Summary
Değiştirilmemiş ve hiperfosforile tau proteinleri hiperfosforizasyonu bağımlı hızlı agregasyon kinetiğini ortaya çıkarmak için, iki in vitro toplanma deneylerde kullanıldı. Bu deneyler Alzheimer hastalığının ilerlemesini altında yatan fibriller oluşturmak için hiperfosforilize tau eğilimini modüle edebilir bileşikler için gelecek ekranlar için önünü.
Introduction
(AD), Alzheimer hastalığı tauopatıler olarak bilinen nörodejeneratif hastalıkların geniş bir koleksiyon biridir. Özetin özeti patoloji yatan tauopathy nöronlar, astrositler ve mikroglia 1-4 nörofibrillerin, NFTler vardır. NFT yoğunluk kognitif bozukluk 3,5 ve nöron kaybı 6 ile ilişkilidir. NFT düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanların (PHF) 7,8 oluşturur (bundan böyle "s-tau" olarak anılacaktır) temel olarak hiperfosforile tau proteinini içerir. Tau nöronal sinyalizasyon ve insan ticareti 9,10 için gerekli olan aksonal taşımacılığının kolaylaştırılması düşünülen bir mikrotübül ilişkili bir proteindir. Her tau molekülü 2 ila 3 normal beyin fosfat, ancak tauopathy hastalarda 11 birkaç kat fosforıl içerik artar içerir. Çoklu kinazlar GSK3 (glikojen sintaz kinaz 3β) ve CDK5 (siklin-de dahil olmak üzere, Tau hiperfosforizasyon'un katkı muhtemeldirasılı kinaz 5) 12,13, ancak patolojik fosforizasyonundan doğrudan tetik zor 14 kalır. Veya mikrotübül bağlanma motifleri yakınındaki anormal fosforilasyon mikrotübül 15 gelen tau ayırır ve p-tau sonunda, NFT inklüzyonlar içine polimerize olabilir, düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanlar halinde oligomerizes somatodendritik bölmesi yerine tau yanlış lokalizasyon neden olur. tau hiperfosforilasyon, NFT oluşumu ve nörodejenerasyonda arasındaki yakın bağ p-tau yumaklar apoptotik ve diğer sitotoksik tepkiler, ve böylece tauopathy nörodejenerasyonda 16,17 altında yatan nedeni olduğunu bir yaygın hipotezine yol açtı. Bu öncül dayalı ilaç ekranları ve erken klinik testler 18 başlatılmıştır. Ancak, bu hipotez zorluklarla 19,20 karşıyadır. Örneğin, SantaCruz ve diğ., Transgenik farelerin bilişsel işlevler bir mutant ekspresyonunu bastırmak suretiyle geliştirilebilir gösterdiNFTler mevcut tau molekülleri 21 oluşturmak için devam olsa insan tau. Bir Drosophila modelinde, NFT temel nöron hücreleri 22,23 korumak için toksik sitosolik tau tecrit gösterilmiştir. Açıktır ki, NFT patogenezi rolü, eğer varsa, çok tauopathy terapötik geliştirme yönünde etkileyecektir.
Birkaç β-tabaka tercih edilen floresan boyalar, elektron mikroskobu, ışık saçılması spektroskopisi 24-27 bağlanması ile gösterildiği gibi, yüksek konsantrasyonlarda, yeniden birleştirici ya da normal beyin tau proteini içinde kendiliğinden yavaş yavaş, in vitro olarak, bir PHF-benzeri bir yapı haline polimerize eder. Ekleme heparin ya da arakidonik asit, insan beyninin bir miktarda yağ asidi, büyük ölçüde tau isoform- ve indükleyici, konsantrasyona bağımlı bir davranış 28-32 içinde PHF oluşumunu hızlandırır. Ilginç hiperfosforilize tau AD beyinlerinden saflaştırılmış veya in vitro fosforilasyon reaksiyonlarında ayrıntılı tarafından hazırlananDaha hızlı ve daha verimli bir ggregates 26,33-35. Bu sonuçlar p-tau patolojik rolleri ile mükemmel bir uyum içindedir. F-tau agregasyonu dayanan bir in vitro sistem, böylece, AD ilaç taraması için güçlü bir araç olarak hizmet edebilmektedir.
Tau toplanması ve AD ilerici nörodejenerasyona arasındaki yakın ilişki, yanı sıra Aβ plak hedefleme ilaç geliştirme son yetmezliği, MS 36-38 başka önemli histolojik işaretleyici, tau toplama artıyor kontrol ilaçları keşfetmek ilgi göz önüne alındığında. Nitekim, çeşitli gruplar zaten birincil tahlil gibi in vitro tau toplama reaksiyonlarda kullanarak, farklı verim ilaç ekranları başladı. Bir kimyasal madde sayısı in vitro 39-42 tau agregasyonu üzerinde inhibe edici ya da tersine aktivite sergilediği bulundu. Ancak, mevcut tüm tau toplama regülatörü ekranlar fosfor anahtar patolojik işareti özlüyor değiştirilmemiş tau kullanınylation, AD tedavisinde bu bileşiklerin kullanıldığı özgüllük ve etkinliği için bir endişe yükselterek.
Biyokimyasal karakterizasyonu AD ilaç taraması için çekiş tahlilleri geliştirilmesi önemli engellerden biri patofizyolojik ilgili hiperfosforile tau proteininin yeterli miktarlarda üretilmesidir. Tau 1N4R izoformu ve GSK-3β kinaz E. koeksprime edildiği Fermuarlar Destekli Kataliz sistemi kullanarak E. coli lösin zipper füzyon proteinleri olarak, bu sorunun üstesinden gelebilmek olan (. Sui ve arkadaşları, R.L. tau ve p-tau son ürünler için bakınız Şekil 1, aynı zamanda, p-tau ön kütle spektrometresi karakterizasyonu için 43 bakınız). Tau'nun farklı fosforilasyon bölgeleri için özel dokuz bir antikorlar panelinin kaynaktan, pozitif sinyaller sekiz pozisyonda görülmüştür (veriler gösterilmemiştir). Aşağıda, biz toplama kinetik d ayırt edebilir protokolleri ve instrumentations tarifdeğiştirilmemiş tau ve p-tau türleri arasındaki ifferences. Bu testler amiloid (tau agrega) üzerine Tioflavin T (ThT) veya tioflavin S (THS) olarak floresan artışı 26 bağlayıcı ölçülen yayınlanan protokolleri modifiye edildi. İlk "terminali", hiçbir boya yaklaşımı, toplama reaksiyonları monte edilir ve amiloid boya yokluğunda kuluçkaya. Farklı zaman noktalarında, her bir reaksiyonun bir tümböleni çıkarıldı ve tau toplulukları bağlamak için THT toplanmasını durdurmak ve izin vermek için ThT-içeren tampon eşit hacmi ile karıştırılmıştır. Floresans, bir IAP FluoroMax-2 florometre ile ölçülür. "Ile-boya" İkinci sürekli izleme deneyi, ThT veya THS toplama reaksiyonlarda yer almaktadır. Floresan elle tüm deney boyunca sürekli olarak ölçülür veya çok plaka okuyucu kullanarak olabilir. Buna ek olarak, sürekli ölçüm mo toplama için tau ve p-tau yakın bir fizyolojik konsantrasyon kullanan bir analiz tanımlamaktadırlarde. fosforilasyon etki hali hazırda farkedilebilir şekilde kalır. Aşağıda, biz adım adım operasyon prosedürlerini tanımlamak ve bu tahlillerin temsilcisi sonuçları gösterecektir. Her yaklaşımın artılarını ve eksilerini bazı Tartışma, yanı sıra potansiyel ilaç tarama uygulamaları takip edecek.
Yüksek konsantrasyonda tau kendiliğinden amiloid benzeri yapılar halinde toplanır. Bununla birlikte, laboratuvarda tau fibrillization tipik haliyle bu tür teşvik ediciler olarak heparin (ortalama molekül ağırlığı 6000 g / mol) ve arakidonik asit ile hızlandırılır. Burada gösterilen örnek 30 uM heparin içerir. Tau amiloid birikintilerinin oluşmasının Tioflavin T (ThT) ile ya da S (ths) Thioflavin bağlayıcı amiloid elde edilen fluoresans ile izlenir. (:;: 485 nm tepe emisyon 450 nm eksitasyon) tau topluluklarının bağlanma üzerine, ThT floresans kırmızı kayma gösterir. Ths, diğer taraftan, amiloid bağlayıcı önce 510 nm'de (450 nm'de uyanm) zayıf emisyon vardır, ancak bu fluorescencBu tür birleştirilmiş tau 44 gibi önemli bir amiloid proteininin mevcudiyetinde E artar. Her iki boya da tau ve p-tau bağlantısını tespit iyi çalışır. Çünkü ThT (bakınız Şekil 2), güçlü ve nispeten geniş emisyon tepe, 510 nm'de flüoresan biriminde sadece% 30 bir azalma vardır. Ya boya kullanırken kolaylık sağlamak için, biz tau izlemek için uyarma / emisyon dalga boylarında (yani, 450 nm / 510 nm) aynı kombinasyonunu kullanabilirsiniz.
Tau agregasyonu deneyinin amacına ve tau proteininin mevcudiyetine bağlı olarak, boya varlığında veya yokluğunda yapılabilir. Reaksiyonların her ikisi de modları aşağıda gösterilmiştir. Tek-örneklem flüorometre (ISA-Spex FluoroMax-2) ve bir çok plaka okuyucu (SpectraMax M2) - Ayrıca, iki farklı araçların çalışmasını göstermektedir. Okuyucular kendi özel ihtiyaçlarını ve enstrüman kullanılabilirliğini uygun bu protokolleri adapte gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Reaktifler 1. Hazırlık
- Agregasyon tamponu hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA). Ay için oda sıcaklığında kararlı saklayın. Kullanımdan önce 1 mM ditiotreitol (DTT), Supplement.
