Sonikering lettet immunfluorescensfarvning af sen-fase Embryonale og Larve<em> Drosophila</em> Væv<em> In Situ</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

Undersøgelser udført i Drosophila melanogaster embryoner og larver giver afgørende indsigt i udviklingsprocesser såsom celle skæbne specifikation og organogenesis. Immunfarvning giver mulighed for visualisering af udvikle væv og organer. Men en beskyttende neglebånd, der udgør ved udgangen af ​​embryogenese forhindrer gennemtrængning af antistoffer i sene embryoner og larver. Mens dissektion før immunfarvning regelmæssigt bruges til at analysere Drosophila larvernes væv, det viser sig ineffektiv for nogle analyser fordi små væv kan være svært at finde og isolere. Lydbehandling giver et alternativ til dissektion i larvernes Drosophila immunfarvning protokoller. Det giver mulighed for hurtig, samtidig behandling af et stort antal sene embryoner og larver og har i stedet morfologi. Efter fiksering i formaldehyd, en prøve sonicated. Prøven underkastes derefter immunofarvning med antigen-specifikke primære myreibodies og fluorescensmærkede sekundære antistoffer for at visualisere mål celletyper og specifikke proteiner via fluorescensmikroskopi. Under processen med lydbehandling, korrekt placering af en sonikerende sonde over prøven, samt varigheden og intensiteten af ​​lydbehandling, er kritisk. Det kan være nødvendigt Additonal mindre ændringer af standard immunfarvning protokoller efter kvalitet pletter høj. For antistoffer med lavt signal-støj-forholdet, længere inkubationstider er typisk nødvendig. Som en proof of concept for denne lydbehandling lettet protokol, viser vi immunostains tre vævstyper (testikler, æggestokke, og neurale væv) på en afstand af udviklingsstadier.

Introduction

Drosophila embryoner og larver giver en fremragende model til at studere udviklingsprocesser i mange organer og væv. Scanning af individuelle celler er ofte nødvendigt i disse undersøgelser for at fastslå de komplekse miljøer, hvor celler udvikler. Visualisering af celler i væv kan gøres ved immunfarvning. Velbeskrevet immunfarvning protokoller findes for embryonale Drosophila væv <17 timer efter æglægning (AEL) ^1-3. Men en beskyttende neglebånd formularer mod slutningen af ​​embryogenese, der hindrer effektiv antistof gennemtrængning. Således er disse immunfarvning protokoller er ineffektive i analysen af væv i sene fostre og i de efterfølgende faser af larvernes udvikling ^(1. stadie (L1), ^2. stadie (L2), og ^3. stadie (L3)). Denne ineffektivitet pålægger en barriere for vores forståelse af dynamiske processer, der opstår i løbet af denne forlængede udviklingsperiode ^4. Tissue dissektion er en almindeligt anvendt teknik til at omgå denne barriere ^5-7. Imidlertid kan dissektion bevise ineffektiv. Ekstraktion kan tynget af vanskeligheder med at finde eller isolering embryonale og larvernes væv. Desuden kan fysisk fjernelse af målvæv forårsage skade ved at briste dem eller ved ikke at udvinde dem i deres helhed.

Sonikering er en metode, der anvender lydbølger til at forstyrre intermolekylære interaktioner. Det er blevet anvendt til at forstyrre integriteten af Drosophila larvestadiet kutikula for at immunfarve udvikle neurale celletyper ^6. Denne protokol er blevet tilpasset til immunfarve senfase embryonale og larvernes kønskirtler, som kan være så lille som 50 um i diameter ^8-10. Gennem sådanne undersøgelser, er processen med mandlige germline stamcelle (GSC) niche dannelse blevet karakteriseret i sent stadium Drosophila embryoner ^8-10 og mekanismer, der regulerer stamceller udvikling og difrentiering i sene stadier embryonale gonader og larver er blevet belyst ^9-12. Således lydbehandling giver et effektivt alternativ til væv dissektion, der kan være vanskelig på grund af væv størrelse. Desuden giver det mulighed for immunfarvning af Drosophila væv in situ, hvilket efterlader cellerne inden for rammerne af hele organismen og opretholdelse in situ morfologi. Her beskriver vi en trin-for-trin-protokol til fluorescens immunfarvning af sen-fase embryonale gennem tidlig / midt-L3 væv in situ. Analyse af Drosophila gonade og nervevæv er vist i Repræsentative resultater at påvise effekten af denne protokol. Endvidere kan denne immunfarvning protokol tilpasses til at analysere andre Drosophila væv samt væv i andre organismer med en ydre kutikula.

Protocol

1. Fremstilling af en samling Cage Bedøve unge, frugtbare fluer med CO 2. Overførsel bedøvede fluer til et bur. For at opnå optimalt udbytte ved at bruge 100-120 voksne fluer spænder fra 2-7 dage gammel på en 4: 1-forhold mellem kvinder til mænd. Tillad fluer en passende akklimatiseringsperiode ~ 24 timer forud for opnåelse af prøven til fiksering. Hvis buret blev oprettet med jomfruelige hunner parret til mænd, en anvendelse en 36-48 timers akklimatisering periode. På den åbn…

Representative Results

For at demonstrere effekten af lydbehandling-baserede immunfarvning i analyse af sen-fase embryonale og larvernes væv in situ blev vildtype-embryoner og larver forarbejdet til immunfarvning af testikler, æggestokke, og nervevæv. Prøver blev afbildet via konfokal mikroskopi og repræsentative resultater er vist (figur 1 og figur 2). Resultaterne viser, at den beskrevne protokol er effektiv til at visualisere morfologiske funktioner samt enkelte celler in situ under …

Discussion

Denne protokol giver en metode til succes immunofarvningsprocedure målrette Drosophila embryonale og larvernes væv in situ, hvilket eliminerer behovet for dissektion. Som pr tidligere protokoller til farvning tidlige embryoner ^1,2,3 er chorion membran fjernes ved hjælp af 50% blegemiddel (NaOCI). Prøverne er fastsat i formaldehyd og methanol. Fordi larvestadiet kutikula forårsager ældre prøve at flyde, er hele prøven derefter ledt gennem en celle-si at sikre larvernes tilbageholdelse…

Materials

			Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)	For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%	Store at room temperature.
Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)	For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4	Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.
Triton 10%	For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
PEMS	0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA	Store at room temperature.
Pipes	For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH	Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.
Formaldehyde	37% formaldehyde by weight in methanol	Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane	n-Heptane	CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol	Methanol	CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate Buffer Tween (PBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%	Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.
Tween 10%	For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O	Rock to mix. Store at room temperature.
Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)	To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)	Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.
Normal Goat Serum (NGS)	To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O	Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol	In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution	1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)	Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.
Apple juice plates	To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O	Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.
Tegosept 10%	To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol	Store aliquots at -20 degrees C
Yeast paste	~50 g Dry Active Yeast	Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.
			Table 2: Staining Materials
DAPI	1:1000	Invitrogen	D3571 //// Stock at 5mg/mL
rabbit anti-Vasa	1:250		A gift from Ruth Lehmann
mouse anti-Fasciclin III	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10
mouse anti-1B1	1:4	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
guniea pig anti-Traffic Jam	1:2500		A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)
mouse anti-Prospero	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A
rat anti-Elav	1:30	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Rat-elav 7EBA10 anti-elav
mouse anti-Repo	1:10	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12 anti-Repo
goat anti-rabbit Alexa546	1:500	Invitrogen	A11010
goat anti-mouse Alexa488	1:500	Invitrogen	A11029
goat anti-guniea pig Alexa633	1:500	Invitrogen	A21105
goat anti-rat Alexa488	1:500	Invitrogen	A11006
			Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator Probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.	Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter