayıda olası tedaviler tespit edilmiş olsa da, sadece FDA çiçek virüsü enfeksiyonunun tedavi edilmesi için etkili tedaviler Asiklik nükleosit fosfonat, Cidofovir, ve vaccinia immün globulin 9,10 ile tedavi edilir onayladı. 1977 11 çiçek eradikasyonu rağmen, poxvirüsler insan sağlığı 12 için önemli bir tehdit olmaya devam etmektedir. Variola virüsüne karşı yaygın aşılama bırakma diğer çiçek virüsleri 13 için artmış duyarlılık yol açmıştır. Örneğin, daha önce aşılama tarafından korunan Orta Afrika bölgelerinde Monkeypox virüs enfeksiyonlarına 14 bir artış yaşanıyor. Önemli endişe de olmuşturVariola virüsün kasıtlı serbest bırakılması için gizli duyarlılık konusunda kaldırdı. Nedeniyle, şu anda mevcut olan sınırlı tedavilere, yeni tedavilerin geliştirilmesi yönünde acil bir ihtiyaç vardır. Bu raportör virüsler, viral replikasyonun spesifik bir aşamasının önlenmesi için hızlı ve yüksek verimli, küçük molekül inhibitörü, tarama izin verir. Inhibisyon anda değil hedef viral sentezleme evreleri hedefleyen önleyicilerinin tespiti yüksek etki ile kombinasyon tedavilerinin geliştirilmesini kolaylaştırır.
Kadar her aşamanın gen ifadesi değişikliklerini gözlemleyerek aşı hücre biyolojisi hakkında toplanan olabilir. Kimyasal ya da enfekte olmuş konakçı hücrenin genetik manipülasyonu ile zayıflatılması tipik haliyle düşük viral titreleri cinsinden ifade edilir. Ancak, viral sentezleme kaskadının her safhasında değişiklik karşılaştırarak, bir virüs uygunluk etkisinin ne kadar daha kapsamlı bir anlayış elde edebilirsinizBelirli bir tedavi ile ed. Bu veriler geleneksel virüs titresi çıkışı ile iyi bir korelasyon, ancak daha detaylı bilgi mekanistik hem de yüksek miktarda 7 yetenekleri temin ettiği gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Plaka Hücreler
- Plakasından HeLa hücreleri ayırmak ve yaklaşık olarak 2.0 x 10 5 hücre / ml büyüme ortamı (DMEM, 2 mM L-fazlalığı,% 10 FBS) içerisinde seyreltin. , Siyah duvarlı, şeffaf, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın (20,000 hücre / oyuk) içinde 100 ul / oyuk dağıtın.
- +% 5 CO2 37 ° C kuluçka makinesi içinde birleşene kadar 24 saat boyunca inkübe hücreleri.
2.. Hücreleri enfekte
- Virüs sulandırmak ve hücreleri enfekte.
- Çözülme TRPV (Triple virüsü; Erken Venüs, Orta MCherry, Geç TagBFP) ve PLV (Promotörle az Venüs) floresan virüs ve 5 dakika boyunca Sonikasyon kullanarak ayrıştırılacaktır. Seçenek olarak ise, ham virüs stokları enfeksiyonu ortam içinde 0.25 mg / ml tripsin ile 1:1 karıştırıldı ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilebilir.
- 37 ° C enfeksiyon ortamı (DMEM, 2 mM L-fazlalığı,% 2 FBS) içinde, ham virüs stokları seyreltin. Yüksek İçişleri Bakanlığı enfeksiyonları (10 PFU / hücre) için, PFU / ml 5 x 10 4 varsayarak 1,0 x 10 7 virüs stok sulandırmakiyi hücre / 50 ul bir inokulum hacmi. TRPV her tedavi ve her bir tedaviye özel eşiğe hesaba PLV ile aynı tedavi için bir başka 3 suret kuyu boyunca 3 suret kuyu enfekte planı.
- Enfeksiyon ortam içinde 50 ul / göz miktarında seyreltilmiş virüs eklenerek kuyu Infect. Bu sefer = 0 saat sonrası enfeksiyon (0 HPI) olarak tanımlanır.
- Enfeksiyon ortamı içine arzu edilen tedavi bileşikleri seyreltin. Tüm tedaviler için tek bir ana karışım 2x seyreltme yapılmış ve kuyu (50 ul, her altı 96-kuyu için, örneğin 350 ul toplam hacim) çoğaltmak için uygulanmalıdır.
- Enfeksiyon ortama deney bileşikleri seyreltin.
- Enfeksiyon ortama araç kontrol çözücü (örneğin, PBS, DMSO) seyreltin. Not: Deney bileşikleri (örneğin başvurusunda olarak IBT stok DMSO ile yapılır ve nihai concentratio kullanılır ise araç kontrol çözücülerin benzer nihai konsantrasyonlar kullanılmalıdır1 ul ns / ml, daha sonra araç kontrolü olarak 1 ul / ml), tek başına DMSO kullanın.
- Enfeksiyon ortama kontrol bileşikleri sulandırmak. Tavsiye edilen kontrol bileşikler şunlardır: 3.6 uM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosilsitosinin (AraC), 50 uM (11.7 ug / ml) isatin β-tiyosemikarbazon (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampisin, ya da 5 uM (1.9 ug / ml) ST-246 8,15,16. Beklenen etkileri Temsilcisi Sonuçları gör. Not: Bu da zaten birime bir 01:01 oranında ilave edilir Başlangıcı iki kez (2x) ile istenen son konsantrasyona bu seyreltme olun.
- Hemen virüs ilave edildikten sonra, aşama 2.2 'de inceltilmiş olarak arzu edilen tedavi ve kontroller içeren 50 ul enfeksiyon ortamı eklenir. Not: Erken evre ifade önce engellenmesi için tahlil edilmesi için, bileşik (ler) ya da seyreltilmiş virüs aşı (aşama 2.1.2) doğrudan ilave edilebilir veya (aşama 2.1.3 önce), enfeksiyondan önce konakçı hücreler için.
- 37 ve # 6-24 saat inkübe176; C inkübatör +% 5 CO 2.
3.. Hücreleri Fix
- De daha önce her bir enfeksiyon ortam için 100 ul% 8 paraformaldehit ekleyerek, hücreler. Işıksız bir ortamda 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Not: Bu yüksek titre medya öncesinde tespit atık çanak doğrudan ters çevrilir ise oluşabilir bulaşıcı ineklerdeki aerosolizasyonu önlemek için doğrudan enfeksiyon medyaya 2x PFA (% 8) eklemek için önerilir.
- Atık çanak içine plakayı baş aşağı çevirerek Fiksatif çıkarın.
- Oda sıcaklığı PBS 100 ul ekleyin.
- Optik olarak berrak yapışkan film ile plaka mühür. Not: hemen okuyun değilse Plakalar, 4 ° C'de saklanabilir. Spektrofotometre ölçümleri bozan yoğunlaşmayı önlemek için okumadan önce oda sıcaklığına mühürlü plakaları dönmek emin olun.
4. Virüs Büyüme belirlememize
- Son nokta mCherry için Venüs, 587:610 için 515:530 de floresan ve 415:457 f ölçünveya TagBFP (Uyarım: nm emisyon dalga boyu). Dört ölçümleri, her bir kanal için optimize edilmiş kazanç ayarları kullanarak oyuk başına ortalaması alınmalıdır. Not: Uygun emisyon dalga plaka okuyucu özel model ve filtre özelliklerine bağlı olarak farklı olabilir. Bu, her bir kanal için TRPV ve PLV arasındaki en büyük fark yoktur noktayı belirlemek için bir emisyon dalga boyu tarama yaparak ampirik bir şekilde tespit edilebilir.
- Deneyler arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için ham veri normalleştirmek.
- Her bir kanal için, suret TRPV ve PLV kuyu ortalamasını belirler.
- Her tedavi için ortalama TRPV enfekte deneysel ölçümlerden elde edilen ortalama PLV enfekte arka ölçümleri çıkarın.
- De sadece araç verilen değer, her arka plan çıkarıldı değerine bölünerek verileri normalleştirir.
- Bir deney birden çok kez, varyans tek yönlü analizi (tek yönlü ANOVA) testi ve çoklu c tekrarlanan edildikten sonraomparison sonrası test tedavilerinin herhangi her kanal için sadece araç tedavisinden istatistiksel olarak önemli bir fark olup olmadığını belirlemek için yansıtmaktadır gerçekleştirilebilir.
. Alternatif 5 Protokol: Kinetik Plate Tahliller
- Tedavilerin eklenmesi ile tüm adımları uygulayın (2.3 adım).
- Plaka okuyucu odası içinde yapıştırıcı film ve yer ile mühür levhası 37 ° C'ye dengelenmiş Not: Özel bakım aşırı hücre stres ve yoğunlaşmayı önlemek için 37 ° C'de sürekli plakaları tutmak için alınmalıdır. Kinetik analizi için,% 5 CO2 ilave olmadan uygun pH değerini muhafaza edilmesi için bir tamponlanmış ortam (sodyum bikarbonat ve HEPES) kullanmak için özellikle önemlidir.
- Set plaka okuyucu sonra zaman noktalarında doymasını önlemek için el ele. Not: Doğru kazanç optimizasyonu benzer koşullar altında bir uç nokta tahlilleri gerçekleştirilerek elde edilebilir.
- 8-24 HPI saatlik okumalar Edinme Simi kullanarak normalizeuç nokta deneyi gibi lar prosedürü (adım 4.2).
- Bireysel zaman noktaları daha önce tarif edildiği nokta deneyi gibi benzer yöntemler kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu virüslerin tipik bir kullanım örneği olarak, üç floresan haberci virüs çok iyi tanımlanmış bir çiçek virüsü inhibitörlerinin inhibisyon noktasını karşılaştırmak için kullanıldı.
HeLa hücreleri, siyah duvarlı açık, düz tabanlı 96 oyuklu plakalar işlemden geçirildi ve gece boyunca inkübe doku kültürü içinde plakalanmıştır. (TRPV Tablo 1) karışmış mono tabakalar üç raportör virüsü kullanarak 10 lik çoklu enfeksiyon (MOI) enfekte edilmiştir ya da promoter daha az Venus plaka harita (Şekil 1) ayrıntılı olarak gösterilen (PLV). Tedaviler içeren enfeksiyon ortamı,% 0.1 DMSO, 3.6 uM (1 ug / ml) bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere ilave edildi AraC, 50 uM (11.7 ug / ml) IBT, 5 uM (1.9 ug / ml) ST-246 ya da 60 uM üç kez (50 ug / ml) Rifampicin. Her stokları DMSO içinde 1 ul / ml 'de kullanılmıştır inhibitör Başlangıcı% 0.1 DMSO araç kontrolü olarak kullanılmıştır. Plaka 37 ° C incubato döndür 18 hpi kadar. Hücreler tüm oyuklara 100 ul% 8 PFA eklenmesi ile 15 dakika için sabit bir plaka okuyucusu üzerinde okuyun kadar ışıktan korunur PBS içinde depolanmıştır. Flüoresan okumaları bir Tecan Sonsuz M1000 plaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilen ve uyarma kuyu başına alt-okuma 4 puan i kontrol yazılımı (v1.5.14.0) edildi: 515:530 emisyon dalga boylarında, 587:610, 415:457 Venüs için nm , MCherry ve TagBFP flüoroforlar, sırasıyla. Önce son ölçümlere, kazanç (kazancı sırasıyla, Yeşil, Kırmızı ve Mavi ölçümleri için genellikle 235, 255, 235 idi) sensörleri doygunluğu olmadan maksimum sinyal vermek üzere optimize edilmiştir.
Şekil 1. Cr için kullanılan levha enfeksiyon 96 oyuklu ve küçük molekül ek düzeni 96 oyuklu plaka. Şeması'nda enfeksiyonlar ve ilaç tedavilerinin Örnek düzenitemsili sonuçlar yeme. Üçlü floresan virüsü (TRPV; açık gri) erken Venüs, ara mCherry ve geç TagBFP veya promotör-daha az Venüs (SNY; koyu gri) ifade üçlü sütunlar kullanılır. 1-β-D-arabinofuranosilsitosinin (AraC), β-tiyosemikarbazonu (IBT) izatin, Rifampisin, ST-246 ve test konsantrasyon ile DMSO araç kontrol sağda gösterilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Her örnek için nispi flüoresan birimi (RFU), her bir kanal için normalize edildi. İlk olarak, PLV kuyular için ortalama floresan yoğunluğu, her bir ilaç katkıda arka plan yoğunluğu hesaba katmak için her tedavi için TRPV kuyuların ortalama yoğunluğu çıkarıldı. Daha sonra, bu değer, DMSO ile tedavi edilen TRPV kuyuların ortalama yoğunluğu (vahşi tip büyüme) çıkartılır arka bölündü. Bilinen po ile muamele edilmesinden sonra elde edilen sonuçlarxvirus inhibitörleri, daha önce yayınlanan bulgularla ve etki anlaşılmaktadır mekanizma ile tutarlıdır. Erken gen transkripsiyonu ve ara gen ekspresyonu geçiş bırakma DNA replikasyonu 17 gerektirecek şekilde gösterilmiştir. Ve ara madde tam bir eksikliği ve geç ekspresyonu (% 0.4 DMSO ile muamele edilmiş, 0.3%, bu ile uyumlu olarak, AraC, DNA replikasyon inhibitörü, erken gen ifadesinde bir artış (Şekil 2, DMSO ile muamele edilmiş, erken ifade 210%) göstermiştir sırasıyla ara ve geç ekspresyonu, Şekil 2). Aksiyon mekanizması tam IBT için tanımlandığı olmasa da, bu dsRNA, RNase L yolu ve apoptoz 18-20 aktivasyonu artan miktarlarda sonuçlanan, okuma esnasında transkripsiyonu teşvik düşünülmektedir. Bir aşamalı ağır fenotip olduğu gözlenmiştir IBT tedaviye yanıt olarak, ara ve geç ekspresyonu, tek başına DMSO (% 24,7 'den anlamlı derecede daha az idive DMSO% 2.9 'sırasıyla, ara ve geç ekspresyonu için muamele edilmiş, Şekil 2). Tutarlı, ancak istatistiksel olarak anlamlı değildi azalma erken floresan de gözlenmiştir; ancak bu nedeniyle, bu daha sonraki bir zaman noktasında IBT kaynaklı apoptosis (18 HPI DMSO içinde 74.0%) olasıdır. AraC ve IBT aksine olarak, çiçek virüsü ilaçlar ST-246 ve hem de Rifampicin virion montaj ve olgunlaşması sırasında 15,16 geç gen ekspresyonu sonra inhibe eder. Veya Rifampicin (% 107,6; hücreler ST-246 (Şekil 2% 100.9,% 98.5 ve erken tedavi DMSO 94.5%, ara ve geç ekspresyonu, sırasıyla) ile tedavi edildiğinde gen ifadesi herhangi bir değişiklik bütün aşamalarında görüldü 104.2 ve% erken tedavi DMSO% 106.5, ara ve geç ekspresyonu, sırasıyla).
Yeni bir küçük molekül veya virüs mutantının önleyici etkisini keşfetmek Tarihsel olarak, düşük bir MOI (0.01-0.1 PFU / hücre) ve yüksek MOI bir arada (5-10 PFU / hücre) büyüme tahlilleri kullanılmıştır. Hücrelerin sadece bir alt başlangıçta enfekte olduğu için, düşük MOl'de, kaba önleyici etkileri genellikle daha küçük bir engellenmesi ile abartılı. Bir virüs önlendiği bir enfeksiyon döngüsü sırasında noktasını tanımlamak için çalışırken tüm hücreleri birincil inokulum tarafından enfekte olarak, yüksek bir İçişleri Bakanlığı enfeksiyon, büyük olasılıkla daha uygun. Şekil 3'te gösterilen deney = 1 daha düşük bir MOI olarak enfekte edilmiştir kuyu bir dizi ilavesi ile, Şekil 2'de olduğu gibi gerçekleştirildi. Post-transkripsiyonel olarak işlev inhibitörü olarak, ST-246 gen ifadesinin bir aşama etkilememelidir ; Bununla birlikte, zaman hücrelerin sadece bir alt kümesini enfeksiyonlu olduğu açıktırd (Şekil 3, İçişleri Bakanlığı = 1) ifade tüm aşamalarında (% 38.4,% 48.9 ve% 100,9,% 98.5, ve İçişleri Bakanlığı için% 94,5 oranla DMSO% 52.9 belirgin inhibisyon var = 1 vs İB = 10 sırasıyla erken, ara ve geç ifade enfeksiyon düzeyi, Şekil 3). ST-246 ile olgun viryon oluşumunu% 100 önlenmesini varsayıldığında, bu 10 enfeksiyonları ve hücrelerin arasında bir yerde 50 ve% 70 verimli bir MOI = 1 enfeksiyonu esnasında enfekte olmuş hücrelerin =% 100 MOI ile enfekte edilmiştir anlamına gelir.
Şekil 3,. Belirgin ST-246 inhibisyonu üzerindeki enfeksiyon düzeyinin etkisi. Yüksek hem de Şekil 2 'de olduğu gibi enfekte olmuş HeLa hücreleri (MOI = 10) ve düşük ST-246 ile muamele TRPV (MOI = 1). Bağıl floresan birimleri (RFU; plan her kanal bazlı o çıkartılırn PLV erken (yeşil için TRPV + DMSO, her tedavi ve normalize) için büyüme), ara ürün (kırmızı) ve geç (mavi) MOI = 1 veya MOI ya da enfekte olmuş hücrelerde viral sentezleme = 10 ve 20 uM ST-işlemden 246. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
| Isim | Tanım | Ref. |
| TRPV | Paket virüsü; C11R (Erken) Venüs terfi, G8R (Orta) terfi MCherry, F17R (Geç) mTagBFP terfi | 7 |
| PLV | Yarışmayı-az Venüs | |
| EV | C11R (Erken) Venüs terfi | |
| IV | G8R (Orta) Venüs terfi | |
| LV | F17R (Geç) Venüs terfi | |
| IREV | G8R (Orta) terfi MCherry ve C11R (Erken) Venüs terfi | |
| LREV | F17R (Geç) terfi MCherry ve C11R (Erken) Venüs terfi | |
| LR | F17R (Geç) mCherry terfi | |
| MCherry A4L | Geç-eksprese edilmiş virüs çekirdek proteinine A4L için VENUS fluorofor N-terminal füzyon |
Floresan muhabiri virüsleri tanımlayan aşı virüsü haberci soylarının Tablo 1.. Listesi. Tablo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, virüs replikasyonu, tekrar üretilebilir, gerçek zamanlı geri besleme ölçütleri temin eden bir çok-aşamalı vaccinia raportör virüsü (TRPV), pratik kullanımını tarif etmişlerdir. Iyi tanımlanmış bir çiçek virüsü inhibitörleri kullanarak, TRPV her bir inhibitör için eylem mekanizması ile anlaşılır uygun bir şekilde tepki olduğunu gösterebilmişlerdir. TRPV virüs virüs evre ilerleme hakkında en kapsamlı bilgi sunarken, iki aşamalı (IREV, LREV) ve tek kademeli (EV, IV, LV) virüsler de optimum protein katlanması yararlanarak, benzer şekilde kullanılabilir, istikrar, Venüs floroforun ve üstün sinyal-gürültü oranı.
Bu protokolde kanıtı kavram tahlil, bir basit, yüksek verim plaka deneyinde bilinen poksvirüs inhibitörleri ile gerçekleştirilir viral gen ekspresyonunun belirlenmesi aşamasını uygulanabilirliğini gösterir. Bu deney, hızlı ve kapsamlı tarama tamamlamak için uzatılabilirbilinmeyen kimyasal kütüphanelerin yanı. Virüsler, viral yaşam döngüsünün herhangi bir aşamasını bloke bileşiklerin özel kimlik sağlayan, düşük MOl'de küçük moleküllü muamele edilmiş hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir. Inhibitörleri sonra (tam gen ekspresyon ama hiçbir virüs yaymak) gen ifadesi veya montaj orta veya geç, erken, giriş (hiçbir gen ifadesi) için, inhibe virüs yaşam döngüsünün evresini belirlemek için çeşitli Mois de TRPV kullanılarak taranabilir. Biz başarıyla Monkeypox 8 dahil olmak üzere çeşitli poksvirüslerden, karşı etkinliği olan yeni bir anti-poxviral inhibitörü tanımlamak için bu tekniği kullandık.
Bir plaka okuyucu biçimde Bu virüslerin kullanıldığı için ayrıntıları verilmiştir olsa da, aynı derecede iyi, mikroskobik inceleme için uygundur. Floresan mikroskop ile enfeksiyon ve gözlem de yararlı olabilir ki, viral aşama ilerlemesinin bir hücre ile hücre incelemesine izin verir (bakınız Şekil 2B)Bu tür bir doku enfeksiyonu veya viral veya bakteriyel ko-enfeksiyon koşullarda gibi bir karma hücre kültürü ortam,. Bu virüsler antiviral tarama 8 amaçla oluşturulan iken Ayrıca, biz onları bir virüsün yaşam döngüsünü araştıran temel araştırmada eşit yararlılık olmasını bekliyoruz. Örneğin, bu virüsler kolayca eksikliği ya da geleneksel teknikler kullanılarak tadil edilmiş ya da viral proteinlerin aşırı ifade edilebilir; virüs gen ifadesi ve yayılma kinetiği sonra viral kopyalamanın tüm aşamaları için gerçek zamanlı olarak izlenebilir.
Virüs-host etkileşim araştırmaları de bu raportör virüslerin kullanımı yararlanabilir. Bu muhabir örneğin bazı birincil hücre hatları, çevresel kan lökosit ya da farklı türler 21,22 gibi geçirgen olmayan hücre türleri arasında enfeksiyon sırasında tamamlanan viral replikasyon aşamasının hızlı tanımlanmasını sağlar. Bilgi Bu kullanarak toplananalet ve çiçek virüsü ana sınıfı için sınırlama faktörleri bilgi ve viral immüno-modülatör proteinlerin işlevini daha fazla olacaktır. Virüsler de bir bütün genom ölçekli ekran veya bir yönlendirilmiş küçük kütüphane eleği ya da içinde, enfeksiyon için gerekli olan ana faktörleri demonte ile inhibe virüs replikasyonu aşamasını belirlemek için yararlı olacaktır.
Yeni sistemde, bu virüs kullanmaya başlayan bu protokolde çeşitli adımlar kritik düşünülmelidir. Levha formatında, büyüme ortamı ve hücre tipi farklılıklar MOI değişmelerinin, aşılama zaman veya kuluçka süresi gerekebilir. Bu yüksek verimli bir formata kadar ölçeklendirme önce bitiş inkübasyon süresini optimize etmek için özellikle önem kazanmaktadır. İdeal inkübasyon süresini belirlemek için, bir pilot kinetik plaka deneyi (adım 5) yapılmalıdır. Bir kinetik Deney sırasında, floresans ölçümleri, 12-24 saat boyunca her saat yapılır ve daha sonra zaman kesin olarak belirlemek için kullanılabilir hangi greatest fark kontrol ve tedavi virüs ifade arasında görülmektedir. Bu adımın önemi IBT, belirgin bir apoptosis için kurşun artış oranları nedeniyle önlenmesi, erken ekspresyonunda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma da. Ile muamele görülebilir Daha önce zaman noktaları (4-8 HPI) gözlendiğinde muhtemel açısından bir fark olmazdı. Buna ek olarak, yeni bir test bileşiği önleyici bileşik konsantrasyonları çok içermelidir. Bu floresan raportör virüslerin gen ifadesinde minimal değişiklikleri tespit etmek mümkün olsa da, birden fazla konsantrasyonları ile elde ek bilgi kendi genel etkisi daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.
Planlama ve bu virüslerin yaratılması sırasında, çok bakım yüksek sinyal-zemin özelliklere sahip 7 florosforlar seçiminde alındı. Venus protein başka bir test olarak flor göre önemli ölçüde daha iyi tanımlandıophore ve bu nedenle, üç çift ve tek bir floresan haberci virüslerinin gelişimi boyunca kullanıldı. Bu flüorofor kullanmanın bir sınırlama zaten füzyon proteininin bir yeşil flüoresan raportör ihtiva eden herhangi bir hücre hattını enfekte etmek için kullanılamaz olmasıdır. Bu koşullar altında analiz çözmek için, çeşitli alternatif virüs kırmızı floresan proteinleri (Tablo 1) kullanılarak yaratıldı. F17R geç promoteri ya da doğal A4L geç promoter bir MCherry A4L füzyon proteininden çözünür mCherry eksprese tarafından Venüs olmadan benzer ölçümler gerçekleştirmek mümkün bulunmaktadır. MCherry kullanım Venüs protein tarafından sağlanan yararı yoktur, ancak biz şimdi yeşil-salgılayan hücre hatlarının ölçümü karşılamak mümkün.
Özetle, biz yüksek verimli plaka okuyucu veya yüksek içeriği görüntüleme assa dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar ile muhabir aşı virüslerinin bir dizi geliştirdiys. Bu virüsler, geleneksel yöntemlere göre çok daha hızlı viral yaşam döngüsünün inceleme yapacak ve temel bilim hem de uygulamalı antiviral araştırma için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok ve hiçbir patent virüs veya tarama yöntemleri için bekleyen.
Acknowledgments
Biz ST-246 sağlamak için SIGA Teknolojileri (Corvallis, OR) teşekkür ederim. DKR Boston Üniversitesi (5T32AI 7309) için immünoloji bir NIH eğitim bursu ile desteklenmiştir. Bu çalışma P41 086180 tarafından kısmen desteklenen, NIH RO1AI1096159-01, ve RO3'ü (JHC için).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S.
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