Not: HEPES bazlı tampon maddesi (10 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT) içinde, aynı zamanda tau toplanmasının içindeki sonuçlar verir. - T Thioflavin ya da 0.22 um'lik steril bir filtre birimi S stok (agregasyon tamponu içinde çözülmüş 3 mM) solüsyonu ve filtre Thioflavin hazırlayın. Ay, alüminyum folyo ile kararlı kapalı bir tüp içinde -20 ° C'de saklayın.
- (300 uM, toplama tamponu içinde çözülmüş), heparin stok çözelti hazırlayın. -20 ° C'de saklayın, ay boyunca stabildir.
- (Su içinde çözülmüş 1 M,), ditiotreitol (DTT) stok hazırlayın. 1.5 ml tüpler içine kısım. -20 ° C'de saklayın. Agregasyon deneyleri önce oda sıcaklığında 1 M çözelti eritin. Bu 1,000x stoktan deiyonize su ile stok çalışan 100 mM'lik bir kısım hazırlar. Buz üzerinde bırakınhazır olana kadar.
- ° C derin dondurucuda -80 tau çıkarın. Buz üzerinde eritin. Agregasyon tamponu ile önceden belirlenmiş bir konsantrasyona tau ayarlayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,800 x g'de bir mikrosantrfuj spin önceden oluşturulmuş büyük topaklar kaldırın. Bu ön-iplik adım protein hazırlık her parti sonraki floresan ölçümü tutarlılık artırır. Başka bir tüp süpernatant aktarın; toplama reaksiyonu monte hazır olana kadar buz üzerinde bırakın.
2. Hayır-boya, Terminal Deneyi
NOT: Bu deneyde agregasyon reaksiyonu floresan boya yokluğunda yapılır. Tüm bileşenler karıştırıldıktan sonra reaksiyon, önceden belirlenmiş zaman noktalarında için devam etmesine izin verilir. Saatlik numuneleri daha sonra çekiş reaksiyonu üzerinden alındı ve ThT veya flüoresan okumadan önce bağlayıcı amiloid ths ile karıştırılır. toplama reaksiyonun ilk hacmi gerekli zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Bu yaklaşım requ olabilirtau proteininin çok miktarda ire, ancak basit, hızlı ve florometre veya bir çoklu-çukurlu tabla okuyucusu (Tartışma) yapılabilir. Aşağıda adım adım operasyon, bir floresan ölçümü için ISA SPEX FluoroMax-2 kompakt spektrofotometreyi kullanarak.
- Tablo 1 'deki gibi 1.5 ml Eppendorf tüpler içinde, agregasyon karışımı ayarlayın. Her bir sütun, bir zaman noktası ölçümü için yeterli olan bir 100 ml'lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder. Özellikle deney için gereken zaman noktalarında dayalı tüm toplama karışımı için miktarını ayarlayın. Hata pipetlenmesinden yer vermek için her bir bileşenin ek% 10 ekleyin. Burada gösterilen tipik reaksiyon heparin ihtiva eden arakidonik asit ya da agregasyon tamponu ile ikame edilmiş olabilir. Reaksiyon karışımına 1 mM DTT ekleyin. Tüm reaksiyon birden fazla gün sürerse, bir indirgeyici ortam sağlamak için taze DTT gün (1 mM) tamamlar.
- Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Pla37 ° C inkübatör ya da su banyosu içinde, her reaksiyon ce. Ajitasyon tau toplama için gerekli değildir.
- Floresan ölçüm önce, (bilgisayar sonra, ilk lamba) spektroflorometre açın.
NOT: hemen kullanılabilecek ksenon ark lambası. Ancak, en iyi sonuçlar makine floresan okumadan önce yaklaşık 10 dakika ısıtın. - Bilgisayarda yazılımı başlatın.
- 510 nm (5 nm yarık) için Enstrüman Kontrol Merkezi'nde Gerçek Zamanlı Görüntü modu, (2 nm yarık) 450 nm ayarlanmış dalgaboyu ve emisyon dalga boyu seçin. Kapat Gerçek Zamanlı Görüntü modu penceresi Enstrüman Kontrol Merkezi'ne dönmek için.
- Dalga boyu setleri eklemek için üst çerçevede Sabit Dalgaboyu Analizi, Ekle tuşuna basın >> tuşuna seçin. 1 Standart Hata Set satın alma parametreleri ve 3 Maksimum Denemeler, ardından Ekle'yi tıklatın. ! Git tıklatın Veri Ekran açmak içinpenceresi.
- Veri Görüntüleme penceresinde, Yeni Numune iletişim kutusunu açmak için Başlat ACQ tıklayın. Numune türü için "bilinmeyen" seçiniz.
- Her 100 ul çekiş karışımına, 98 ul tampon maddesi birikme ve T. Pipet karıştırmak için birkaç kez, 3 mM Thioflavin 2 ul ekle.
- Bir küvete (FCA3, dış boyut, WxLxH = 12,5 mm x 12.5 mm x 45 mm) tüm karışımı aktarın. Numune-bölmeye örnek tutucuya küvet yerleştirin ve kapağını kapatın. Floresan veri toplamak için Çalıştır'ı tıklatın. Verileri kaydetmek.
- Küvet çıkarın ve çözüm süzün. Distile su 3 kat küvet durulayın. Ve küvet dışarıdaki havayı üfleyerek kuru.
Ile-boya 3. SpectraMax M2 Plaka Reader Sürekli Modu Deneyi
NOT: Bu deney, bir floresan boya ThT veya ths agrega dahil olması ile, bir öncekinden farklıdıryon reaksiyonu. Bu reaksiyonlar aynı seti sürekli ölçülmesini sağlar. (SpectraMax M2 çalışması aşağıda gösterildiği gibi) için reaksiyon tekrar kullanılması, bu yöntem, daha iyi bir otomatik, çok oyuklu bir plaka okuyucu ile yapılır. Düzenli florimetre de çalışır ama hızlı toplama reaksiyonların ölçüm sıklığı nedeniyle operasyon manuel doğası, biraz sınırlı.
- (96-çukurlu, düz siyah levha, iyi ses düzeyini 360 ul, düz taban kısmı), Tablo 2 de olduğu gibi, bir 96-çukurlu plaka içindeki agregasyon karışımı ayarlayın. Her sütun biri için yeterli olan bir 200 ml'lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder zaman noktası ölçümü. Birkaç kez pipetleme iyice karıştırın. Deneyler boyunca her gün taze 1mM DTT Supplement.
- 37 ° C'de 96-çukurlu plaka inkübe edin.
- Floresan ölçümü öncesinde her bir zaman noktasında, çok modlu mikroplaka okuyucusu ve bilgisayarı açın. Ma için yeterli zaman tanıyınmakina, yaklaşık 10 dakika stabilize etmektir.
- Bilgisayarda yazılımı başlatın. 37 ° C sıcaklık ayarlama ve floresan yoğunluğu (FI-en oku) modunda, 510 nm, 450 nm ve emisyon dalga boyuna ayarlanmış olan uyarım dalga boyunu seçin.
- Çekmece içine 96-plaka takın ve ölçümü başlatmak için OKU tuşuna basın.
- Okuduktan sonra, plaka kaldırmak ve 37 ° C inkübatör geri dönün. Veri analizi ve komplo için bir Excel elektronik veri kopyalayın ve yapıştırın.
4. ile-boya, Sürekli Modu Deneyi bir Kompakt spektroflorometre üzerinde
- Tablo 3 deki gibi 1.5 ml Eppendorf tüpler içinde, agregasyon karışımı ayarlayın. Her bir sütun, bir zaman noktası ölçümü için yeterli olan bir 200 ml'lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder.
- Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
- Spektroflorometre açın ve adımları 2.3 ve 2.4 gibi yazılım ayarlayın.
- Bütün karışım, t aktarınoa küvet. Numune-bölmeye örnek tutucuya küvet yerleştirin ve kapağını kapatın. Floresan veri toplamak için Çalıştır'ı tıklatın. Verileri kaydetmek.
- Veri Çalıştır'ı tıklatarak ve kayıt uygun aralıklarla okumaya devam edin. Toplama bir yüksek frekansta (örneğin, her 30 veya 60 sn) olarak izlenecek ise, ya ölüm bitene kadar makinenin küvete ve tepkiyi bırakın, ya da tepkiler veya küvetler takas için yeterli zamanı olduğunda.
- Küvet çıkarın ve çözüm süzün. Distile su 3 kat küvet durulayın. Ve küvet dışarıdaki havayı üfleyerek kuru.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rekombinant tau ve p-tau (Şekil 1) kullanılarak, protein agregatları amiloid bağlama sahasına bağlanması üzerine ThT ve TH'nin güçlü bir floresan emisyonu, aşağıdakileri içeren tau yararlanarak, tau ve p-tau agregasyonu kinetiklerini karşılaştırmak için iki farklı protokol kurulmuş ve p-tau (Şekil 2). Ile ya da toplama reaksiyonda floresan boya olmadan, biz hiperfosforilasyon (Şekil 3-5) tarafından tau toplanmasının tutarlı geliştirme gözlendi. Bu uyarım heparin bağımsızdır (veriler gösterilmemiştir). (Şekil 3 ve 5), p-tau deney süresince yüksek floresan birimlerinin sergileyen önemli ölçüde yavaşlatan önce ilk 30 dakika içinde hızlı oranlarda bir tipik reaksiyon, tau ve p-tau oligomerize olarak. Toplama reaksiyonlarında THT Dahil toplama oranı (Şekil 4) önemli geriliği neden olur. Her iki izoformu yaklaştı plattepkilerden sonra eau 160 saat başlamıştı. Ths Öte yandan, toplama (Şekil 5) arasında kayda değer yavaşlama neden olmaz.
Numuneler bir% 10 SDS-PAGE jeli ile çözüldü ve Coomassie mavisi R250 (sol) ile boyandı ya da (sağ, bir anti-tau monoklonal antikoru ile prob analizi yapıldı. Bu çalışmada kullanılan Şekil 1. Tau ve hiperfosforile tau (f-tau) saflaştınldı Panel). Çizgi M, molekül ağırlığı işaretleyici; kuşak 1 ve 3, fosforlanmamış tau; lane2 4, hiperfosforile tau.
Veya tau agrega bağlayıcı olmadan ThT (30 mcM) için Şekil 2. Emisyon spektrumları. Emisyon satın alma oldu s 450 nm 'de uyarım, 600 nm'de (0.1 san entegrasyonu, 5 mil Yarık genişliği 1 mil artış) ile 460 nm arasında konserve. Tau agrega 50 uM tau agregasyonu 37 ° de CO / N (ayrıntılar için Protokol 2) devam etmesine izin vererek elde edilmiştir.
Terminal tahlilde tau ve p-tau için Şekil 3. Toplama eğrileri. Toplama 50 mcM tau ve p-tau indükleyici olarak 30 mcM heparin ile tamamlandı. Reaksiyonun başlamasından sonra, farklı zamanlarda, reaksiyon 100 ul uzaklaştırılmış ve floresan ölçümden önce 60 uM ThT aynı hacmi ile karıştırılmıştır. Floresan 450 nm eksitasyon, 510 nm emisyonda ölçüldü. "Au", keyfi birimler. Zaman ölçeği, dakika olarak olduğuna dikkat edin.
"Şekil 4" src = "/ files / ftp_upload / 51.537 / 51537fig4highres.jpg" />
Tek başına ThT Şekil 4. Toplama eğrileri, ThT varlığında sürekli ölçüm moduna tau ve p-tau. Her bir tepkime, 0 ya da 50 uM tau'nun ya da p-tau, 30 uM heparin olarak ve toplama tampon maddesi içinde 30 uM ThT . Reaksiyonlar 96 oyuklu bir plaka içerisinde 37 ° C'de inkübe edildi. Farklı zaman noktalarında, plaka inkübatörden uzaklaştırılmış ve floresans okuma (eksitasyon 450 nm, emisyon 510 nm) için plaka okuyucusu ile yüklendi. Okumalar arasında, plaka, bir kapağın altında çalkalama olmaksızın kuluçka makinesi içinde tutulmuştur. ThT varlığı önemli ölçüde değiştirilmemiş meslektaşı yaptım daha önemlisi, hiperfosforilize tau hala toplama daha hızlı bir oran sergiledi, agregasyonu yavaşladı, ama. Zaman ölçeği saat olduğuna dikkat edin.
pload / 51.537 / 51537fig5highres.jpg "/>
Tioflavin gösterge boyası olarak S Şekil ths varlığında 5. Küçük ölçekli tau toplama tahlilleri. 6 mcM tau ve p-tau in vitro heparin kaynaklı toplama sürekli ölçüm modunda değerlendirildi. Proteinine ek olarak, her reaksiyon 30 uM Heparin ve HEPES agregasyon tamponu (10 mM HEPES pH 7.5, 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA) içinde 20 uM ths ihtiva etmiştir. Heparin hariç tüm bileşenler karıştırılmış ve oda sıcaklığında dengelendi. Heparin ilave edildikten sonra, reaksiyon küvetine aktarıldı ve numune tutucu içine yerleştirilmiştir. Floresan T 0 derhal kaydedilir ve yaklaşık 2 saat süre ile ya da floresan artışı sıfıra yakın yavaşlamış kadar devam edilmiştir. Çünkü nispeten kısa bir reaksiyon süresi, bütün reaksiyon aynı küvet içinde oda sıcaklığında gerçekleştirildi.
| tau | f-tau | |
| 60-100 uM tau | 50 ul | 0 ul |
| 60-100 mcM p-tau | 0 ul | 50 ul |
| 300 uM heparin | 10 ul | 10 ul |
| toplama tampon | 39 ul | 39 ul |
| 100 mM DTT | 1 ul | 1 ul |
Tablo no-boya 1. Toplama karışım bileşenleri, Terminal tahlil.
| tau | f-tau | Yalnız Boya | |
| 60-100 uM tau | 50 ul | 0 ul | 0 ul |
| 60-100 mcM p-tau | 0 ul | 50 ul | |
| 300 uM heparin | 20 ul | 20 ul | 20 ul |
| T Thioflavin 3mM | 2 ul | 2 ul | 2 ul |
| Toplama tampon | 126 ul | 126 ul | 176 ul |
| 100 mM DTT | 2 ul | 2 ul | 2 ul |
Bir plaka okuyucu ile-boya, sürekli tahlil için Tablo 2. Toplama karışım bileşenleri.
| tau | f-tau | Yalnız Boya | |
| 60-100 uM tau | 5 ul | 0 ul | 0 ul |
| 60-100 mcM p-tau | 0 ul | 5 ul | 01 l |
| 300 uM heparin | 20 ul | 20 ul | 20 ul |
| S Thioflavin 3mM | 1.5 ul | 1.5 ul | 1.5 ul |
| Toplama tampon | 171.5 ul | 171.5 ul | 176.5 ul |
| 100 mM DTT | 2 ul | 2 ul | 2 ul |
Kompakt spektroflorometre üzerinde olan-boya, sürekli tahlil için Tablo 3. Toplama karışım bileşenleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, farklı tahlil koşulları ve fosforilasyon-bağımlı hızlı tau toplama kinetik tespit aletleri gösterir. Terminal deneyde, floresans boya ThT her zaman noktasında ana karışımı çıkarılır reaksiyonun bir kısmına ilave edilir. Amiloid floresan sonra 26 ölçülür kaynaklı bağlanma. İkinci olarak, birlikte-boya modunda, tau agregasyonu tau topluluklarının büyüme gerçek-zamanda değerlendirilmesi için uygun bir reaksiyon, bu tür işleme, ThT veya ths mevcudiyetinde gerçekleştirilir. Bu yöntemlerin her biri kendi artıları ve eksileri vardır.
Terminal-mod reaksiyon tau toplama için gerekli sadece bu malzemelerle yapılmaktadır. Seyreltilmesi ve Tioflavin T ile reaksiyonu karıştırma ölçüde esas floresan ölçümü için reaksiyonu durur, floresan artış hızını yavaşlatır. Bu nedenle bu yöntem, aynı zamanda el ile işlemi ile uyumludur. Bununla birlikte, reaksiyonunun nedenin, pratik ThT ilave edildikten sonra sona erdirilir, tau'nun büyük miktarda bir agregasyon eğrisinin çizilmesi için gerekli olabilir. Bu yöntem için bir başka potansiyel bir uyarı Reaksiyon karışımına sık erişim mikrobik veya proteolitik kirlenme ya da protein oksidasyonunu tanıtmak olmasıdır. Buna karşılık, ile-boya modu ThT veya ths varlığında amiloid oluşumunu sağlar. toplama ilerlemesi hiç reaksiyonu bozmadan sürekli izlenebilir. Otomatik tahlil platformu kurarken Bu özellik, özellikle çekici. Bununla birlikte, farklı boya özel tepkileri ortaya çıkarabilir. Gerçekten de, ThT önemli tau ve p-tau geciktiren ancak ths küçük etkileri (Şekil 3 ve 5 ile karşılaştırın) yer alır. PHF oluşumu için histolojik ve hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılmış olan, Congo kırmızısından ve tiazinler, de dahil olmak üzere birkaç diğer floresan boyalar bulunmaktadır. En az bir rapor bu boyaların bazı dokuda tau neden olabileceğini belirttikültür hücreleri 45. Amiloidojenez kinetik çalışmalar için, bu bileşiklerin seçimi, bu nedenle, dikkatli tatbik edilir ve çeşitli boyalar karşılaştırılmalıdır sahip olabilir.
Alet seçimi ile ilgili olarak, ilk yaklaşımda kullanılan tek örnek florimetre oldukça güvenilir olmakla birlikte, daha fazla bir kaç reaksiyon göre söz konusu olduğu zaman çalışma zahmetli olabilir. Bu kırılgan kuvars küvetler maliyeti bazı engelleyici olabilir, ancak birden fazla küvetler, reaksiyonlar arasında çapraz bulaşmayı önlemek yardımcı olabilir kullanma. Bunun aksine, çok oyuklu mikro-plaka okuyucu, aynı anda birden fazla tepkime inceleyebilir. tek 96-yuvalı plakaların kullanılması da avantajlıdır. Bir ısıtma elemanı ile, bir mikro-plaka okuyucu, uzun bir süre boyunca 37 ° C 'de birden fazla tepkime izleme için özel bir aygıt olabilir. Bununla birlikte, buharlaşma, bir tercih sebebi olabilir. DiNitto ve diğ. Önlemek için, mineral yağ ile benzer bir reaksiyon bindirilmişbuharlaşma 46.
Bazı önlemler tutarlı ve kantitatif sonuçlar sağlamak için yukarıdaki protokoller için alınmalıdır. İlk olarak, tau ve p-tau kendiliğinden özellikle yüksek bir konsantrasyonda, zaman içinde amiloid agregatlar oluştururlar. Bu protein preps tüm hacimde dondurma ve deneyler önce sadece gerekli hacmi çözülme böylece zorunludur. Buna rağmen, ThT 47 ile tespit granül ara-maddeler bulunan bir agrega, yeniden birleştirici proteinlerin hazırlanması sırasında meydana gelmiş olabilir. Tipik bir kümelenme reaksiyonu önemli bir başlangıç floresans okuma böylece yaygındır. Bununla birlikte, bir ön sıkma aşamasına eklenmesi ve daha görünür bir proteini pelet olmaksızın, ayrı bir tüpe yüzer aktarma azaltmak ve tau ve p-tau hazırlık aynı parti, tutarlı, başlangıç floresans koruyabilir. İkinci olarak, ThT çalışma stok çözeltisi (yani, 60 uM) th önce en az bir hafta boyunca oda sıcaklığında stabil olanE floresan azaltır. Bu nedenle 60 uM ThT her birkaç gün yeniden yapmak için tavsiye edilir.
P-tau toplama çalışmaları yatan biri önemli nedeni roman AD teşhis ve tedavide geliştirilmesidir. Biraraya getiren tau agregasyonunu inhibe eden ya da geri döndüren bileşikler, yüksek verimli taramalar ve hedeflenen testler 18,40,41,48 den tanımlanmıştır. F-tau agregasyonu için, bu bileşiklerin etkinliği incelenmesi gereken konu olarak kalmaktadır. Bu ekranlar farklı bileşiklerin bireysel multiplate çukurlara boya olmadan ortak bir agregasyon karışım tevzi terminal modunda gerçekleştirilmiştir. Tipik olarak O / N inkübasyondan sonra ThT veya ths pek çok bileşiğin engelleyici gücünü ortaya floresan ölçmek için ilave edilir. ile-boya yaklaşımı yukarıda Rankin ark sözü. 49 henüz yüksek verimli ekranlara dahil olmak üzere. Şimdi eşleştirilmiş kinetik ve ilaç çalışmaları için kullanılabilir hiperfosforilize tau ilesarmal Filament oluşumu, Alzheimer hastalığı ilaç keşfi uzak ilerlemek için muhtemeldir.
Son olarak, p-tau toplanmasının çalışma sadece tauopatıler kritik öneme sahiptir, ama aynı zamanda daha geniş bir nüfus etkileyebilir fazlalaştı. Örneğin, nörofibrillerin gibi profesyonel Amerikan futbolu oyuncuları ve boksörler 50-52 gibi kronik travmatik ensefalopati, bazı hastalarda saptanabilir dair raporlar var. Benzer bir ilişki de askerler 53 olmak üzere tek veya tekrarlayan travmatik beyin yaralanmalı hastalarda rapor edilmiştir. Bu çalışmada tarif edilen protokoller, böylece nöronal hücrelerde, p-tau toplulukları yönelik yeni terapötik maddelerin keşfi ve gelişmesine yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaCl | Macron Fine Chemicals | MAL-7581-06 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15576-028 | |
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | Stored in dark |
| Thioflavin S | Sigma | T1892 | Stored in dark |
| heparin | Sigma | H3393 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | Stored at 4 °C |
| 96-well plate | Corning | 3917 | |
| ISA SPEX FluoroMax-2 | Horiba | ||
| SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader | Molecular Devices | ||
| Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody | R&D Systems | MAB3494 | Stored at –80 °C |
References
- Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q.
- Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 (2007).
- Arriagada, P. V., Marzloff, K., Hyman, B. T. Distribution of Alzheimer-type pathologic changes in nondemented elderly individuals matches the pattern in Alzheimer's disease. Neurology. 42 (9), 1681-1688 (1992).
- Arriagada, P. V., Growdon, J. H., Hedley-Whyte, E. T., Hyman, B. T. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer's disease. Neurology. 42 (3 Pt 1), 631-639 (1992).
- Bancher, C., Braak, H., Fischer, P., Jellinger, K. A. Neuropathological staging of Alzheimer lesions and intellectual status in Alzheimer's and Parkinson's disease patients. Neurosci Lett. 162 (1-2), 179-182 (1993).
- Guillozet, A. L., Weintraub, S., Mash, D. C., Mesulam, M. M. Neurofibrillary tangles, amyloid, and memory in aging and mild cognitive impairment. Arch Neurol. 60 (5), 729-736 (2003).
- Hasegawa, M., et al. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J Biol Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Matsuo, E. S., et al. Biopsy-derived adult human brain tau is phosphorylated at many of the same sites as Alzheimer's disease paired helical filament tau. Neuron. 13 (4), 989-1002 (1994).
- Bamburg, J. R., Bloom, G. S.
- Denk, F., Wade-Martins, R. Knock-out and transgenic mouse models of tauopathies. Neurobiol Aging. 30 (1), 1-13 (2009).
- Gong, C. X., Iqbal, K. Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau: a promising therapeutic target for Alzheimer disease. Curr Med Chem. 15 (23), 2321-2328 (2008).
- Mazanetz, M. P., Fischer, P. M. Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 464-479 (2007).
- Brunden, K. R., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer's disease and related tauopathies. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 783-793 (2009).
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M.
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33 (1), 95-130 (2000).
- Lee, V. M., Brunden, K. R., Hutton, M., Trojanowski, J. Q. Developing therapeutic approaches to tau, selected kinases, and related neuronal protein targets. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006437 (2011).
- Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Biochemistry and cell biology of tau protein in neurofibrillary degeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006247 (2012).
- Bulic, B., Pickhardt, M., Mandelkow, E. Progress and Developments in Tau Aggregation Inhibitors for Alzheimer Disease. J Med Chem. 56 (11), 4135-4155 (2013).
- Cowan, C. M., Quraishe, S., Mudher, A. What is the pathological significance of tau oligomers. Biochem Soc Trans. 40 (4), 693-697 (2012).
- Spires-Jones, T. L., Kopeikina, K. J., Koffie, R. M., de Calignon, A., Hyman, B. T. Are tangles as toxic as they look. J Mol Neurosci. 45 (3), 438-444 (2011).
- SantaCruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293 (5530), 711-714 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B.
- Wille, H., Drewes, G., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro. J Cell Biol. 118 (3), 573-584 (1992).
- Alonso, A., Zaidi, T., Novak, M., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6923-6928 (2001).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Polymerization of microtubule-associated protein tau under near-physiological conditions. J Biol Chem. 270 (41), 24306-24314 (1995).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 150 (6), 2181-2195 (1997).
- Perez, M., Valpuesta, J. M., Medina, M., Montejo de Garcini, E., Avila, J. Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction. J Neurochem. 67 (3), 1183-1190 (1996).
- Carlson, S. W., et al. A complex mechanism for inducer mediated tau polymerization. Biochemistry. 46 (30), 8838-8849 (2007).
- Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
- King, M. E., Gamblin, T. C., Kuret, J., Binder, L. I. Differential assembly of human tau isoforms in the presence of arachidonic acid. J Neurochem. 74 (4), 1749-1757 (2000).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pseudo-phosphorylation of tau at Ser202 and Thr205 affects tau filament formation. Brain Res Mol Brain Res. 138 (1), 84-93 (2005).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pre-assembled tau filaments phosphorylated by GSK-3b form large tangle-like structures. Neurobiol Dis. 31 (3), 368-377 (2008).
- Grundke-Iqbal, I., et al. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Castellani, R. J., Perry, G. Pathogenesis and disease-modifying therapy in Alzheimer's disease: the flat line of progress. Arch Med Res. 43 (8), 694-698 (2012).
- Green, R. C., et al. Effect of tarenflurbil on cognitive decline and activities of daily living in patients with mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA. 302 (23), 2557-2564 (2009).
- Gauthier, S., et al. Effect of tramiprosate in patients with mild-to-moderate Alzheimer's disease: exploratory analyses of the MRI sub-group of the Alphase study. J Nutr Health Aging. 13 (6), 550-557 (2009).
- Pickhardt, M., et al. Anthraquinones inhibit tau aggregation and dissolve Alzheimer's paired helical filaments in vitro and in cells. J Biol Chem. 280 (5), 3628-3635 (2005).
- Crowe, A., Ballatore, C., Hyde, E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. High throughput screening for small molecule inhibitors of heparin-induced tau fibril formation. Biochem Biophys Res Commun. 358 (1), 1-6 (2007).
- Taniguchi, S., et al. Inhibition of heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J Biol Chem. 280 (9), 7614-7623 (2005).
- Sigurdsson, E. M. Tau-focused immunotherapy for Alzheimer's disease and related tauopathies. Curr Alzheimer Res. 6 (5), 446-450 (2009).
- Tan, Y. J., et al. Phosphopeptide Enrichment with TiO-Modified Membranes and Investigation of Tau Protein Phosphorylation. Anal Chem. 85 (12), 5699-5706 (2013).
- Santa-Maria, I., Perez, M., Hernandez, F., Avila, J., Moreno, F. J. Characteristics of the binding of thioflavin S to tau paired helical filaments. J Alzheimers Dis. 9 (3), 279-285 (2006).
- Lira-De Leon, K. I., et al. Molecular mechanism of tau aggregation induced by anionic and cationic dyes. J Alzheimers Dis. 35 (2), 319-334 (2013).
- DiNitto, J. P., Wang, L., Wu, J. C. Continuous fluorescence-based method for assessing dicer cleavage efficiency reveals 3' overhang nucleotide preference. BioTechniques. 48, 303-311 (2010).
- Maeda, S., et al. Granular tau oligomers as intermediates of tau filaments. Biochemistry. 46 (12), 3856-3861 (2007).
- Pickhardt, M., et al. Phenylthiazolyl-hydrazide and its derivatives are potent inhibitors of tau aggregation and toxicity in vitro and in cells. Biochemistry. 46 (35), 10016-10023 (2007).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology. Mol Neurodegener. 2, 12 (2007).
- McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
- Herrup, K. Reimagining Alzheimer's disease--an age-based hypothesis. J Neurosci. 30 (50), 16755-16762 (2010).
- Gavett, B. E., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: a potential late effect of sport-related concussive and subconcussive head trauma. Clin Sports Med. 30 (1), 179-188 (2011).
- Tsitsopoulos, P. P., Marklund, N. Amyloid-beta Peptides and Tau Protein as Biomarkers in Cerebrospinal and Interstitial Fluid Following Traumatic Brain Injury: A Review of Experimental and Clinical Studies. Front Neurol. 4, 79 (2013).
