इन विट्रो एकत्रीकरण assays में Hyperphosphorylated ताउ प्रोटीन का उपयोग
Summary
असंशोधित और hyperphosphorylated ताऊ प्रोटीन hyperphosphorylation निर्भर तेजी एकत्रीकरण कैनेटीक्स प्रकट करने के लिए दो में इन विट्रो एकत्रीकरण assays में इस्तेमाल किया गया। ये assays अल्जाइमर रोग की प्रगति को आबाद कि तंतुओं के लिए फार्म hyperphosphorylated ताऊ की प्रवृत्ति न्यूनाधिक कर सकते हैं कि यौगिकों के लिए भविष्य स्क्रीन के लिए मार्ग प्रशस्त हुआ।
Abstract
Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.
Introduction
(ई) अल्जाइमर रोग tauopathies रूप में जाना जाता neurodegenerative विकारों का एक बड़ा संग्रह में से एक है। सर्वोत्कृष्ट विकृति अंतर्निहित tauopathy न्यूरॉन्स, astrocytes और microglia 1-4 में neurofibrillary tangles है, NFTs है। NFT घनत्व संज्ञानात्मक हानि 3,5 और न्यूरॉन हानि 6 के साथ संबद्ध करता है। NFT सीधे या बनती पेचदार तंतु (PHF) 7,8 कि रूपों (आगे से 'पी-ताऊ "के रूप में करने के लिए कहा गया है) मुख्य रूप से hyperphosphorylated ताऊ प्रोटीन होता है। ताउ न्यूरोनल संकेतन और तस्करी 9,10 के लिए आवश्यक है कि axonal परिवहन की सुविधा के लिए सोचा था कि एक सूक्ष्मनलिका जुड़े प्रोटीन होता है। प्रत्येक ताऊ अणु 2 से 3 सामान्य मस्तिष्क में फॉस्फेट, लेकिन tauopathy रोगियों 11 में कई परतों से phosphoryl सामग्री बढ़ गये हैं। एकाधिक kinases GSK3β (ग्लाइकोजन सिन्थेज़ काइनेज 3β) और CDK5 (cyclin-डे सहित ताऊ hyperphosphorylation के लिए योगदान करने की संभावना हैलटकता हुआ काइनेज 5) 12,13, लेकिन रोग फास्फारिलीकरण के लिए प्रत्यक्ष ट्रिगर मायावी 14 बनी हुई है। में या सूक्ष्मनलिका बाध्यकारी रूपांकनों के पास असामान्य फास्फारिलीकरण सूक्ष्मनलिका 15 से ताऊ विघटित, और पी-ताऊ अंततः NFT समावेशन में भाजन कर सकते हैं कि सीधे या बनती पेचदार तंतु में oligomerizes जहां somatodendritic डिब्बे, को ताऊ गलत स्थानीयकरण का कारण बनता है। ताऊ hyperphosphorylation, NFT गठन, और neurodegeneration के बीच करीब टाई पी-ताऊ tangles के apoptotic और अन्य साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना है, और इस प्रकार tauopathy neurodegeneration 16,17 के लिए अंतर्निहित कारण है कि एक प्रचलित परिकल्पना का नेतृत्व किया। इस आधार पर आधारित दवा स्क्रीन और जल्दी नैदानिक परीक्षण 18 शुरू किया गया है। हालांकि, इस परिकल्पना चुनौतियों 19,20 चेहरे। उदाहरण के लिए, सांताक्रूज एट अल। ट्रांसजेनिक चूहों की संज्ञानात्मक कार्यों एक उत्परिवर्ती की अभिव्यक्ति को दबा द्वारा सुधार किया जा सकता है कि पता चलाNFTs मौजूदा ताऊ अणुओं 21 से फार्म जारी रखा, भले ही मानव ताऊ,। एक ड्रोसोफिला मॉडल में, NFT अंतर्निहित न्यूरॉन कोशिकाओं 22,23 की रक्षा के लिए विषाक्त साइटोसोलिक ताऊ पृथक करने के लिए दिखाया गया था। जाहिर है, NFT के रोगजनन भूमिका, यदि कोई हो, बहुत tauopathy चिकित्सा विज्ञान के विकास की दिशा को प्रभावित करेगा।
कई β पत्र वरीय फ्लोरोसेंट रंजक, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और रोशनी बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी 24-27 के बंधन से संकेत के रूप में उच्च सांद्रता, पुनः संयोजक या सामान्य मस्तिष्क ताऊ प्रोटीन में अनायास लेकिन धीरे-धीरे, इन विट्रो में एक PHF जैसी संरचना में polymerizes। जोड़ना हेपरिन या arachidonic एसिड, मानव मस्तिष्क में एक प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड, काफी ताऊ isoform- और inducer के एकाग्रता पर निर्भर शिष्टाचार 28-32 में PHF गठन accelerates। दिलचस्प, hyperphosphorylated ताऊ ई दिमाग से शुद्ध या एक विट्रो फास्फारिलीकरण प्रतिक्रियाओं में संपूर्ण द्वारा तैयारतेजी से ggregates और अधिक कुशलता से 26,33-35। इन परिणामों के पी-ताऊ के रोग भूमिकाओं के साथ उत्कृष्ट समझौते में हैं। पी-ताऊ के एकत्रीकरण के आधार पर इन विट्रो प्रणाली इस प्रकार ईस्वी दवा स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है।
ताऊ एकत्रीकरण और विज्ञापन की प्रगतिशील neurodegeneration के बीच निकट सहयोग है, साथ ही Aβ पट्टिका को लक्षित दवा के विकास में हाल ही में विफलता, ई 36-38 की एक और महत्वपूर्ण ऊतकीय मार्कर, ताऊ एकत्रीकरण बढ़ रहा है कि नियंत्रण दवाओं की खोज में रुचि को देखते हुए। दरअसल, कई समूहों को पहले से ही प्राथमिक परख के रूप में इन विट्रो ताऊ एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं में उपयोग करते हुए, विभिन्न throughput में दवा स्क्रीन शुरू कर दिया है। रसायनों के एक नंबर के लिए इन विट्रो 39-42 में ताऊ एकत्रीकरण पर निरोधात्मक या उलट गतिविधियों प्रदर्शन करने के लिए पाए गए। हालांकि, सभी मौजूदा ताऊ एकत्रीकरण नियामक स्क्रीन भास्वर के प्रमुख रोग निशान याद करते हैं कि असंशोधित ताऊ का उपयोगylation, ई उपचार में इन यौगिकों का उपयोग करने की विशिष्टता और प्रभावकारिता के लिए एक चिंता का विषय बढ़ गई है।
जैव रासायनिक लक्षण वर्णन और ई दवा स्क्रीनिंग के लिए एकत्रीकरण assays के विकसित होने का प्रमुख बाधाओं में से एक pathophysiologically प्रासंगिक hyperphosphorylated ताऊ प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा का उत्पादन होता है। ताऊ की 1N4R isoform और जीएसके-3β काइनेज ई में व्यक्त सह रहे हैं, जिसमें जिपर-असिस्टेड कटैलिसीस प्रणाली का प्रयोग कोलाई leucine जिपर संलयन प्रोटीन के रूप में, हम इस चुनौती को दूर किया है। (सुई एट अल, प्रस्तुत, ताऊ और पी-ताऊ के अंतिम उत्पादों के लिए चित्रा 1 देखें, यह भी पी-ताऊ की प्रारंभिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री लक्षण वर्णन के लिए 43 देखें)। ताऊ के विभिन्न फास्फारिलीकरण साइटों के लिए विशिष्ट नौ एंटीबॉडी के एक पैनल से, सकारात्मक संकेतों के आठ पदों में देखा गया था (डेटा) नहीं दिखाया। नीचे, हम एकत्रीकरण गतिज डी अंतर कर सकते हैं कि प्रोटोकॉल और इंस्ट्रुमेन्टेशन्स का वर्णनअसंशोधित ताऊ और पी-ताऊ प्रजातियों के बीच ifferences। ये assays एमीलोयड (ताऊ समुच्चय) पर thioflavin टी (tht) या thioflavin एस (THS) के प्रतिदीप्ति की वृद्धि 26 से बाध्यकारी मापा कि प्रकाशित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है। पहली "टर्मिनल" में, कोई डाई दृष्टिकोण, एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं इकट्ठा कर रहे हैं और एमीलोयड डाई के अभाव में incubated। अलग समय बिंदुओं पर, प्रत्येक प्रतिक्रिया का एक विभाज्य निकाल दिया जाता है और ताऊ समुच्चय बाध्य करने के लिए tht एकत्रीकरण रोकने के लिए और अनुमति देने के लिए tht युक्त बफर के बराबर मात्रा के साथ मिलाया। प्रतिदीप्ति एक आईएपी FluoroMax-2 fluorometer से मापा जाता है। "साथ-डाई" दूसरी में लगातार निगरानी परख, tht या ths एकत्रीकरण प्रतिक्रियाओं में शामिल है। प्रतिदीप्ति मैन्युअल रूप से पूरे प्रयोग के दौरान लगातार मापा या एक बहु-प्लेट रीडर का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, हम नित्य माप मो में एकत्रीकरण के लिए ताऊ और पी-ताऊ के पास शारीरिक एकाग्रता का उपयोग करता है कि एक परख का वर्णनडी। फास्फारिलीकरण के प्रभाव को आसानी से detectable बनी हुई है। नीचे, हम कदम-दर-कदम आपरेशन प्रक्रियाओं का वर्णन है, और इन assays के प्रतिनिधि परिणाम दिखाई देंगे। प्रत्येक दृष्टिकोण के पेशेवरों और विपक्ष में से कुछ की चर्चा है, साथ ही संभावित दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों का पालन करेंगे।
एक उच्च एकाग्रता में, ताऊ अनायास एमीलोयड संरचनाओं की तरह में समुच्चय। हालांकि, प्रयोगशाला में, ताऊ fibrillization आम तौर पर इस तरह के inducers के रूप में हेपरिन (औसत आणविक वजन, 6000 ग्राम / मोल) और arachidonic एसिड द्वारा त्वरित है। इस के साथ साथ दिखाया उदाहरण 30 माइक्रोन हेपरिन शामिल हैं। ताऊ एमीलोयड समुच्चय के गठन thioflavin टी (tht) द्वारा या एस (THS) thioflavin बाध्यकारी एमीलोयड से उत्पन्न प्रतिदीप्ति द्वारा नजर रखी है। (:;: 485 एनएम पीक उत्सर्जन 450 एनएम उत्तेजना) ताऊ समुच्चय के लिए बाध्य करने पर, tht प्रतिदीप्ति में एक लाल रंग की पारी दर्शाती है। Ths, दूसरे हाथ पर, एमीलोयड बाध्यकारी से पहले 510 एनएम (450 एनएम पर उत्तेजना) में कमजोर उत्सर्जन है, लेकिन इस fluorescencऐसे एकत्रित ताऊ 44 के रूप में काफी एक amyloid प्रोटीन की उपस्थिति में ई बढ़ जाती है। दोनों रंगों ताऊ और पी-ताऊ एकत्रीकरण का पता लगाने में अच्छी तरह से काम करते हैं। क्योंकि tht (देखें चित्र 2) के मजबूत और अपेक्षाकृत व्यापक उत्सर्जन चोटी के, 510 एनएम पर प्रतिदीप्ति इकाई में केवल 30% की कमी नहीं है। या तो डाई का उपयोग करते समय सुविधा के लिए, हम ताऊ एकत्रीकरण नजर रखने के लिए / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य (यानी, 450 एनएम / 510 एनएम) की एक ही संयोजन का उपयोग करें।
ताउ एकत्रीकरण परख के उद्देश्य और ताऊ प्रोटीन की उपलब्धता पर निर्भर करता है, डाई की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया जा सकता है। प्रतिक्रियाओं के दोनों मोड नीचे दिखाई जाती हैं। एक एकल नमूना fluorometer (ईसा-SPEX FluoroMax-2) और एक बहु-प्लेट रीडर (SpectraMax M2) – इसके अलावा, हम दो विभिन्न उपकरणों के संचालन प्रदर्शित करता है। पाठकों को उनकी विशिष्ट जरूरतों और साधन की उपलब्धता के अनुरूप करने के लिए इन प्रोटोकॉल अनुकूलित करने में सक्षम होना चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल अलग परख की स्थिति और फास्फारिलीकरण निर्भर तेजी ताऊ एकत्रीकरण कैनेटीक्स कि पता लगाने के साधन को दर्शाता है। टर्मिनल परख में, प्रतिदीप्ति डाई tht हर समय बिंदु पर मास्टर मिश्रण से हटा प्रतिक्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaCl | Macron Fine Chemicals | MAL-7581-06 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15576-028 | |
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | Stored in dark |
| Thioflavin S | Sigma | T1892 | Stored in dark |
| heparin | Sigma | H3393 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | Stored at 4°C |
| 96-well plate | Corning | 3917 | |
| ISA SPEX FluoroMax-2 | Horiba | ||
| SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader | Molecular Devices | ||
| Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody | R&D Systems | MAB3494 | Stored at –80° |
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