En mus Model for Patogen-induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder

Summary

Dyremodeller har vist sig at være uvurderlige værktøjer i fastlæggelsen vært og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til udviklingen af ​​kronisk inflammation. Her beskriver vi en musemodel af oral infektion med det humane patogen Porphyromonas gingivalis og detaljeret metoder til at vurdere progressionen af inflammation på lokale og systemiske steder.

Abstract

Kronisk inflammation er en vigtig drivkraft for patologisk vævsskade og en samlende karakteristisk for mange kroniske sygdomme hos mennesker, herunder neoplastisk, autoimmun, og kroniske inflammatoriske sygdomme. Nye beviser implicerer patogen-induceret kronisk inflammation i udviklingen og progressionen af ​​kroniske sygdomme med en bred vifte af kliniske manifestationer. På grund af den komplekse og multifaktoriel ætiologi kronisk sygdom, designe eksperimenter om bevis for kausalitet og etablering af mekanistiske forbindelser er næsten umuligt i mennesker. En fordel ved anvendelse af dyremodeller, er, at både genetiske og miljømæssige faktorer, der kan påvirke forløbet af en bestemt sygdom kan kontrolleres. Således designe relevante dyremodeller for infektion er et afgørende skridt i at identificere vært og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til kronisk inflammation.

Her beskriver vi en musemodel af patogen-induceret kronisk inflationmmation på lokale og systemiske steder efter infektion med den mundtlige patogen Porphyromonas gingivalis, en bakterie tæt forbundet med human paradentose. Mundtlig infektion af specifik patogen fri mus inducerer en lokal inflammatorisk reaktion resulterer i ødelæggelse af tand støtte alveoleknoglen, et adelsmærke for paradentose. I en etableret musemodel af åreforkalkning, infektion med P. gingivalis accelererer inflammatorisk plak deponering inden aortabihulen og innominate arterie ledsaget af aktivering af det vaskulære endotel, en øget immunrespons celleinfiltrat, og forhøjet ekspression af inflammatoriske mediatorer inden for læsioner. Vi detalje metoder til vurdering af inflammation på lokale og systemiske websteder. Anvendelse af transgene mus og definerede bakterielle mutanter gør denne model særligt velegnet til at identificere både vært og mikrobielle faktorer involveret i initiering, progression, og resultatet af sygdom. Additionally, kan modellen anvendes til at screene for nye terapeutiske strategier, herunder vaccination og farmakologisk intervention.

Introduction

Kronisk inflammation er en vigtig drivkraft for patologisk vævsskade og en samlende karakteristisk for mange kroniske sygdomme hos mennesker. Disse sygdomme inkluderer neoplastiske, autoimmune og kroniske inflammatoriske sygdomme ^1. Ætiologien af ​​mange kroniske sygdomme er stadig uklar, men opfattes som at være kompleks og multifaktoriel, der involverer både genetisk disposition og indførelse af miljømæssige faktorer. Mens perpetuators for inflammation forblive undvigende, de cellulære og molekylære profiler af immunaktivering overlapper betydeligt med disse mønstre observeret i værtens svar på patogener ^2.

Montering dokumentation implicerer infektion med mikrobielle patogener i udviklingen og progressionen af kronisk inflammation og dets forskellige kliniske manifestationer ^2,3. Patogener kan fremkalde og fastholde kronisk betændelse direkte ved at undergrave værtens immunsystem og persistente infektioner 3. Således er en detaljeret forståelse af de mekanismer, som specifikke patogener inducerer kronisk betændelse kan få store konsekvenser for den offentlige sundhed, samt behandling og forebyggelse af mange kroniske sygdomme.

Selvom værten og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til induktion og vedligeholdelse af kronisk inflammation erdårligt forstået, fremskridt inden for modellering af patogen-induceret kronisk inflammation er begyndt at fremme vores forståelse af disse processer. P. gingivalis oral infektion model er en unik, velkarakteriseret musemodel af patogen-induceret kronisk betændelse, der tillader analyse af vært og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til kronisk inflammation på lokalt (oral knogletab) og systemiske steder (åreforkalkning) ^5,6.

P. gingivalis er en Gram-negativ, anaerob oral patogen impliceret i humane periodontal sygdom, en infektion drevet kronisk inflammatorisk sygdom karakteriseret ved ødelæggelse af tand støtte væv ^7. Ud over patologi i den indledende infektionsstedet, akkumulering dokumentation implicerer P. gingivalis -induceret kronisk betændelse i udviklingen og progressionen af systemiske sygdomme, herunder åreforkalkning ^5, en sygdom karakteriseret ved kronisk inflammation af arterielle karvæg. Oral infektion af specifik patogenfri mus med P. gingivalis inducerer en lokal inflammatorisk reaktion, der resulterer i ødelæggelse af tand støtte alveoleknoglen ^8. s gingivalis kan udvindes fra munden af inficerede mus op til 42 dage efter infektion ⁸ og mus udvikle høje niveauer af patogen-specifik serumantistoftitere ^9. I en etableret musemodel af atherosklerose ved anvendelse af apolipoprotein-E ^{- / -} mus (ApoE ^{- / -),} oral infektion med P. gingivalis inducerer kronisk inflammation, der driver inflammatorisk plak deponering inden aortabihulen ¹⁰ og innominate arterie ^11. Progressiv betændelse i innominate arterie af P. gingivalis inficerede mus kan overvåges i levende dyr ved hjælp af in vivo MRI. Histologisk arterielæsioner fra P. gingivalis inficerede mus udviser øget akkumulering af lipider accompasaget ved aktivering af det vaskulære endotel, en øget immunrespons celleinfiltrat, og forhøjet ekspression af inflammatoriske mediatorer ^12. Anvendelse af denne model i knockout-mus har belyst rollen af værten signalsystemer komponenter og inflammatoriske mediatorer, samt celle specifikke interaktioner, der driver s gingivalis induceret immunpatologi ^{12 - 14.} Desuden har forsøg anvender definerede bakterielle mutanter identificeret kritiske P. gingivalis virulensfaktorer bidrager til kronisk inflammation på lokale og systemiske steder ^15.

Denne artikel beskriver metoder til vurdering af P. gingivalis -induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder. Vi giver en detaljeret protokol for analyse af alveoleknogletab ved microCT hjælp Amira software. Desuden definerer vi nytten af serielle in vivo levende dyr MR til vurdering af progressivinflammation i innominate arterie. Vi inkluderer metoder til visualisering og kvantificering af inflammatorisk plak i arterielæsioner, og beskrive deres histologisk karakterisering. Anvendelse af transgene mus og definerede bakterielle mutanter gør denne model særligt velegnet til at identificere både vært og mikrobielle faktorer involveret i initiering, progression, og resultatet af sygdom. Derudover kan modellen anvendes til at screene for nye terapeutiske strategier, herunder vaccination og farmakologisk intervention.

Protocol

1. Vækst og Dyrkning af bakterier

1. Streak frosne lagre af P. gingivalis 381 på anaerobe blodagarplader og inkuberes i 3 - 5 dage i et anaerobt kammer (10% _H2 / 10% CO _{2/80% N2)} ved 37 ° C.
2. Brug plade-dyrket organismer at inokulere 5 ml flydende kulturer af hjerne-hjerte-infusionsvæske (BHI) suppleret med gærekstrakt (0,5%), hemin (10 ug / ml) og menadion (1 ug / ml). Efter O / N-vækst, overføre 5 ml kulturer i 45 ml BHI.
3. Inkubér 50 ml flydende kulturer anaerobt i en additional18 - 24 timer og høst på midten til slutningen af ​​log-fase. BEMÆRK Renhed af kulturen bør altid kontrolleres ved Gram-farvning, før der indføres bakterier i dyr.
4. Harvest bakterierne ved centrifugering ved 7.000 x g i 10 minutter. Aspirer supernatanten og grundigt resuspender bakterielle cellepelleten i 5 ml PBS ved hjælp af en serologisk pipette. Tilføj en ekstra45 ml PBS og centrifugeres ved 7.000 xg i 10 min. Gentag dette trin to gange for i alt tre vaske.
5. Efter den sidste vask, resuspendere cellepelleten i PBS, således at en 1:10 fortynding af kulturen har en optisk densitet på 1,0 ved 660 nm (en _OD660 på 1 svarer til 10 ⁹ CFU / ml). Afvej tilstrækkelig carboxymethylcellulose (middel viskositet) for at opnå en 2% vægt / volumen opløsning (fx 0,1 g per 5 ml kultur). Tilsæt langsomt carboxymethylcellulose til bakteriesuspensionen mens vortexing for at undgå sammenklumpning.

2. Mundtlig Infektion

BEMÆRK: Som illustreret i figur 1, ved hjælp af passende musemodel og mundtlig infektion regime, P. gingivalis inducerer kronisk inflammation og immunpatologi på lokalt (mundhulen) og systemiske steder (arterier).

1. Indgives sulfamethoxazol (0,87 mg / ml) og trimethoprim (0,17 mg / ml) (Sulfatrim) til seks til 8-wk-oLD hanmus ad libitum i deres drikkevand i 2 uger for at reducere den normale flora. Hold antibiotisk opløsning i ravgule glasflasker og beskytte den mod lys for at forhindre nedbrydning.
2. For at undgå bundfældning af det antibiotiske opløsning, ryste flaskerne én eller to gange dagligt (dvs., om morgenen og sent på eftermiddagen). Udskift med en frisk fremstillet opløsning hver 3 - 5 dage.
3. Efter to uger erstatte den antibiotiske opløsning med konventionel drikkevand. Tillad en 2-dages antibiotika hvileperiode forud for mundtlig infektion.
4. Indlæs P. gingivalis / køretøj suspensionen i en 1 ml tuberculinsprøjte med en vedhæftet fodring nål. Manuelt begrænse musen ved at snuppe harmoniske på bagsiden af ​​deres hals. Sørg for, at grebet er fast nok til at begrænse mobiliteten af ​​musen hoved.
5. Infect mus ved topisk anvendelse af P. gingivalis på den bukkale overflade af maxillae. Placer fodring nål sådan THAt er på linje med den bukkale overflade af de rigtige maxillary kindtænder og skubbe 50 ul bakteriesuspension. Disperse opløsningen forsigtigt langs gingiva i 1 minut under anvendelse af bolden af ​​fodring nålen.
6. Lad musen til at hvile i en periode på 30 sekunder til 1 min før gentagelse af fremgangsmåden på venstre overkæben. Kontrolmus modtager antibiotika forbehandling og oral tvangsfodring med vehikel alene (2% carboxymethylcellulose i PBS).
7. For at undersøge patogen-induceret kronisk inflammation på lokale sites inducerede alveolært knogletab ved at inficere mus 3 gange med 2 dages intervaller. Sacrifice mus 6 uger senere til evaluering af knogletab ved microCT.
8. At undersøge patogen-induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske steder, inficere åreforkalkning udsat ApoE ^{- / -} mus 5 gange om ugen i 3 uger.
   BEMÆRK: Progression af sygdom i innominate arterie overvåges ved seriel in vivo MRI. Billede mus på forskellige tidspunkter og ofre 6-16 wks sentr. På tidspunktet for aflivning vurdere globale aterosklerotisk byrde ved en face analyse og bestemme alveoleknogletab af microCT. Karakterisere atherosklerotiske læsioner ved histologi og immunhistokemi.

3. Mikro-computertomografi (microCT)

1. Klargøring
   1. Sacrifice mus på det ønskede tidspunkt efter infektion. Aflive mus ved CO ₂ asphyxation eller ved en anden metode, der er godkendt af institutionens dyr facilitet.
      BEMÆRK: Indsaml blod ved hjertepunktur, separat serum, og opbevares ved -80 ° C til analyse af anti P.gingivalis IgG som beskrevet andetsteds ^9.
   2. Brug en stor par halshugning saks til svær musen hoved ved bunden af ​​skallen. Fjern kødet med en pincet og placere kraniet i en 50 ml konisk rør indeholdende 30 ml 4% buffered paraformaldehyd. Fix prøven for 24-48 timer ved 4 ° C.
   3. Efter fiksering, Rinse prøven grundigt med PBS.
   4. Opret maxillary blok biopsier.
   5. Opbevar hemi-overkæben i histologisk klasse 70% EtOH ved 4 ° C, indtil evalueringen af ​​microCT.
2. Billede Acquisition
   1. Udfør opkøb billede ved hjælp af en desktop microCT scanner. Indstil røntgenkilde til en strøm på 114 microamperemetret og en spænding på 70 kV. Load individuel hemi-maxillae i den billeddannende fartøj og scanne ved beslutning af 12. um i alle tre rumlige dimensioner.
      BEMÆRK: Læg flere hemi-maxillae samtidigt i de billeddannende fartøj.
   2. Udfør en foreløbig lav opløsning scanning, der giver brugeren mulighed for at afgrænse grænserne til billedbehandling erhvervelse og begrænse scanningen til regionen af ​​interesse (ROI) ved hjælp af systemet.
      BEMÆRK: Intensiteten af ​​emalje gør kronen af ​​maxillære kindtænder let at skelne. Brug af kindtænder som en guide løst sæt de billeddannende grænser at omfatte de tre kindtænder og det omgivende alveolær bone. Denne funktion bruges også til at skelne mellem de enkelte hemi-maxillae ved scanning af flere prøver inden for samme fartøj.
   3. Når scanningen er færdig, konvertere de rå billedfiler (.ISQ) ind i høj kvalitet dicoms (.DCM).
3. Image Analysis
   I denne protokol, er billedet analyse udført ved hjælp af en data-visualisering, bearbejdning og analyse software. Først skal du bruge morfologiske vartegn til at oprette en plan bedst egnet til cementoenamel motorvej (CEJ). Brug derefter at omdanne hemi-overkæben i en standard orientering til efterfølgende måling af alveoleknoglen volumen.
   1. Åbn softwaren og klik på "Åbn data" ikonet i øverste venstre hjørne af puljen. Alternativt kan du bruge Filer> Åbn Data.
   2. Vælg DICOM billedstak og klik på Indlæs. DICOM Loader vises. Klik på OK.
   3. Overhold datasæt som en grøn ikon i puljen. Bemærk at klikke på objektet data forårsager ekstra menton, der skal vises i knappen område på toppen af ​​Pool. Vælge ikonet forårsager også nogle oplysninger om den datapost, der skal vises i Properties-området.
   4. Hvert ikon i puljen giver en menu, hvorfra der kan vælges forskellige moduler. Aktiver popup-menuen ved at klikke på den hvide pil i højre hjørne af ikonet data. Under display modul, skal du vælge Isosurface (Display> Isosurface). Den Isosurface Ikon vises i Pool-området. Når det vælges, yderligere indstillinger vises i Properties-området.
   5. Indstil Draw Style til gennemsigtig og Threshold til 2.000. Kontroller, at compactify og downsample knapper er valgt under indstillinger. Under gennemsnit, sikre x er y og z alle indstillet til 2. Klik på Anvend for at generere isosurface.
      BEMÆRK: Overhold en gennemsigtig 3D rekonstruktion af hemi-overkæben i 3D-fremviseren. Fordelen ved at bruge en gennemsigtig draw stil til billedet genopbygning er, at rødderne af kindtænder kankan let identificeres. Det vil være vigtigt, når at sætte prøven i standard orientering.
   6. Vælg ikonet grønne data og Egenskaber området vælge ikonet afgrøde. Overhold et vindue dimensioner og koordinater for dataene. Sæt dette afsat til nu. Bemærk, at en afgrænsningsramme vises i 3D-fremviser med grønne faner i hvert hjørne.
   7. Vælg Interact knappen i fremviseren værktøjslinjen. Ændre størrelsen af ​​afgrænsningsrammen ved at klikke og trække på de grønne hjørner. Kontroller, at feltet omfatter området af interesse (ROI) og fjerner så meget dødt rum og snavs som muligt. Dette vil reducere den beregningsmæssige efterspørgsel på computeren.
   8. Brug trackball knap i fremviseren værktøjslinjen for at rotere objektet i 3D-fremviseren sikre ROI er helt omfattet af afgrænsningsrammen. Når du er tilfreds, skal du klikke på OK i afgrøden vinduet afsat i trin 8.
   9. Vælg ikonet data under displayet modul vælge Oblique Slice (OBS). (Display> OBS)
   10. Vælg OBS. I ejendomme, skal du indstille kortlægning typen til lineær, data vinduet fra -200 til 10.000, og prøvetagning til fineste. Vælg nu roterer under indstillinger. Observere en rotere skift mellem i midten af ​​OBS.
   11. Vælg interact knappen i fremviseren værktøjslinje og brug håndtagene af toggle at justere skærende plan udsnittet. Lav en sagittalplan der løber parallelt med rødderne af tænderne og vinkelret på okklusale overflade af tænderne. Flyet skal gennemskære de tre kindtænder (M1-M3), som illustreret i figur 2.
   12. Sluk rotere og duplikere OBS (objekt> kopierede objekt). En ny OBS vises navnet OBS 2. Tænd rotere på i OBS 2.
   13. Brug rotationshåndtaget at nyorientere OBS 2, således at den er vinkelret med OBS 1 (se figur 2).
