Summary
אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.
Abstract
Poxviruses הוא משפחה של וירוסי DNA גדילים כפולים הכוללים פתוגנים פעילים אדם כגון קוף, contagiousum molluscum, ווירוס Contagalo. המשפחה כוללת גם את נגיף האבעבועות השחורות, אבעבועות. בשל המורכבות של שכפול poxvirus, שאלות רבות עדיין נותרו לגבי אסטרטגית ביטוי הגנים שלהם. במאמר זה אנו מתארים את המשגה והשימוש בוירוסי vaccinia רקומביננטי המאפשרים מדידה של שלבי יחיד המרובים של ביטוי גנים נגיפי בפורמט תפוקה גבוהה בזמן אמת. זו מופעלת באמצעות השימוש בחלבוני ניאון ספקטרלית להבדיל כתבים לכל אחד משלושה שלבים בשכפול נגיף. וירוסים אלה מספקים יחס אות לרעש גבוה, תוך שמירה על דפוסי שלב ספציפיים ביטוי, מבחני מבוססי צלחת מאפשרים ותצפיות מיקרוסקופיות של התפשטות נגיף ושכפול. כלים אלה שימושים לגילוי נגיפים, מחקרים של האינטראקציה מארח וירוס, וביו אבולוציוניתמשעמם.
Introduction
באופן מסורתי, ביטוי וירוס הוא למד תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולריות (סופג למשל צפוני, מערבי סופג, הכלאה microarray, וכו ') 1. בעוד שיטות אלה מסוגלים לספק מידע מפורט ביחס לסיווג שינויי ביטוי של mRNAs או חלבונים הבודדים, הם בדרך כלל לא ניתנים לתהליכים בזמן אמת ותפוקה גבוהה. גישות אלטרנטיביים באמצעות כתבי הקרינה מבוססת יושמו בעבר בעבודה עם poxviruses; עם זאת, הפיתוח והשימוש שלהם כבר מונעים על ידי מטרות מגוונות. מספר שיטות כגון נועדו לבחירה של וירוסי רקומביננטי 2,3. טכניקות אלה מבטאים EGFP על התאגדות וביטוי של ה-DNA אקסוגני משיבוטי vaccinia רקומביננטי מתאימים. באופן דומה, מספר זני vaccinia יציבות להביע EGFP מסיס או חלבוני GFP-tagged הביעו תחת אמרגן vaccinia ילידים היו בשימוש נרחב. אלה typically משמש לכמת כניסת וירוס ושכפול במהלך מבחני נטרול מבוסס נוגדנים, עיכוב כימי, או השוואה של יעילות אנטי 4-6. בעוד וירוסים אלה הוכיחו שימושיים, הם מוגבלים ביכולתם כדי לספק מידע מפורט על הנקודה של עיכוב עקב שימושם של אמרגן מוקדם / מאוחר משמעי אחת נגיפי. גם שיטות קודמות עשו שימוש בחלבון EGFP עם מאפייני אות לרעש שאינו אופטימליים.
בשל המורכבות של שכפול poxvirus והמחסור בכלים קיימים לרשות assay שינויים בזמן אמת בביטוי גנים נגיפי, פיתחנו חבילה של וירוסי כתב במה יחיד ורב 7,8. כפי שמתואר בפרסומים קודמים, וירוסים אלה מבטאים אחד, שתיים, או שלושה חלבוני ניאון ספקטרלית להבדיל מיזמי vaccinia ילידים במהלך מוקדם, שלבי ביניים, או מאוחר בזיהום. וירוסים אלה יכולים להיות לנוed כסמן להתקדמות שכפול נגיף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי והם באותה מידה גם מתאימים למבחני צלחת וקורא המבוסס על תפוקה גבוהה. וירוסים אלה הם קלים לשימוש במקום של סוג בר וירוס, הולך וגדל עם קינטיקה דומה כדי להגיע לכותרות שווה ערך 7. במהלך התכנון וההקמה של הווירוסים הללו, הרבה טיפול נלקח בבחירת fluorophores שיש להם מאפייני אות לרקע גבוהים עם יעילות קיפול מעולה כדי להקל על כימות אמין עם משוב מהיר לשינויים בביטוי (ונוס, mCherry וTagBFP). בנוסף, שילובים של יזמים ויראלי נבחרו אשר מייצרים באיכות גבוהה, ביטוי בשלב מסוים חד משמעי, המספק מידע על מגוון רחב של מוקדם (אמרגן C11R), (אמרגן G8R) ביניים וביטוי גנים (אמרגן F17R) באיחור, בניגוד למעורפל יזמים מוקדם / מאוחר.
וירוסים אלה יכולים לשמש ככלי לinvestigating את מחזור החיים של poxvirus, וירוס vaccinia הטיפוסי. הרבה עדיין לא ידוע על האינטראקציה מארח וירוס למרות ההיסטוריה הארוכה של מחקר. Vaccinia הוא מורכב, לייצר מעל 200 חלבונים ייחודיים, אשר רבים מהם המערכת החיסונית ולארח עוינים. לאחר ההדבקה, וירוס vaccinia מתחיל מייד שעתוק mRNA המוקדם. זה הקל על ידי גורמי RNA פולימראז ותעתיק שהועמסו על הגנום הנגיפי במהלך אריזת virion והחזיקו במצב מושהה עד זיהום שלאחר מכן. ביטוי מוקדם זה בעיקר מייצר חלבונים הנדרשים לדיכוי של מערכת חיסון המארח (decapping-mRNA, תפיסת dsRNA, וחלבונים הקולטן דמה כמו גם מעכבים של אפופטוזיס, תגובת לחץ, ושיחה, אילינוי, ואיתות NF-κB) ושכפול הגנום. ביטוי מוקדם מייצר גם גורמי שעתוק הכרחיים לביטוי ביניים. ביטוי ביניים כולל את הביטוי של גורמי שעתוק בשלב מאוחר. זהמפל ביטוי מוביל לייצור של חלבוני נגיף מבניים והאנזימטית בשלבים מאוחרים של זיהום, אשר נחוצים להרכבה של virion vaccinia הבוגרת מלאה.
הקבוצה של וירוסי כתב ניאון שלנו מאפשרת להתקדמות מהירה שעשתה בהבנה של הביולוגיה poxvirus. אחת השיטות הנפוצות וזמן רב ביותר בתחום וירולוגיה הוא assay הצמיחה. זה בדרך כלל כרוך בהדבקה של תאים, לחוקק שורה של טיפולים, וירוס קצירה ידי lysing תאים נגועים, וכימות כייל נגיף וכתוצאה מכך על ידי assay פלאק. שימוש בוירוסי הכתב המתואר כאן מאפשר מדידה בזמן אמת של צמיחת וירוס שיכול להיות assayed בקלות ובהשוואה בין מספר רב של טיפולים שבוצעו במקביל. אנו צופים זו קבוצה של חומרים כימיים אשר תשמש בפרוטוקולים שונים לזיהוי שינויים בביטוי הגנים נגיפי בתגובה לטיפול תרופתי, RNAi knockdown, או הגבלת טווח מארח.
שיטה זו גם מאפשרת ניתוח גבוה תוכן בקנה מידה גדולה יותר מאשר היו זמין בעבר, מה שמאפשר למסכי תרופה אנטי ויראלית תפוקה גבוהה לשלבים יעד ספציפי מוגדרים של עניין. בעוד טיפולים פוטנציאליים רבים כדי להילחם בזיהום poxvirus זוהו, ה-FDA אישרה רק טיפולים יעילים לטיפול בזיהום poxvirus הם נוקלאוזידים אציקליות פוספונאט, cidofovir, וטיפול עם 9,10 גלובולין חיסוניים vaccinia. למרות מיגור האבעבועות השחורות בשנת 1977 11, poxviruses יישאר איום משמעותי על בריאות אדם 12. הפסקת חיסון רחב היקף נגד וירוס אבעבועות הובילה לרגישות מוגברת לpoxviruses האחר 13. לדוגמא, האזורים של מרכז אפריקה המוגן בעבר על ידי חיסון חווים עלייה חדה בנגיף Monkeypox 14. גם דאגה משמעותית כברהועלה בנוגע הרגישות הסמויה לשחרור מכוון של נגיף אבעבועות. בשל הטיפולים מוגבלים הזמינים כרגע, יש צורך דחוף בפיתוח של טיפולים חדשניים. וירוסי כתב אלה מאפשרים הקרנת מעכבי מולקולה קטנות מהירה ותפוקה גבוהה לעיכוב של שלב מסוים בשכפול נגיף. זיהוי של מעכבים כי יעד שלבי ביטוי ויראלי כרגע לא היעד של עיכוב יהיה להקל על פיתוח של טיפולים משולבים עם עוצמה מוגברת.
ניתן ללמוד הרבה על ביולוגיה של תא vaccinia על ידי התבוננות שינויים בביטוי הגנים של כל שלב. הנחתה על ידי כימי או מניפולציה גנטית של תא מארח נגוע מתבטאת בדרך כלל במונחים של כותרות ויראלי מופחתות. עם זאת, על ידי השוואת שינויים בכל שלב של מפל ביטוי ויראלי, ניתן לקבל הבנה של איך כושר וירוס הוא השפעה שלמה יותרed על ידי טיפול מסוים. נתונים אלו הוכחו לתאם גם עם פלט כייל נגיף המסורתי, אלא לספק מידע מכניסטית מפורט יותר, כמו גם יכולות תפוקה גבוהה 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תאי פלייט
- לנתק את תאי הלה מהצלחת ולדלל בתקשורת צמיחה (DMEM, 2 L-שפע מ"מ, 10% FBS) לכ 2.0 x 10 5 תאים / מיליליטר. לוותר 100 μl / גם בצלחת שחורה עם קירות, ברורה שטוחה תחתונה 96 היטב (20,000 תאים / טוב).
- דגירה תאים עבור 24 שעות עד מחוברות בחממה 37 ° C + 5% CO 2.
2. להדביק תאים
- לדלל וירוס ולהדביק תאים.
- הפשירו TrpV (וירוס חדר לשלושה; המוקדם ונוס, בינוני mCherry, TagBFP המאוחר) וPLV (יזם פחות ונוס) וירוס ניאון וdisaggregate באמצעות sonication במשך 5 דקות. לחלופין, יכולות להיות מעורבות במניות וירוס גולמי 01:01 עם 0.25 מ"ג / מיליליטר טריפסין בתקשורת זיהום וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- לדלל מניות וירוס גולמי ב37 ° C מדיה זיהום (DMEM, 2 L-שפע מ"מ, 2% FBS). לזיהומים גבוהים משרד הפנים (10 PFU / תא), לדלל מניות וירוס ל1.0 x 10 7 PFU / מיליליטר בהנחת 5 x 10 4תאים / היטב ובידוד נפח 50 μl. תכנית על הדבקה של 3 בארות לשכפל עבור כל טיפול עם TrpV ועוד בארות לשכפל 3 לאותו טיפול עם PLV לתת דין וחשבון לקרינת רקע ספציפי לכל טיפול.
- להדביק בארות על ידי הוספת 50 וירוס μl / מדוללת היטב בתקשורת זיהום. זה מוגדר כזמן = 0 הודעה hr זיהום (0 HPI).
- לדלל תרכובות טיפול רצויים לתקשורת זיהום. עבור כל טיפולי דילול תערובת אחת 2x אדון צריך להיעשות ומיושם לשכפל בארות (נפח כולל למשל 350 μl במשך שש 96 בארות עם 50 μl כל אחד).
- לדלל תרכובות ניסיוניות לתקשורת זיהום.
- לדלל ממס רכב שליטה (למשל PBS, DMSO) לתקשורת זיהום. הערה: יש להשתמש בריכוזים סופיים דומים של ממסים רכב שליטה כפי שהוחלו לתרכובות ניסיוניות (למשל, אם מניית IBT שלך הוא עשה עם DMSO והשתמשה בconcentratio סופיNS של μl 1 / מיליליטר, ואז להשתמש DMSO לבד ב1 μl / מיליליטר כשליטה ברכב).
- לדלל תרכובות שליטה לתקשורת זיהום. תרכובות שליטה מומלצות כוללות: 3.6 מיקרומטר (1 מיקרוגרם / מיליליטר) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (Arac), 50 מיקרומטר (11.7 מיקרוגרם / מיליליטר) isatin β-thiosemicarbazone (IBT), 60 מיקרומטר (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ריפאמפיצין, או 5 מיקרומטר (1.9 מיקרוגרם / מיליליטר) ST-246 8,15,16. ראה נציג תוצאות להשפעות צפויות. הערה: לעשות דילול זה בפעמים (2x) הריכוז הסופי הרצוי שכן זה מתווסף ביחס של 1:1 להיקף כבר בבאר.
- מייד לאחר תוספת של וירוס, להוסיף 50 תקשורת זיהום μl מכילה טיפולים ובקרות רצויים בדילול בשלב 2.2. הערה: כדי assay לעיכוב לפני ביטוי בשלב מוקדם, מתחם (ים) יכול להיות שהוסיף ישירות לבידוד הנגיף המדולל (הצעד 2.1.2) או לארח את התאים לפני ההדבקה (לפני הצעד 2.1.3).
- דגירה 6-24 שעות ב# 37 &176; חממת C + CO 2 של 5%.
3. תקן תאים
- תקן את התאים על ידי הוספת 100 μl paraformaldehyde 8% לתקשורת זיהום כבר בכל טוב. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות מוגנות מפני אור. הערה: מומלץ להוסיף PFA 2x (8%) ישירות לתקשורת כדי למנוע זיהום aerosolization של vaccinia זיהומיות, אשר יכול להתרחש אם תקשורת גבוה כייל היא הפוכה ישירות לתוך צלחת פסולת לפני הקיבוע.
- הסר מקבע על ידי היפוך צלחת למנת הפסולת.
- הוספה של טמפרטורת חדר PBS 100 μl.
- לאטום צלחת עם סרט דבק ברור אופטי. הערה: ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C, אם לא קראו באופן מיידי. הקפד להחזיר צלחות אטומות לטמפרטורת חדר לפני הקריאה כדי למנוע התעבות מעיוות מדידות ספקטרופוטומטר.
4. לכמת צמיחת וירוס
- למדוד הקרינה נקודת סיום ב515:530 עבור ונוס, 587:610 לmCherry, ו415:457 fאו TagBFP (עירור: פליטת גל בננומטר). ארבע מדידות צריכה להיות בממוצע לכל גם באמצעות הגדרות רווח מותאמות לכל ערוץ. הערה: פליטת הגל המתאים עשוי להיות שונה בהתאם למאפייני הדגם ומסנן הספציפיים של קורא הצלחת שלך. זה יכול להיקבע באופן אמפירי על ידי ביצוע סריקת פליטת גל כדי לקבוע את הנקודה שבה יש ההבדל הגדול ביותר בין TrpV וPLV לכל ערוץ.
- לנרמל את הנתונים הגולמיים כדי להקל על השוואה בין ניסויים.
- לכל ערוץ, לקבוע את הממוצע של TrpV לשכפל ובארות PLV.
- הפחת את מדידות רקע שנדבק ב-PLV הממוצעים מהמדידות הניסיוניות שנדבקו ב-TrpV ממוצע לכל טיפול.
- לנרמל את הנתונים על ידי חלוקת כל ערך מופחת רקע על ידי ערך הרכב רק טובה.
- ברגע שניסוי כבר חזר מספר פעמים, ניתוח בכיוון אחד של שונות מבחן (ANOVA חד כיווני) וג מספרomparison לאחר הבדיקה ניתן לבצע על מנת לקבוע אם כל אחד מהטיפולים משקף הבדל מובהק סטטיסטי מטיפול הרכב בלבד לכל ערוץ.
. 5 פרוטוקול אלטרנטיבי: מבחני פלייט קינטי
- לבצע את כל הפעולות באמצעות תוספת של טיפולים (שלב 2.3).
- צלחת חותם עם סרט דבק ואת מקומו בתא של צלחת קורא equilibrated 37 ° C. שים לב: יש לנקוט זהירות מיוחדת כדי לשמור על צלחות באופן עקבי על 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מתח תא מופרז ועיבוי. עבור מבחני הקינטית, זה חשוב במיוחד להשתמש במדיום שנאגרו (סודיום ביקרבונט וHEPES) כדי לשמור על רמת חומציות תקינה ללא תוספת של 5% CO 2.
- קורא צלחת קבוצה לזכות באופן ידני כדי למנוע הרוויה של נקודות זמן מאוחר יותר. הערה: ניתן להשיג אופטימיזציה של רווח מדויק על ידי ביצוע מבחני נקודת סיום בתנאים דומים.
- לרכוש קריאות לשעה ל8-24 HPI ולנרמל באמצעות סימיהליך lar כמו בassay נקודת הסיום (שלב 4.2).
- נקודות זמן בודד ניתן לנתח למובהקות סטטיסטיות תוך שימוש בשיטות דומות כמו assay נקודת הסיום שתואר קודם לכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדוגמא לשימוש האופייני של הווירוסים הללו, וירוס הקרינה-כתב המשולש שימש להשוות את הנקודה של עיכוב של כמה מעכבי poxvirus מוגדרים היטב.
תאי הלה היו מצופים ברקמת תרבות מטופלים בעלי קירות שחורות ברור צלחות 96 היטב שטוחות תחתונה וטופחו במשך הלילה. monolayers המחוברות היו נגוע בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 או באמצעות וירוס כתב משולש (TrpV; טבלת 1) או אמרגן פחות ונוס (PLV) כמפורט במפת הצלחת (איור 1). מדיה המכילה זיהום טיפולים נוסף כדי להשיג ריכוז סופי של DMSO 0.1%, 3.6 מיקרומטר (1 מיקרוגרם / מיליליטר) Arac, 50 מיקרומטר (11.7 מיקרוגרם / מיליליטר) IBT, 5 מיקרומטר (1.9 מיקרוגרם / מיליליטר) ST-246 או 60 מיקרומטר (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ריפאמפיצין בשלושה עותקים. DMSO 0.1% שימש כשליטה ברכב שכן כל מעכב מניות שימשו ב1 μl / מיליליטר בDMSO. הצלחת הוחזרה לincubato 37 ° Cr עד 18 HPI. תאים היו קבועים ל15 דקות בתוספת של 100 μl 8% PFA לכל הבארות ומאוחסנים ב-PBS המוגנת מפני אור עד לקרוא על קורא צלחת. קריאות הקרינה בוצעו באמצעות קורא צלחת טקאן האינסופי M1000 ותוכנת i-שליטה (v1.5.14.0) על ידי קריאה לתחתית 4 נקודות לכל גם בעירור: אורכי גל פליטה של 515:530, 587:610, 415:457 ננומטר עבור ונוס , Fluorophores mCherry, וTagBFP, בהתאמה. לפני מדידות סופיות, רווח היה מותאם כדי לאפשר אות מקסימלי ללא רוויה של חיישנים (רווח היה בדרך כלל 235, 255, 235 לירוק, אדום וכחולה מדידות, בהתאמה).
איור 1. פריסת נציג של זיהומים וטיפולים תרופתיים על 96 היטב צלחת. תרשים של התכנית בנוסף מולקולת 96, גם זיהום צלחת וקטנה המשמשת לCRאכילת תוצאות נציג. וירוס חדר לשלושה ניאון (TrpV; בהירים אפור) להביע מוקדם ונוס, mCherry ביניים, ומאוחר TagBFP או אמרגן פחות ונוס (PLV; אפור כהה יותר) נמצא בשימוש בעמודים בשלושה עותקים. 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (Arac), isatin β-thiosemicarbazone (IBT), ריפאמפיצין, ST-246 ושליטה ברכב DMSO עם ריכוז נבדק מסומנים בצד ימין. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
יחידות הקרינה היחסית (RFU) עבור כל לשכפל היו מנורמלות עבור כל ערוץ. ראשית, את עוצמת הקרינה הממוצעת לבארות PLV הייתה נגרעה מהעוצמת הממוצעת של בארות TrpV עבור כל טיפול כדי להסביר את עוצמת רקע שנתרמו על ידי כל תרופה. בשלב בא, ערך זה מחולק ברקע מופחת בעוצמה ממוצעת של בארות TrpV טופלו DMSO (גידול מסוג בר). התוצאות שהושגו לאחר טיפול עם פו הידועמעכבי xvirus היו עולים בקנה אחד עם ממצאים שפורסמו בעבר והבין מנגנון פעולה שלהם. הפסקת שעתוק הגנים מוקדם והמעבר לביטוי גני ביניים הוכח דורשת שכפול הדנ"א 17. עולה בקנה אחד עם זה, Arac, מעכבי של שכפול הדנ"א, הראו עלייה דרמטית בביטוי הגנים המוקדם (210% ביטוי מוקדם DMSO טופל; איור 2) וחוסר ביניים מלא וביטוי מאוחר (0.4% ו0.3% מDMSO טופלו ביטוי ביניים ומאוחר, בהתאמה; איור 2). בעוד שמנגנון פעולה המדויק אינו מוגדר לIBT, הוא חשב לקדם שעתוק לקריאה דרך, וכתוצאה מכך כמויות מוגברות של dsRNA, הפעלה של מסלול L RNase ואפופטוזיס 18-20. בתגובה לטיפול IBT פנוטיפ חמור בהדרגה נצפה שבביטוי ביניים והמאוחר היו פחות משמעותי מDMSO לבד (24.7%וטופלו .2.9% של DMSO לביטוי ביניים ומאוחר, בהתאמה; איור 2). הקרינה תחילת ירידה עקבית, אך לא משמעותית מבחינה סטטיסטית נצפתה גם; עם זאת זה כנראה עקב אפופטוזיס המושרה IBT בהמשך נקודת זמן זו (74.0% של DMSO ב18 HPI). בניגוד לArac וIBT, תרופות poxvirus ST-246 וריפאמפיצין הן מעכבות אחרי ביטוי גנים מאוחר במהלך עצרת virion והתבגרות 15,16. לא חלתי שינויים בביטוי הגנים נראו בכל השלבים, כאשר בתאים שטופלו גם עם ST-246 (100.9%, 98.5%, ו94.5% מDMSO טופלו מוקדם, ביטוי ביניים ומאוחר, בהתאמה; איור 2) או ריפאמפיצין (107.6%, 104.2%, ו106.5% מDMSO טופלו מוקדם, ביטוי ביניים ומאוחר, בהתאמה).
מבחינה היסטורית, שילוב של משרד הפנים נמוכים (0.01-.1 PFU / תא) וגבוה משרד הפנים (5-10 PFU / תא) מבחני צמיחה משמשים בעת לחקור את ההשפעה המעכבת של מולקולה קטנה חדשה או מוטציה בנגיף. במשרד הפנים נמוכים, השפעות מעכבות הכוללים לעתים קרובות מוגזמות על ידי אפילו עיכוב קל שכן רק תת קבוצה של תאים נגועים בתחילה. כאשר מנסים להגדיר את הנקודה במהלך מחזור זיהום שבו הוא עצור וירוס, זיהום משרד הפנים גבוה הוא סביר יותר מתאים, כמו כל התאים נגועים על ידי הבידוד העיקרי שלך. הניסוי שמוצג באיור 3 בוצע כמו באיור 2 בתוספת סט של בארות שהיו נגועים במשרד הפנים נמוכים יותר = 1. כמעכב שמתפקד לאחר תעתיק, ST-246 לא אמורים להשפיע על כל שלב של ביטוי גנים ; עם זאת, ברור שכאשר רק קבוצת משנה של תאים היא infecteד (איור 3, משרד הפנים = 1) יש עיכוב לכאורה של כל השלבים של ביטוי (38.4%, 48.9%, ו52.9% מDMSO לעומת 100.9%, 98.5%, ו94.5% למשרד הפנים = לעומת 1 משרד הפנים = 10 רמת זיהום של ביטוי מוקדם, ביניים ומאוחרים, בהתאמה; איור 3). בהנחת שעיכוב 100% מהיווצרות virion בוגרת על ידי ST-246, זה אומר של התאים 100% נדבקו במשרד הפנים = 10 זיהומים, ואי שם בין 50 ו70% מהתאים היו נגועים באופן פרודוקטיבי במשרד הפנים = זיהום 1.
איור 3. השפעת רמת זיהום בעיכוב ST-246 נראית לעין. התאים הלה נגוע כמו באיור 2 עם שני גבוהים (משרד הפנים = 10) ונמוכים (משרד הפנים = 1) TrpV מטופלים עם ST-246. יחידות הקרינה היחסית (RFU; רקע מופחתים כל o מבוססת ערוץn גידול PLV עבור כל טיפול ומנורמל לTrpV + DMSO) למוקדם (ירוק), בינוני (אדום), ומאוחר (ביטוי נגיפי בתאים נגועים בבית או משרד הפנים = 1 או משרד הפנים כחול) = 10 וטופלו ב20 מיקרומטר ST- 246. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| שם | תיאור | נ"צ. |
| TrpV | וירוס חדר לשלושה; C11R (קדומה) קידם ונוס, G8R (ביניים) mCherry קידם, F17R (מאוחרת) קידם mTagBFP | 7 |
| PLV | אמרגן פחות ונוס | |
| EV | C11R (קדומה) קידם ונוס | |
| IV | G8R (ביניים) קידם ונוס | |
| LV | F17R (מאוחרת) קידם ונוס | |
| IREV | G8R (ביניים) mCherry קידם וC11R (קדומה) קידמו ונוס | |
| LREV | F17R (מאוחרת) mCherry קידם וC11R (קדומה) קידמו ונוס | |
| LR | F17R (מאוחרת) קידם mCherry | |
| mCherry-A4L | היתוך N-מסוף של fluorophore VENUS לחלבון הנגיפי הליבה הביע מאוחר A4L |
טבלת 1. רשימת זני כתב וירוס vaccinia. טבלה המתארת וירוסי כתב הקרינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה, יש לנו תיארתי את השימוש המעשי של וירוס רב שלבית כתב vaccinia (TrpV), המספק אמצעים לשחזור, בזמן אמת משוב של שכפול נגיף. על ידי שימוש במעכבי poxvirus מוגדר היטב, הצלחנו להראות כי TrpV מגיב באופן עקבי עם המנגנון הבין פעולה עבור כל מעכבי. בעוד וירוס TrpV מספק את המידע המקיף ביותר על התקדמות שלב וירוס, בשני שלבים (IREV, LREV) ושלב אחד (EV, IV, LV) יכולים לשמש גם וירוסים באופן דומה, תוך ניצול של קיפול החלבונים האופטימלי, יציבות, ויחס אות לרעש מעולה של fluorophore ונוס.
Assay ההוכחה של קונספט בפרוטוקול זה מציין את הכדאיות של זיהוי השלב של ביטוי גנים נגיפי יבוצע על ידי מעכבי poxvirus ידועים בassay פשוט, גבוה צלחת תפוקה. assay זה יכול להתארך כדי להשלים הקרנה מהירה, מקיפהספריות כימיות לא ידועות גם כן. הווירוסים יכולים לשמש כדי להדביק תאים שטופלו מולקולה קטנה במשרד הפנים נמוכים, המאפשרים זיהוי הספציפי של תרכובות שחוסמות כל שלב של מחזור החיים הנגיפי. אז יכולים להיות מוקרנים באמצעות מעכבי TrpV בכמה MOIs כדי לקבוע את השלב של מחזור החיים של נגיף עכבות, מכניסה (אין ביטוי גנים), למוקדם, ביטוי גנים או הרכבה ביניים, או מאוחר (ביטוי מלא גנים אבל אף התפשטות נגיף). יש לנו בשימוש בטכניקה זו כדי לזהות מעכב אנטי poxviral חדש עם פעילות נגד מספר poxviruses, כוללים Monkeypox 8 בהצלחה.
אמנם יש לנו סיפקנו פרטים על שימוש בוירוסים אלה בפורמט צלחת קורא, זה מתאים באותה המידה גם לבדיקה מיקרוסקופית. זיהום והתבוננות דרך מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו איור 2) מאפשר לבדיקת תא אחר תא של התקדמות שלב נגיפית, אשר יכול להיות שימושי בהגדרה מעורב תא תרבות, כגון זיהום של רקמות, או בתנאי שיתוף זיהום נגיפיים או חיידקים. בנוסף, בעוד וירוסים אלה נוצרו לצורך ההקרנה אנטי 8, אנחנו מצפים מהם להיות של תועלת שווה במחקר בסיסי חוקר את מחזור החיים של נגיף vaccinia. לדוגמא, יכולים בקלות להיות שונה וירוסים אלה תוך שימוש בטכניקות מסורתיות או חוסר או ביטוי יתר חלבונים נגיפיים; קינטיקה של ביטוי גני וירוס והתפשטות אז יכולה להיות במעקב בזמן אמת לכל השלבים של שעתוק נגיפי.
חקירות של אינטראקציה מארח וירוס יכולות להפיק תועלת מהשימוש של וירוסי כתב אלה גם כן. כתבים אלה מאפשרים זיהוי מהיר של השלב של שכפול נגיפי הושלם במהלך ההדבקה של סוגי תאים שאינם מתירנית, כגון קווים מסוימים תא ראשוני, לויקוציטים דם היקפי, או מינים מסתעף 21,22. מידע שנאסף מלהשתמש בזהכלי הייתי להרחיב את הידע של גורמי הגבלת טווח מארח poxvirus שלנו והתפקוד של חלבונים חיסוני ויסות נגיפיות. הווירוסים גם יהיו שימושיים כדי לזהות את השלב של שכפול נגיף מעוכב על ידי מציאה של גורמי מארח נדרשים לזיהום, בכל קנה מידה מסך הגנום כולו או במסך ספרייה קטן בבימויו.
כמה צעדים בפרוטוקול זה צריכים להיחשב קריטיים כאשר מתחילים להשתמש בוירוסים אלה במערכת חדשה. הבדלים בפורמט צלחת, תקשורת צמיחה, ואת סוג התא עשויים לדרוש שינוי של משרד הפנים, בזמן חיסון, או משך דגירה. זה הופך להיות חשוב במיוחד כדי לייעל את זמן דגירה נקודת סיום לפני קנה המידה עד לפורמט תפוקה גבוהה. כדי לקבוע את זמן דגירה האידיאלי, assay צלחת הקינטית טייס צריך להתבצע (ראה שלב 5). במהלך assay הקינטית, מדידות הקרינה מבוצעות בכל שעה לשעות 12-24 וניתן להשתמש בו כדי לאתר במדויק את המועד שבו גרהבדל eatest הוא ציין בין שליטה וביטוי וירוס טיפול. חשיבותו של שלב זה ניתן לראות בטיפול עם IBT, שבו עיכוב בשל עלייה בשיעור של עופרת אפופטוזיס לנראית לעין, אם כי לא מבחינה סטטיסטית ירידה משמעותית בביטוי המוקדם. אם נקודות מוקדם יותר זמן (4-8 HPI) נצפו סיכוי שלא יהיה הבדל שנצפה. בנוסף, בדיקת מתחם מעכב רומן צריכה לכלול ריכוזי מתחם מרובים. בעוד וירוסי כתב הקרינה האלה מסוגלים לזהות שינויים מזעריים בביטוי גנים, מידע נוסף מתקבל על ידי ריכוזים מרובים יכול להוביל להבנה טובה יותר של ההשפעה הכוללת שלהם.
במהלך התכנון וההקמה של הווירוסים הללו, הרבה טיפול נלקח בבחירת fluorophores שיש 7 מאפייני אות לרקע גבוהים. חלבון ונוס זוהה כטוב יותר באופן משמעותי מאשר בכל פלואוריד נבדק אחרophore, ולכן היה בשימוש לאורך כל הפיתוח של וירוסי כתב ניאון משולשים, כפולים, ואחת. מגבלה אחת לשימוש בfluorophore הזה היא שהוא לא יכול להשתמש בהם כדי להדביק את כל שורת תאים כבר מכילה כתב ניאון ירוק חלבון היתוך של. כדי לטפל בניתוח בנסיבות אלה, כמה וירוסים חלופיים נוצרו באמצעות חלבוני ניאון אדום (טבלת 1). בהבעת או mCherry מסיס מהאמרגן מאוחר F17R או חלבון היתוך mCherry-A4L מהאמרגן מאוחר A4L הטבעי אנו מסוגלים לבצע מדידות דומות ללא ונוס. למרות שהשימוש בmCherry אין את היתרון הנוסף הניתן על ידי חלבון ונוס אנו מסוגלים להכיל מדידה בשורות תאים המבטאים ירוקות עכשיו.
לסיכום, יש לנו פיתחנו סדרה של וירוסי vaccinia כתב עם יישומים שונים, בם קורא צלחת תפוקה גבוהה או אסא הדמיה תכולה הגבוהי"ש. וירוסים אלה יעשו בדיקה של מחזור החיים הנגיפי הרבה יותר מהר מאשר בשיטות מסורתיות, ויכולים לשמש למדע בסיסי, כמו גם מחקר אנטי מיושם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף ואין פטנטים תלויים ועומדים לוירוסים או שיטות הקרנה.
Acknowledgments
אנו מודים Siga טכנולוגיות (Corvallis, OR) למתן ST-246. DKR נתמכה על ידי מענק NIH אימונים באימונולוגיה באוניברסיטת בוסטון (5T32AI 7309). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי P41 086,180, NIH RO1AI1096159-01, וRO3 (לJHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