   14. Slå rotere off for OBS 2 og skabe 3 dobbelte skiver. Disse vil blive nævne OBS 3, 4 og 5.
4. Picking Point for planet af Best Fit
   BEMÆRK: Trin 3.4.1-3.4.5 beskrive placeringen af ​​8 point langs CEJ skaber en plan bedste pasform. Vælg fire af de punkter fra sagittale skiver og den anden fire fra koronale skiver (se figur 3). Når plukke steder på sagittale skiver i 3.4.6, kan det være nødvendigt at justere OBS 1.
   1. Juster OBS 1 med centrum af den mest mesial rod af M1 i sagittalplanet. Juster OBS 2 med centrum af den mest mesial rod af M1 i den koronale plan.
   2. Juster OBS 3 med centrum af den bucco-distale rod i M1 i koronale plan. Hvis det er nødvendigt, justeres OBS 1, således at det tilnærmelsesvis er centreret med bucco-distale rod i M1 i saggital plan, når du vælger punkter i trin 20.
   3. Juster OBS 4 med forgrening af de buccale rødder i M2. OBS 4 bør være centreret mellem Bucco-mesiale og bucco-distale rødder i M2. Hvis det er nødvendigt, justeres OBS 1, således at det er nogenlunde centreret Vidh bucco-distale rod i M2 i sagittalplanet når du vælger punkter i trin 20
   4. Juster OBS 5, så det kører ned i midten af ​​M3 i koronale plan. Hvis det er nødvendigt, justeres OBS 1, således at det tilnærmelsesvis er centreret med den mest distale rod i M3 i sagittalplanet når du vælger punkter i trin 20.
   5. Duplikere en af ​​de OBSS (OBS 6) og vælg Tilpas til punkter i vinduet med egenskaber. Tilpas til punkter skift mellem tillader forskeren at vælge 3 eller flere punkter på 2D eller 3D-objekter i fremviseren, og beregner derefter en plan bedste pasform. I dette tilfælde er 2D OBSS beskrevet i de foregående trin, bruges til at vælge 8 punkter langs CEJ.
   6. Skjul OBS 6 fra 3D-fremviseren ved at klikke på den orange boks i højre hjørne af ikonet data. Skjul isosurface fra 3D-fremviseren for at gøre CEJ synlig på alle 2D skiver. Skift-klik og vælg de 8 punkter langs CEJ som beskrevet ovenfor.
      BEMÆRK: Hvis Shift-tasten ikke holdes nede, når du vælgerpoint, vil en plan automatisk blive beregnet efter de første tre punkter.
   7. Når du har valgt alle 8 point, gøre OBS 6 synlige. Bemærk at dette er en aksial skive, der kører omtrent parallelt med occlusale flyet.
5. Transformation og Omlægning BEMÆRK: plan passer bedst anvendes til at transformere data til en standard orientering for efterfølgende volumetriske målinger.
   1. Klik på Data-ikonet> Beregn> ApplyTransform. Ikonet ApplyTransform vises i pool-området. Klik på den hvide firkant i hjørnet af ikonet ApplyTransform, vælg henvisning, og klik på OBS 6.
   2. I Egenskaber for LAN, skal du vælge standard for interpolationsmetoden og forlænges for mode. Påfør transformation.
   3. Opret en isosurface og en koronale OBS til den nye datafil. Drej OBS i den aksiale retning, således at den er omtrent vinkelret med M1 (vist i figur 2). Brug Spidser den molære og okklusale curvatures som en vejledning.
   4. Brug denne plan at transformere dataene som i trin 3.5.1 og 3.5.2. Gem den transformerede datafil.
6. Segmentering og Bone bind Måling
   BEMÆRK: Trinene nedenfor beskriver segmentering og måling af alveoleknoglen. Den skive svarer til planet af den bedste pasform til CEJ er identificeret, og et referenceplan vælges. Alveoleknoglen mellem CEJ og referenceplanet på den bukkale side af kindtænder er segmenteret og måles. Den mest mesial roden af ​​M1 og den mest distale rod i M3 tjener som endpoint vartegn. Indstilling referenceplanet 15-20 skiver under CEJ giver optimale resultater. Medtagelse af yderligere skiver introducerer variabilitet, masker forskelle i knogle volumen blandt behandlingsgrupper.
   1. Åbn Segmentering editor og oprette en ny etiket til de transformerede data.
   2. Opret et nyt materiale, og navngive den alveolære knogle.
   3. Under zoom og Data Window, indstille dataområdet from -200 til 10.000.
   4. Under Vis og maskering vælge 2D trådkors 3D MPR, og 3D volumen rendering ikoner. Indstil dataområdet fra 2.500 til 8.000. Aktiver data maskering.
   5. Vælg Four Seerne skærm indstilling fra fremviseren værktøjslinjen. Displayet er opdelt i fire kvadranter, der tillader samtidig behandling af saggital, koronale og aksiale billedstakke, samt afsmeltet 3D volumen.
   6. Brug alle fire kvadranter for at identificere den sidste skive hvor emalje er synlig på buccale ansigter M1 og M3. Denne placering svarer til planet for bedst egnet til CEJ. Optag den aksiale skive nummer.
   7. I det aksiale plan, fortsætter 15-20 skiver mod alveoleknoglen kam. Dette repræsenterer referenceplanet.
   8. Brug en kombination af segmenteringsværktøjer at vælge alveoleknoglen på den bukkale ansigt af kindtænder mellem CEJ og referenceplanet. Brug mest mesial roden af ​​M1 og den mest distale rod i M3 som vartegn endpoint.
   9. Retur til objektet puljen. Et nyt ikon med endelsen ".Labels" bør føjes til ikonet billedet data. Vælg ikonet Etiketter og i drop menuen vælges Materialer> MaterialStatistics.
   10. I ejendomme område, skal du vælge Materiale og ramte anvendelse. En tabel vises vise flere parametre for hvert materiale på listen materialer. Optag mængden af ​​alveoleknogletab.

4. Vurdering af åreforkalkning

1. Aorta dissektion
   1. Sacrifice musen ved _{CO2-kvælning} på det ønskede tidspunkt efter infektion.
   2. Placer musen på den dorsale side, bånd ned og tørre mus med 70% EtOH. Skær huden på den ventrale side fra midten af ​​underlivet til lige over xyphoid proces.
   3. Skær den abdominale hud indtil xyphoid proces er synlig. Løft Xyphoid proces med en lille pair af pincet, foretage nedskæringer på hver side af brystkassen, og skær mellemgulvet. Derefter fyldes to snit ned hver side af brystkassen for at blotlægge hjertet.
   4. Exsanguinate musen under anvendelse af en 27 G insulinsprøjte anbragt i spidsen af ​​den højre ventrikel. Under opsamlingen af ​​blod, rotere regelmæssigt nålen for at forhindre blokering af åbningen af ​​den ventrikulære væg. Typisk 0,8 - kan 1 ml blod opnås ved anvendelse af denne metode.
   5. sup> BEMÆRK: Separat serum og opbevares ved -80 ° C til analyse af anti P.gingivalis IgG som beskrevet andetsteds ⁹
   6. Brug en saks til at fjerne den højre atrium.
   7. Find den venstre ventrikel på den bageste side af hjertet. Indførelse af en 21 G nål ind i toppen af ​​den venstre ventrikel, med den skrå kant af nålen overfor midten af ​​kammeret og skyl langsomt kredsløbssygdomme med 3 - 5 ml væv fiksativ.
   8. Trim fedt og thymus omkring hjertet.
   9. Fjern luNGS.
   10. Find aortabuen med de tre grene og rydde væk omgivende fedt lag for bedre eksponering.
   11. Fortsæt dissektion af aorta fra buen til bunden af ​​membranen.
   12. Fjern leveren og fortrænge tarmvæv at blotlægge aorta descendens. Skær de distale aorta ned til de renale arterie grene.
   13. Skær de renale arterier og fortsætte dissektion ned til ileal bifurkation.
   14. Når aorta er fri for de fleste bindevæv, tilbage til toppen af ​​aorta og snip meget øverste del af de tre grene fra aorta over hjertet.
   15. Peel hjerte opad, snipping underliggende fedtvæv for at separere hjerte fra kroppen.
   16. Hold hjertet med en pincet, og træk opad, opskæring bindevæv, der stadig kan være fastgjort, og fortsætte ned til nyrerne og følge ned til benene og snip på mulige laveste punkt.
   17. Fix aorta i 10% formalin i 1 time med en efgende PBS vask i 1 time. Alternativt butik aorta i 10% formalin O / N-, skylles i PBS den følgende dag og fortsætte med dissektion.
   18. Placer aorta i en 10 cm petriskål indeholdende PBS.
   19. Ved hjælp af en dissekering omfang fjernes forsigtigt adventitiale væv fra aorta.
   20. Når aorta er fri for overskydende fedt og væv, afbrød nederste to tredjedele af hjerte. Start skrælning hjertemusklen væk i slutningen af ​​hjertet modsatte af aortabuen. Pæren af ​​aorta bør langsomt frem, hvilket vil være hvid i farve.
   21. Fortsæt omhyggelig dissektion ved hjælp af to pincet indtil aorta pærer er fri for hjerte muskelvæv.
   22. Placer rengøres aorta ind i en sort dissekere bakke og dække med PBS.
2. Pinning af Aorta
   1. Hold aorta dækket i PBS hele pinning.
   2. Lå aorta i anatomisk position med løg af aorta på venstre.
   3. Placer midlertidige minutien stifter på 5 lokationer starter ved 1) øverst i aorta, 2) under tredjegren af ​​bue, 3) midtvejs af faldende aorta 4) nær nedre ende af faldende aorta 5) over gren af ​​femoral arterie.
   4. Brug af ekstra fine forår saks, skåret op i venstre side af aorta, der starter ved venstre gren af ​​femorale arterie hele vejen op til aorta til under laveste gren af ​​opstigende aorta.
   5. Klip fra venstregående side af laveste aorta pære på sprække og fortsætte snit til at nå skæringspunktet mellem snit lodret snit af aorta.
   6. Går på tværs af aorta vandret for at nå punkt laveste gren af ​​aorta ascendens
   7. Skær opad på højre side til over øverste gren af ​​aorta.
   8. Skær hver gren for at eksponere sin indre overflade.
   9. Fjern noget af midlertidige stifter og erstatte med permanente stifter med mål om pinning ned hele aorta i anatomisk placering uden foldning, udspænding af aorta. Målet er at afsløre indre overflade af aorta.
   10. Fortsæt pinning indtil alle indre overflade af aorta eksponeres og klart synligt oppefra og fri for visuelle interference fra stifter.
3. Lipidfarvningen og Læsion Kvantificering
   1. Forbered Sudan IV farvning opløsning (5 mg / ml i 70% isopropanol). Bland godt og filtreres for at sikre, at ingen krystaller er til stede.
   2. Cover pinned aorta i Sudan IV løsning i 50 min.
   3. Vask med 70% isopropanol i 1 - 5 min. Forsigtigt skylles aorta med ddH20 indtil vandet kommer fra aorta ikke længere er rød.
   4. Dæk aorta med PBS. Tag billeder af aorta med en høj opløsning kamera fastgjort til en dissektionsmikroskop og gem som digitale billedfiler (.TIFF). Placer en lineal ved siden af ​​hvert billede for at hjælpe med kalibrering.
   5. Brug ImageJ software til at bestemme området for intima og areal af læsioner. Manuelt spore intimale overflade til at bestemme området. Læsion område kan beregnes ved hjælp af automatiseret farve tærskling. Dette kræver fastsættelse af en tærskel for at definere en farve intensitet, der diskriminerer læsioner fra normale områder.
   6. Procentdelen afintimale overflade dækket af atherosklerotiske læsioner.

5. histologisk vurdering af atheroskleroselæsioner

1. Harvest aortabuen med hjerte væv og fordybe i OLT en engangs bund skimmel.
2. Saml 5 um serielle kryosnit hver 50 um i aortabihulen og innominate arterie ved hjælp af en kryostat indstillet til -17 ° C, og montere vævssnit på objektglas. Opbevar glider ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
3. Til histologisk vurdering pletten med hematoxylin & eosin ved hjælp af de relevante procedurer.

6. Immunohistokemisk karakterisering af atherosklerotiske læsioner.

Trinene nedenfor skitsere en generel antistof-baseret protokol rutinemæssigt anvendes til at vurdere aterosklerotiske læsioner i P. gingivalis inficerede mus. Denne protokol kræver optimering for hvert antistof eller reagens.

1. Fjern dias fra fryseren og fastsættei 2 min i iskold fikseringsvæske (acetone eller andet fikseringsmiddel).
2. Lad objektglassene til at komme til RT og mærke med et opløsningsmiddel resistent pen.
3. Skyl objektglassene 3x i PBS for at fjerne vævet indefrysning matrix
4. Bloker endogen peroxidaseaktivitet ved at inkubere objektglassene i 0,3% _{H2O 2-opløsning} i PBS i 10 min.
5. Skyl objektglassene 3x i PBS i 2 minutter hver gang.
6. Bloker ikke-specifik binding ved inkubation i blokeringsbuffer (10% kanin serum i PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur.
7. Fortynd det primære antistof 1:50 i 10% kaninserum.
8. Påfør den fortyndede antistof til vævssektioner på slæden.
9. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
10. Skyl objektglassene 3x i PBS i 2 minutter hver.
11. Fortyndet anti-rotte biotinyleret sekundært antistof 1: 100 i 10% kaninserum.
12. Anvend på vævssnit på slæden og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
13. Skyl objektglassene 3x i PBS i 2 minutter hver.
14. Forbered DAB-substrat ved tilsætning1 dråbe af DAB-kromogen til hver 1 ml DAB-puffer.
15. Drain PBS fra dias og anvende DAB substrat løsning. Tillad dias at inkubere i 5 minutter, eller indtil den ønskede farve intensitet er nået.
16. Wash 3x i vand i 2 minutter hver.
17. Tæller pletten med hæmatoxylin.
18. Dehydrere gennem 4 ændringer af alkohol (95% 1 min, 95% 1 min, 100% 1 min og 100% 5 min).
19. Klart i 3 skift af xylen.
20. Dækglasset hjælp monteringsløsning og analysere kvalitativt ved mikroskopi. Til kvantitativ analyse erhverve billeder og beregne farvning med ImageJ anvendelse af en automatiseret tærskel.

7. MR

1. Animal Forberedelse til MR
   1. Bedøve musene før MRI eksperimenter. Udfør den indledende induktion af anæstesi ved anvendelse af 4% fordampet isofluoran i 2-3 minutter i en induktion kammer. Opretholde anæstesi under den billeddannende periode ved hjælp af en kontinuerlig strøm af 0,5-2% fordampet isofluoran delivered gennem en næse kegle opsætning eller maske.
   2. Efter at have nået den kirurgiske plan anæstesi (dvs. ingen tå knivspids respons), skal du placere musen i et dyr holder med sin næse indsættes i en næse kegle. Der er flere typer af kommercielt tilgængelige dyr holdere, der kan anvendes til at minimere den potentielle bevægelse under billedbehandling. Vi bruger en specialdesignet holder med en bid bar.
   3. Overvåg åndedræt og hjertefunktion cyklus og synkronisere med billedet opkøbet med et åndedræt pude (placeret på musens mave) der er udstyret med et lille dyr overvågning og gating system.
   4. Fastgør mus og overvågningssystem på dyret holder med laboratorie film.
2. Erhvervelse MRI data
   1. Placer dyret holder med musens hovedet først i liggende stilling i et 30 mm lodret sonde (Micro 2.5) holdes på 23 ° C og ind i lodret boring 11,7 T MR scanner.
   2. Juster holderen med centrum af than RF-spolen.
   3. Gennemføre en afstandsstykker proces ved hjælp af en enkelt puls sekvens.
   4. Ved hjælp af en RARE sekvens erhverve scout billeder langs tre ortogonale retninger for at skabe aksiale, koronale og sagittale billeder.
   5. Udfør en lav opløsning magnetisk resonans angiografi (MRA) ved hjælp af en ungated 3D gradient ekko sekvens med følgende parametre: Dæktykkelsen = 1,5 cm; flipvinkel = 45 °; gentagelse tid = 20 ms; ekkotid = 2.2 ms; synsfelt = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matrix = 64 × 64 × 64; antal gennemsnit = 1. Samlet scanning tid: 2~3 min. Formålet med denne scanning er at sikre, at billederne erhverves på målområdet (den innominate arterie).
   6. Udfør en høj opløsning MRA af innominate arterie med en ungated 3D gradient ekko sekvens under anvendelse af følgende parametre: Dæktykkelsen = 1,5 cm; flipvinkel = 45 °; gentagelse tid = 20 ms; ekkotid = 2.2 ms; synsfelt = 1,5 × 1,5 × 1,5 cm; matrix = 128 &# 215; 128 × 128; antal gennemsnit = 4. Samlet scanning tid var -25 min.
   7. Opnå kontinuerlig aksiale billeder af innominate arterie 0.5mm under subclavia bifurkation.
3. MR dataanalyse
   1. Udfør billede rekonstruktion og analyse ved hjælp imaging software i forbindelse med scanneren. Opnå 3D rekonstruktion af MRA billeder ved maksimal intensitet Projection.
   2. Brug subclavia tvedeling som en anatomisk markør for at tilpasse data indhentet fra forskellige mus eller den samme mus på forskellige tidspunkter. Vælg målet tværsnit innominate pulsåre ved 0,3- til 0,5 mm afstand under subclavianbifurcation.
   3. Definere og beregne luminale område for det valgte tværsnit med ImageJ. Målinger skal udføres i en blindet måde af to uafhængige observatører. Kontroller måling reproducerbarhed ved at beregne intraklassekorrelation koefficienter.
   4. For langsgående undersøgelser med seriel imagmaterialer, normalisere hulrumsområde til området af hulrummet ved baseline (den allerførste dåsen i undersøgelsen) for hver mus. Resultaterne udtrykkes som ændring i luminale område over tid.
   5. Udfør de relevante statistiske analyser (dvs. student t-test) for at bestemme signifikante forskelle mellem forsøgsgrupper.

Representative Results

Ved hjælp af passende musemodel og oral infektion regime P. gingivalis inducerer kronisk inflammation og immunpatologi på lokalt (mundhulen) og systemiske sites (arterier) (Figur 1).

Hos mus oral infektion med P. gingivalis inducerer en lokal inflammatorisk respons, der driver ødelæggelse af tand støtte alveoleknoglen ^8. s gingivalis inficerede mus udvikle serum antistof respons på denne organisme, der er overvejende af IgG-isotypen ^9. Resultater vist i figur 4 er repræsentative for et eksperiment, hvor C57BL / 6 blev inficeret med P.gingivalis tre gange med to dages intervaller og aflivet 6 uger senere til vurdering af alveolært knogletab ved microCT. Volumetrisk analyse under anvendelse Amira software afslører at P. gingivalis inficerede mus udviser signifikant knogletab sammenlignet med ikke-inficerede kontroller (figur 4A). Visuel inspektion af rekonstrueret hemicellulose maxillae illustrerer en stigning i eksponeret overfladeareal de molære rødder i inficerede mus sammenlignet med kontroller (figur 4B og 4C).

I aterosklerose-tilbøjelige ApoE ^{- / -} mus P. gingivalis inducerer kronisk inflammation, der driver alveoleknogletab ¹² og inflammatorisk plak deponering inden aortabihulen ¹⁵ og innominate arterie ^11. s gingivalis induceret aterosklerose forekommer så tidligt som 24 timer efter den sidste infektion og kan forebygges ved immunisering før infektion ^16. Progressiv inflammation i innominate arterie af P. gingivalis inficerede mus kan overvåges i levende mus ved seriel in vivo MRI på forskellige tidspunkter efter infektion (figur 5). en face målinger af Sudan IV farvede aortaer demonstrerer, at P. gingivalisinfektion øger lipidaflejring og lesional område på intimale overflade (figur 6). På tidspunktet for aflivning histologi og immunhistokemi kan anvendes til kvalitativt eller kvantitativt at karakterisere atherosklerotiske læsioner i forbindelse med cellulær sammensætning, ekspressionen af ​​forskellige antigener og lipidindhold. Immunohistokemisk analyse af aorta sinus læsioner afslører øget makrofaginfiltration og forhøjet ekspression af det medfødte immunsystem-receptor Toll-like receptor 2 (TLR2) i P. gingivalis-inficerede mus (figur 7).

Figur 1. P. gingivalis -induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder. Forud for infektion med P. gingivalis mus er administe rød antibiotika ad libitum i deres drikkevand i 10-14 dage efterfulgt af en to-dages antibiotika hvileperiode. Antibiotikabehandling undertrykker de indfødte mundtlige flora og letter kolonisering. Til induktion af alveolær tab musene inficeret tre gange med to dages mellemrum og alveolærknogle volumen måles seks uger efter infektion. Ved vurderingen af åreforkalkning, aterosklerose-tilbøjelige ApoE ^{- / -} mus typisk smittet 5 gange om ugen i 3 uger og aflivet 16-24 uger efter infektion. Progressiv betændelse i innominate arterie af levende mus kan måles ved seriel in vivo MRI på forskellige tidspunkter efter infektion. Histologi og immunhistokemi kan anvendes til farvning lipider og inflammatoriske celler ved afslutning af forsøget for at validere billeddata. På tidspunktet for aflivningen alveoleknogletab målt ved microCT og global aterosklerotisk byrde vurderes ved en face farvning af hele aorta. https://www.jove.com/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Mus hemi-overkæben illustrerer placeringen af OBS 1 og OBS 2. De tre kindtænder er mærket (M1-M3) og relevant anatomisk terminologi er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Mus hemi-overkæben illustrerer positioneringen af OBS 1 til 5.1556 / 51556fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. alveolær knogletab som målt ved microCT. C57BL / 6 blev oralt inficeret med P. gingivalis eller vehikel alene (uinficeret) og alveolærknogle volumen blev evalueret ved microCT 6 uger senere ved hjælp Amira. (A) alveoleknoglen volumen i hemi-maxillae fra uinficerede og P. gingivalis inficerede C57BL / 6. Resultaterne repræsenterer knogle volumen over referenceplanet (120 mikrometer fra CEJ). Data er udtrykt som knogle volumen SD fra n = 8 mus pr gruppe. *** P <0,001 sammenlignet med ikke-inficerede kontroller. (B) og (C) repræsentant 3D rekonstruktioner af hemi-maxillae fra uinficerede (B)og P. gingivalis inficerede (C) mus. Et signifikant fald i alveoleknoglen volumen kan ses i P. gingivalis inficerede mus, når sammenlignet med ikke-inficerede kontroller. Pilespidser angiver områder, hvor synlig knogletab sker i P. gingivalis inficerede mus (bemærk stigningen i eksponerede overfladeareal molære rødder). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Progressiv betændelse i innominate arterie efter P. gingivalis infektion som målt ved MRI (A) Repræsentant Magnetisk Resonans (MR) angiogram af aortabuen og større fartøjer med en ApoE. ^-/ -. Mus (B) Axial MR-billede fra den gule linje i A i innominate arterie af en mus, 0.3mm under dets tvedeling. Innominate arterier blev afbildet ved MRA ved baseline og ved 12 og 16. uge efter infektion. (C) Den tidsmæssige ændring i luminale område (mm ²⁾ blev beregnet for de enkelte mus (n = 10-12 / gruppe). Uinficerede ApoE ^{- / -} (blå) P. gingivalis inficerede ApoE ^{- / -.} (rød) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. En ansigt bestemmelse af lesional område i hele aorta. (A) Sudan IV farvning af aorta <em> da ansigt læsioner 16 uge efter infektion med P. gingivalis. (B) Kvantificering af lipid indhold inden for den samlede aorta-inficerede (hvide symboler) og P. gingivalis inficerede mus (sorte symboler) (n = 10-13 / gruppe). Andel af aorta besat af lipider blev beregnet ved hjælp ImageJ. * P <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7. Immunohistokemisk analyse af aorta sinus læsioner Mand ApoE ^{-. / -} Mus fodret med en normal chow kost blev inficeret med P. gingivalis eller ikke-inficerede og ofrede 16 uger efter infektion. Kryosektioner opnået fra aortabihulen blev farvet med anti-mus F4 / 80 og TLR2. Målestokken, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

P. gingivalis oral infektion model giver et værdifuldt redskab til studiet af patogen-induceret kronisk inflammation på lokale og systemiske websteder. Denne unikke model tillader karakterisering af både vært og patogen specifikke mekanismer, der bidrager til kronisk inflammation og immunpatologi. Desuden kan modellen anvendes til at screene for nye terapeutiske strategier, herunder immunisering og farmakologisk intervention. De skridt, der er skitseret i denne protokol beskriver den vellykkede brug af denne model og detaljeret metoder til at vurdere initiering, progression, og resultatet af P. gingivalis induceret kronisk inflammation.

Der er flere kritiske aspekter at huske på, når du bruger denne protokol til at undersøge inflammatorisk knogletab. For det første skal det bemærkes, at resultatet af infektion med P. gingivalis bestemmes af tre vigtige faktorer: 1) genetisk modtagelighed værten til infektion 2) patogenvirulens (genetik patogenet) og 3) den resulterende værtspatogene vekselvirkning (interaktion af de to genomer). Modtagelighed for P. gingivalis -induceret alveoleknogletab er genetisk bestemt i mus, og dermed pleje skal tages ved valg af stammen af mus i undersøgelsen ^17. Differential værtsresponser blandt indavlede musestammer kan tages fordel af at gennemføre frem genetiske skærme og karakterisere gener involveret i modtagelige og modstandsdygtighed over for patogen-induceret kronisk inflammation. Desuden eksisterer der en betydelig heterogenitet i evnen af forskellige P. gingivalis-stammer til at inducere alveolært knogletab hos mus ^18. Denne protokol bruger mus på C57BL / 6 baggrund på grund af tilgængeligheden af transgene mus og deres følsomhed over for åreforkalkning. P. gingivalis-stamme 381 inducerer alveoleknogletab og åreforkalkning i mus på C57BL / 6 baggrund, og flere bakterielle mutanter er blevet udviklet ved hjælp this stamme.

Mus er særligt resistente over for atherosklerose og udviklingen af ​​åbenlyse arterielæsioner kræver anvendelse af genetisk modificerede musemodeller for atherosklerose. Vi bruger ApoE ^{- / -} mus model, fordi det er veletableret musemodel for aterosklerose, ikke kræver tilførsel af kost med højt fedtindhold til dannelse af læsioner, og gengiver mange aspekter af human sygdom ^19. Den type kost at fodre dyrene i løbet af forsøget er en vigtig variabel. For størstedelen af ​​vores arbejde, vi fodrer mus en normal chow kost for at undgå bidrag exogene lipider i fortolkningen af ​​vores resultater. I indledende undersøgelser fandt vi, at fodre mus med højt fedtindhold kost masker forskelle i en face læsion område mellem inficerede og P. gingivalis inficerede mus inden aortabihulen. Men høj fedt kost og P. gingivalis infektion arbejde synergistisk, når udviklingen af Inflamninger overvåges i innominate ved MR-scanning eller histologi ^11. Hos mus, den innominate arterie har en høj grad af læsion progression og læsioner i denne arterie udtrykkelig lighedspunkter med klinisk sygdom hos mennesker, herunder fartøj indsnævring, atrofiske medier, perivaskulær betændelse og plak forstyrrelser. Sondringer i den cellulære sammensætning af læsioner er tydelige på forskellige anatomiske steder. Makrofager er de primære immunceller infiltrerer aorta sinus læsioner, mens innominate arterie læsioner sammensat af både makrofager og T-celler.

Eksperimentel varighed og tidspunkt hvor inflammatoriske endepunkter evalueres yderligere faktorer at overveje, når vurderingen af initiering, progression, og resultatet af P. gingivalis induceret aterosklerose. Vi har tidligere påvist, at P. gingivalis inficerede ApoE ^{- / -} mus udviser makrofaginfiltration, forhøjet ekspression af medfødte immune markører, ennd øget aflejring af inflammatorisk plak så tidligt som 24 timer efter den sidste infektion i sinus aortae, og dette kan forebygges ved immunisering ^16. I vores hænder, inflammation og immunpatologi stigning med alderen og er indlysende op til 24 uger efter infektion. Men beslutninger om varigheden af ​​undersøgelsen i sidste ende stole på den underliggende hypotese at blive undersøgt, den tilstand af analyse og forudgående kendskab til omfanget af åreforkalkning under specifikke miljøforhold.

Anvendelsen af ​​non-invasive imaging teknikker til overvågning progressiv betændelse i innominate arterie kan bruges til at styre forsøgsperioden. Seriel MR giver mulighed for detaljerede undersøgelser af åreforkalkning progression i det samme dyr, der kan skildrer indsnævringen af arterielumenen og små karvæggen områder ^20. I modsætning til de traditionelle metoder, såsom lipidfarvningen af ​​dissekerede fartøjer, er MR-billeddannelse ikke kræve eutanasiog giver mulighed for langsgående undersøgelser for at vurdere initiering og progression af aterosklerose. I forbindelse med transgene mus, bakterielle mutanter eller eksperimentelle behandlinger, kan den tidsmæssige oplysninger fra MRI anvendes til at evaluere effekten af ​​værten genetik, patogen virulensfaktorer og terapeutisk indgriben. Som en ekstra fordel, histologi og immunhistokemi kan anvendes til farvning lipider og inflammatoriske celler ved afslutning af forsøget for at validere billeddata. Vi har for nylig brugt disse metoder til at demonstrere, at oral infektion med P. gingivalis fremskynder åreforkalkning i innominate arterties af ApoE ^{- / -} mus, at immunisering beskytter mod plak progression, og korrelerer med fald i ophobning af lipider og inflammatoriske celler ^11.

Sammenfattende protokollen skitserer de nødvendige skridt til at producere en robust model af patogen-induceret kronisk inflammation, samtsom de anvendte metoder til at vurdere inflammation på lokale og systemiske websteder. Bortset fra at anvende denne model til at undersøge vært og patogen specifikke mekanismer, der er involveret i inflammatoriske knogletab og aterosklerose, kan den tilpasses til at studere bidraget af patogen-induceret kronisk inflammation yderligere sygdomsmodeller. Dette kan opnås ved anvendelse af transgene musemodeller for sygdomme, herunder rheumatoid arthritis, diabetes og cancer. Nye data viser, at en række kroniske sygdomme af ukendt ætiologi kan have smitsomme oprindelse. Disse sygdomme inkluderer neoplastiske, autoimmune og inflammatoriske sygdomme, og sammen kompromittere de vigtigste årsager til morbiditet og mortalitet i hele verden. Således brug af dyremodeller for at undersøge, hvilken rolle af patogener i sygdomme, drevet af kronisk inflammation har potentiale for en bred terapeutisk virkning og forbedret diagnostik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm