Abstract
Bu şiddetli enfeksiyon geliştirmek için onların daha fazla risk göz önüne alındığında, gastrointestinal (Gİ) bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda yolu sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu tespit etmek çok önemlidir. CMV enfeksiyonu tespiti için çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü ve moleküler yöntemler de dahil olmak üzere, geliştirilmiştir. Genellikle, bu yöntemler CMV ile sistemik ilişkisini yansıtır ve özellikle lokal doku tutulumu tespit yok. Bu nedenle, GI bölgesindeki CMV enfeksiyonu tespiti sıklıkla biyopsi dokusu, geleneksel histoloji ile yapılır. Immünohistokimyasal (İHK) ile birlikte hematoksilen ve eozin (H & E) boyama Bu biyopsilerin incelenmesi dayanaklarını kalmıştır. H & E ve İHK bazen yorumlama zorlaştırır, atipik (şüpheli) boyanma sonuçlanabilir. Bu CMV kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) başarılı bir şekilde çok için formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi dokusu üzerinde gerçekleştirilebilir gösterilmiştiryüksek duyarlılık ve özgüllük. Bu protokolün amacı, bir klinik laboratuvar ortamında FFPE biyopsi dokusunda CMV tespiti için qPCR testleri gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. Bu yöntem, GI biyopsilerinde CMV için belirsiz boyanma durumlarda hastalar için büyük bir fayda olması muhtemeldir.
Introduction
Klinik örneklerde sitomegalovirüs (CMV) enfeksiyonu yorumlanması önem taşımaktadır. CMV herpesvirüslerinin betaherpesvirinae alt familyasının bir üyesidir. Diğer herpes virüsleri benzer şekilde, CMV, aktif viral replikasyon 1 eksikliği ile karakterize edilen bir biçimde ya da latent enfeksiyon kurma yeteneğine sahiptir. Virüsün reaktivasyonu hastalık belirtileri 2-4 eşlik edilebilir virionu salınımıyla karakterize aktif viral replikasyon, yol, stres veya diğer immünosupresyonun dönemlerinde oluşabilir. Gastrointestinal (GI) CMV hastalığı belirtileri sık sık karın ağrısı ve / veya kanlı dışkı 1 içerir.
Histoloji CMV gastroenterit tanısı hematoksilen ve CMV viral kapanımlar tespit etmek eozin (H & E) kullanır. Klinik şüphe yüksek henüz belirgin kalıntılar görülmektedir durumlarda, immünhistokimyasal (İHK) sık sık bir yardımcı bir test yöntemi olarak kullanılmaktadır. Ancak, İHKAyrıca yorumlanması zor (Şekil 2) 5 yapma, nadir klasik olmayan görünen hücresel boyanma (şüpheli) engel olabilir. Bu formalin fikse, parafine gömülü (FFPE) GI biyopsi dokusu ve GI biyopsi CMV'nin algılamak için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) çıkarılan DNA kullanmak için aranan oldu. Bu teknik, GI biyopsilerinde CMV saptanmasında önemli olduğu gösterilmiştir ve şüpheli IHC boyama durumlarda 5,6 özellikle yararlıdır edilmiştir. Ayrıca, qPCR da 6 uygun olduğunda ek klinik CMV test verileri ile iyi bir korelasyon olduğu gösterilmiştir. CMV tespit QPCR kullanımı CMV için klinik şüphe yüksek olduğu durumlarda erken tanı ve tedaviye yol açabilir, fakat H & E ve CMV İHK olumsuzdur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile, elektronik laboratuvar veritabanı arama gastrointestinal (CMV) enfeksiyonu vakalarının histopatolojik tanı (GI) biyopsiler (hematoksilen temsil eden (FFPE) bloklar ve gömülü formalin fikse, parafin belirlemek için yapıldı eozin (H & E) ve / veya immünohistokimya (IHC)).
FFPE GI Biyopsi Doku 1. Doku İşleme
- Sitomegalovirüs (CMV) için FFPE GI biyopsi doku blokları toplayın kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR). Bu bloklar, oda sıcaklığında saklanır.
- Bloğun benzersiz kimlik numarası ile Pre-etiket 1.7 ml mikrofuj tüpler.
- Mikrotom çarkını kilitleyin.
- Kaset kıskaç içine doku blok koltuk.
- Taze, kullanılmamış bir bıçak kullanarak, mikrotom üzerinde bıçak açısına blok hizalayın.
- 10 mikron kalınlığında bölümleri kesmek için mikrotomu ayarlayın.
- Th kilidinie çarkı ve avans bıçağın doğru bloğu.
- Her kesim bir doku kaydırma içine rulo sağlayan, 10 mikron kalınlığında aralıklarla bloğunun 5 bölümleri kesmek. Her kaydırma istenen biyopsi dokularının yeterli gösterimini içeren emin olun.
- Mikrotom çarkını kilitleyin.
- Forseps ile, sadece çapraz kirlenme riskini azaltmak amacıyla, parafin ile kaydırma işlemek için dikkatli olmak, önceden etiketlenmiş bir santrifüj tüpü içine doku tüm 5 kayar yerleştirin. Tüp kapağı ek ve rafa geri yerleştirin.
- Mikrotom gelen doku bloğu çıkarın.
- Çıkarın ve bıçak atın.
- Önceki doku ile temas etmiş olabilecek yüzeyleri veya araçları dekontamine.
- Bıçak tutucu içine taze, kullanılmamış bıçağı yerleştirin.
- Tekrar işlenecek her bir ek blok için 1,4-1,14 adımları tekrarlayın. Doku kayar ihtiva mikrofüj tüpler tim kadar oda sıcaklığında saklanabilirDNA ekstraksiyon e.
FFPE GI Biyopsi Doku Scrolls 2. DNA Ekstraksiyon
NOT: Bu protokol FFPE doku DNA ekstraksiyon kiti (: Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) bakın DİKKAT) ve prospektüste uyarlanmıştır.
- Her bir numune, bir mikrofüj tüpüne 1 ml ksilen (MGVS'de Bakınız DİKKAT) ekleyin. Kuvvetli bir şekilde 10 saniye için kapak ve girdap kapatın.
- Spesifik olarak şu değişiklikler ile üreticinin ürün ekin özetlenen DNA ekstraksiyonu ile devam edin.
- İlk olarak, her bir mikrofüj tüpüne, dahili kontrol (IC) 6 ul ekleyin.
- 1 saat boyunca 56 ° C'de ATL / proteinaz K liziz inkübasyondan sonra, 1 saat süre ile, 30 dakika boyunca 99 ° C 'de yerine, 90 ° C inkübe edin.
- Nihai DNA elüsyon adımı sırasında dikkatli bir DNA saflaştırma kolonunun kapağı açın ve oldukça Buffe göre, zarın merkezi 50 ul damıtılmış DNAse / RNAse içermeyen su uygulamakr ATE.
NOT: Uygun depolama ve reaktiflerin hazırlanması için paket içeriğine bakınız. DNA Tüm 5 FFPE verilirse elde edilmelidir. Oda sıcaklığında (15-25 ° C) tüm santrifüj adımları uygulayın.
CMV 3. QPCR
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Prosedür
- CMV tahlil çalıştırmak için bir Excel çalışma sayfası PCR oluşturun. Bu Excel çalışma sayfası Mg ile ana karışımı telafi etmek için gerekli her reaktif toplam miktarını hesaplar. Bu örnek başına ihtiyaç duyulan her reaktif miktarını (aşağıda listelenen) kez örneklerin ve kontrollerin sayısı artı çarpar biri (nedeniyle pipetle için kaybını telafi etmek için).
- Miktarında, her PCR reaksiyonunda aşağıdaki reaktifler belirtilen şunlardır:
Reaktif0; Örnek başına miktar
CMV LC usta karışımı flakon 12.5 ul
Mg Çözüm sarı flakon 2.5 ul
Toplam hacmi 15.0 ul
- Miktarında, her PCR reaksiyonunda aşağıdaki reaktifler belirtilen şunlardır:
- , Bir su ya da hedefsiz kontrol (NTC), negatif kontrol, düşük bir pozitif kontrol, yüksek bir pozitif kontrol ve QS3 veya QS4 ya da, ve hasta numuneleri, her deneyde dahil çalıştırın. Kapilerler bu sırayla kurmak olmalıdır.
- 4 ° C'de saklanan gerçek zamanlı PCR alet için soğutma bloğu spesifik elde edilir Soğutma bloğu içinde uygun kılcal tüpler yerleştirin. Kılcal tüplerin yüzeyine dokunmayın. Kılcal damarları tutarken daima eldiven kullanın.
- Amplifikasyon üretimi ile kontamine olmayan temiz bir başlık tüm polimeraz zincir reaksiyonları kurmakts.
- Tüm hasta örnekleri, artı 5 kontrolleri test etmek için PCR kiti usta şişeleri doğru sayısını çıkarın. Let ana flakon, Mg çözüm ve soğutma bloğuna PCR sınıf su çözülme. Her bir ana şişe 12 testler için yeterince reaktif madde içerir.
- Yavaşça ana şişeleri vorteks ve hızlı maksimum hızda santrifüj bunları dönerler.
- Bir şişenin içine her ana flakon içeriğini birleştirin ve yavaşça tekrar vorteks.
- Tek bir steril mikrofüj tüpü içine PCR çalışma sayfasına belirtilen miktarlarda ana karışımı ve Mg solüsyonu birleştirin.
- Kantitasyonu standart (QS) için olan konum 5 kılcal dışında, her bir kılcal tüp içine yavaşça ve kısım Mg ile ana karışımı 15 ul karıştırın.
- Temiz başlık bir işleme kaput Mg ile kılcal boru ve ana karışımı içeren soğutma bloğunu taşımak.
- Master kalan 30 ul iç kontrolün 2 ul (IC) EkleMg ile karıştırın. 5. pozisyondaki kılcal (QS için konum) içine yavaşça ve 15 ul alikot karıştırın.
- Su pipetle 10 ul, uygun bir kılcal tüp içine DNA, ya da örnek DNA kontrol eder. Kapatma aracını kullanarak kılcal tüpler Cap.
- Real-time PCR enstrüman blok / örnekleri soğutma atın.
- CMV tahlil çalıştırmak için bir Excel çalışma sayfası PCR oluşturun. Bu Excel çalışma sayfası Mg ile ana karışımı telafi etmek için gerekli her reaktif toplam miktarını hesaplar. Bu örnek başına ihtiyaç duyulan her reaktif miktarını (aşağıda listelenen) kez örneklerin ve kontrollerin sayısı artı çarpar biri (nedeniyle pipetle için kaybını telafi etmek için).
- Real-time PCR enstrüman programı (bkz. Tablo 1)
- Amplifikasyonu ve saptanması, gerçek zamanlı PCR cihazı üzerinde gerçekleştirilen
- Bilgisayarda oturum
- Çift alet simgesine tıklayın ve yazılımı içine giriş.
- Real-time PCR aleti açın
- Ön ekrandan "CMV / EBV" üzerine tıklayın.
- Makro Sihirbazın istemleri izleyin.
- Yazılımı tarafından istendiğinde bir self-test çalıştırmak için kutusunu seçin. A self-test Cihaz kullanımdayken her gün bir defa yapılmalıdır.
- Run Ad.
- Üst LEF bulunan örnek sayısını ayarlayınkontrol ve hasta toplamına sayfanın t köşe vadede dahildir ve her hasta numunesi kimlik numarasını girin.
- "Abs Quant" sekmesine tıklayın.
- "Numune türü" altında, standart için uygun örnek türü atayabilirsiniz.
- Sayımıdır standart (QS) için beklenen konsantrasyonlarda yazın.
- Soğutucu bloğundan kılcal tüpleri çıkarın ve (blok örnek # 1 soğutma, vb atlıkarınca pozisyon # 1 yerleştirilmelidir) atlıkarınca karşılık gelen konuma yerleştirin.
- Cihazın santrifüj ve basın başlangıç içine atlıkarınca yerleştirin.
- Santrifüj açın ve atlıkarınca çıkarın.
- Real-time PCR aracı haline atlıkarınca yerleştirin. Kapağı kapatın.
- Basın "Başlat Çalıştır".
- Gerçek-zamanlı PCR cihazı, bir numune için her pozisyonunu kontrol eder. Bu onay tamamlanana kadar uzak cihazdan değil yürümek, ESPEkılcalların bir atlıkarınca değilse likle. Cihaz, bu not ve çalışma devam edecek olup olmadığını soracaktır. Ayrılmadan önce evet cevabı.
- Çalışma tamamlandıktan sonra, oluşturulan raporu kapatın.
- "Mutlak Nicel" üzerine tıklayın.
- Sonraki Color Tazminat için oka tıklayın.
- Açılan kutudan "Renk Seç Tazminat" tıklayın.
- Vadede uygulamak için en güncel renk telafisi dosyayı seçin.
- Kutusu açılır, Tamam'a tıklayın.
- Standart Eğrisi tarafından oka tıklayın.
- Açılan menüden "dış kullanın" seçeneğini seçin.
- En güncel dış standart eğri dosyayı seçin, ardından Tamam'a tıklayın.
- Bir konsantrasyon atanırsa eğrileri, mevcut ve düz değil çizgi emin olmak için mutlak miktarının menüsü altında her eğri bak. 705/Back 530 Mutlak miktarının otomatik olarak analiz edilir.
- Quality kontrolü
- Daha sık hangisi belirteçlerin yeni bir lot numarası alındığında, yeni bir standart eğri, ya da her altı ayda bir, üretir.
- Mg ile ana karıştırmak için her bir standart 10 ul ekleyin. Daha önce çıkarılan DNA gibi kiti ile birlikte standartları düşünün.
- Mg doğru sayılmasını sağlamak için standart bir eğri oluşturmak için kullanılan ile ana karışımı, her bir standart için iç kontrol 1 ul ekle. Hayır Şablon Kontrolü (NTC) için Mg ile ana karışımı IC katmayın.
- 16 veri noktası olarak toplam bir NTC ve kantitasyonu Standartlar QS 4, 3, 2, 1 ve standart eğri oluşturmak üzere çalıştırmak için QS4 bir 1:10 seyreltme üç suret hazırlayın.
- Tekrarlanan standartları için açılır menüden of "tekerrür" seçiniz
- Kanal 530/back hiçbiri seçin ve çalıştırmak analiz ederken renk tazminat açmak,
- "(Run) Standart Eğri" altında "seçeneğini ex olarak kaydetmekdahili "ve eğri isim. Kaydederken "standart eğri olarak uygulanır" açıklama girin.
- Sonuçlarını grafik. Elde edilen doğrusallık katsayısı 0,81 ≥ gerekir.
- Günlük ishal için, vadede bir kontrol olarak QS3 veya QS4 bir kopyasını içerir. Mevcut dış standart eğri analiz aşamasında vadede ithal edilebilir.
- Run Kontroller: hayır DNA kontrol, negatif kontrol, düşük ve yüksek pozitif kontroller. Beklenen viral yük belirlenir ve her satıcı ve çok sayıda ayarlanır.
- Her bir örnek için bir IC ekleyin ve DNA ekstraksiyon sırasında kontrol eder.
- Denetimlerden herhangi aralığının dışında düşersen, kabul edilemez sonuçları kaydetmek ve sorun giderme için tahlil bakın.
- Kontrol sıklığı
- Bir NTC, negatif, düşük pozitif, pozitif, yüksek ve standart kontrol: Her vadede içerir.
NOT: kontroller için kabul edilebilir sınırlar. Resim tepe noktaları dikkat edilmelidirherhangi bir şablon (NTC) ve negatif kontroller için d. Peaks 530 kanalda bulunması gereken ve beklenen viral yükler belirlenir ve düşük ve yüksek pozitif kontroller için her satıcı ve çok sayıda ayarlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
228 doku blok toplam şüpheli CMV İHK ile histoloji ve pozitif immünohistokimyasal (İHK), 18 dayanan 91 sitomegalovirüs (CMV) pozitif olgu oluşuyordu kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), ve 79 negatif kontroller ile test edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, CMV pozitif vaka tipik viral CMV kusurları (A) ve / veya pozitif boyanma IHC (B) göstermiştir olacaktır. Negatif kontroller hiçbir şüpheli histoloji veya İHK lekeleme 5 göstermiştir olurdu oysa şüpheli durumlarda, nadir, klasik olmayan görünen boyama desenleri (C) göstermiştir olurdu.
Histopatolojik olarak CMV için pozitif 91 biyopsi, 88 QPCR (Tablo 2) ile pozitif bulundu. Geleneksel histoloji dayalı bir gerçek pozitif tanımı ile, tipik CMV viral kapanım ve / veya tipik CMV IHC yani, bu veriler% 96.7 duyarlılık sonuçlandı.
Şüpheli CMV İHK boyama ile 18 (% 78) biyopsi Ondört qPCR 5 ile CMV için pozitif test. Bu 18 şüpheli durumlarda arasında onbiri ek biyopsiler histopatolojik tarafından CMV için pozitif aynı gün almıştı. Bu 14 QPCR olumlu örnekler arasında, 10 biyopsiler histopatolojiye CMV için pozitif aynı gün almıştı. Test edilen 18 şüpheli biyopsilerin, 11 biyopsi alındığı zaman 7 gün içinde veya sunulan diğer örneklerinde CMV testleri ile ilgili ek klinik bilgiler vardı. Bu 11 olgunun 8'inde (% 73) qPCR CMV için pozitif test. Bu 11 biyopsi, 5 (% 45) ek pozitif örneklerin CMV ile qPCR pozitif test; 3 (% 27) varsaymak testhiçbir olumlu örneklerin CMV ile qPCR ive; 3 (% 27) ek bir negatif CMV numuneler ile qPCR negatif test.
Yukarıda belirtilen çalışmalara ek olarak, elde ek hematoksilen ve eozin (H & E) düzeyleri hiçbir viral inklüzyonlar başlangıçta H & E görülen ve CMV İHK muğlak olduğu durumlarda yararlı olacağını belirlemek için ilgi oldu. Bu nedenle, belirsiz CMV IHC ile 18 blokların her biri için H & E düzeyleri 5 kez gerçekleştirilmiştir. İki patolog dikkatle bu davaları incelediğini ve ek slaytlar (veriler gösterilmemiştir) herhangi farkedilebilir bir viral kapanım tespit olamazdı.
| Önerilen gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon parametreleri | ||||||
| Kurulum Okumalar: | ||||||
| Varsayılan Kanal | Sıcaklık Seek | Max Pos Seek Enstrüman tipi | Kılcal Ebat | |||
| 530 | 30 ° C | 12 | 6 kanal | 20 ul | ||
| Program adı: enzim aktivasyonu | ||||||
| Döngülerinin sayısı: 1 | ||||||
| Analiz modu: Yok | ||||||
| Hedef ° C | Hh tutun: dd: ss | Rampa Oranı | Sec Hedef | Adım Boyutu | Adım Gecikme | Tedarik etme kipinde |
| 95 | 00:10:00 | 20 | 0 | 0 | 0 | Hiçbiri |
| Program adı: adım aşağı dokunun | ||||||
| Döngüsü sayısı: 10 | ||||||
| Analiz modu: Yok | ||||||
| Hedef ° C | Hh tutun: dd: ss | Veri deposup Oranı | Sec Hedef | Adım Boyutu | Adım Gecikme | Tedarik etme kipinde |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Hiçbiri |
| 65 | 00:00:20 | 20 | 55 | 1 | 1 | Hiçbiri |
| 72 | 00:00:15 | 20 | 0 | 0 | 0 | Hiçbiri |
| Program adı: DNA amplifikasyonu | ||||||
| Döngülerinin sayısı: 40 | ||||||
| Analiz modu: Kantitasyon | ||||||
| Hedef ° C | Hh tutun: dd: ss | Rampa Oranı | Sec Hedef | Adım Boyutu | Adım Gecikme | Tedarik etme kipinde |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Hiçbiri |
| 55 | 00:00:20 | 20 | 0 | 0 | 0 | Tek |
| 72 | 00:00:15 | 10 | 0 | 0 | 0 | Hiçbiri |
| Program adı: Soğutma | ||||||
| Döngülerinin sayısı: 1 | ||||||
| Analiz modu: Yok | ||||||
| Hedef ° C | Hh tutun: dd: ss | Rampa Oranı | Sec Hedef | Adım Boyutu | Adım Gecikme | Tedarik etme kipinde |
| 40 | 00:00:30 | 20 | 0 | 0 | 0 | Hiçbiri |
Tablo 1. Sıralanan parametreler cytomegalovi tespit için gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu set-up hedef sıcaklıklar, çevrim sayılar, ve döngü uzunlukları için bir kılavuz olarak kullanılmalıdır formalin fikse, parafine gömülü gastrointestinal biyopsilerinde rus. Bu parametreler enstrüman modeline ve üreticiye bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir.
| Histoloji Pozitif Kılıfları | PCR Pozitif Kılıfları | Duyarlılık | Histoloji Negatif Kılıfları | PCR Negatif Kılıfları | Specitivity |
| 91 | 88 | % 96.7 | 79 | 78 | % 98.7 |
Formalin fikse, parafine gömülü gastrointestinal biyopsilerinde sitomegalovirüs tespit gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) Tablo 2. Duyarlılık (% 96.7) ve özgüllük (% 98.7). Bu tablo ark 5 McCoy modifiye edilmiştir.
es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg "width =" 400 "/>
Biyopsi doku, 10 mikron kalınlığında bir kısmı kesilir Şekil 1,. Kaset kelepçe A doğru oturan doku bloğu ile tipik bir mikrotom) olarak, bir mikrofüj tüpü C aktarılır kaydırma B)) rulo haline bırakılır. Biyopsi doku Beş motifler DNA ekstraksiyonu için tek bir mikrofüj tüpüne yerleştirilir.
Beklenen İHK boyama deseni (orijinal gösteren CMV karşı monoklonal antikor ile boyandı Şekil 2. A) Hematoksilen ve oklarla (orijinal büyütme 400X) tarafından belirtildiği gibi bol, tipik CMV kapanım gösteren bir kolon biyopsi eosin ile boyanan bölümünde. B) Bir kolon biyopsi 400X büyütme).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pek çok laboratuvar yöntemleri seroloji, viral kültürü, moleküler viremi deneyleri, biyopsi histolojisi ve, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) biyopsi son gösterildiği gibi, moleküler deneyleri de dahil olmak üzere sitomegalovirüs tanısında (CMV) enfeksiyonu için kullanılabilir doku 5,6. Seroloji, tanı bir dayanak kez, sadece güvenilir bir pozlama belirler ve akut CMV enfeksiyonu 7 ile iyi bir korelasyon yoktur. Geleneksel ve erken antijene kabuk şişe hem de Viral kültür, ikinci 8 durumunda en iyi 2-3 gün sonra, uzun deney kat tarafından engellenmektedir. Moleküler Viremi tahliller çoğu izleme, tedavi etkinliği 9-11 için potansiyeli ile kantitatif olmanın avantajı olan, geliştirilmiştir. Gastrointestinal (Gİ) sistem yerel katılımı için klinik endişe var, ne yazık ki, viremi deneyleri sistemik ilişkisini yansıtır ve özellikle lokalize enfeksiyon tespit yok. Bu nedenle, histology gastrointestinal CMV enfeksiyonu tanımlamak için altın standart olmuştur.
Bu şiddetli enfeksiyon geliştirmek için onların daha fazla risk verilen, hücre nakli kök / aktif Gİ CMV kemoterapi, HIV / AIDS ile olanlar gibi bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda enfeksiyon, organ ya da tanımlamak için çok önemlidir. Bu kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) GI biyopsi 5 CMV algılamak için son derece duyarlı ve özgül bir yöntemdir bildirildi. Benzer sonuçlar diğer çalışmalarla 6 tarafından desteklenmiştir.
Prosedür boyunca tüm adımlar önemli olmasına rağmen, özel bir ilgiye hak birkaç önemli kritik adımlar vardır. Mikrotomu doku işleme sırasında, bıçak örneklerin arasında çapraz-bulaşma olasılığını azaltmak için her numune arasında geçiş yapılabilir şarttır. Benzer şekilde, mikrotom alanlarda dekontaminasyon doku uygun bir temizleyici rec kullanarak temas olabilirmikrotom üretici tarafından ommended de bu riski azaltacaktır.
Protokolü esnasında bir diğer önemli bir adım ekstraksiyon işlemi ve hem de amplifikasyonu için bir kontrol olarak görev yapar DNA ekstraksiyonu sırasında, numune için iç kontrol IC (adım 2.3) eklenmesidir. IC algılama kanalı 705 oluşur ise CMV virüsünün tespiti, kanal 530 içinde meydana gelir, çünkü IC amplifikasyon ve saptama, CMV amplifikasyonu ile karışmaz. Her laboratuvar IC için kabul edilebilir bir aralık kurmak gerekir. Ekstre etmeden sonra, DNA kalitesinin değerlendirilmesi için gerek yoktur. Diğer bir deyişle, DNA konsantrasyonunun spektrofotometrik belirleme rutin DNA izolasyonu takip gerçekleştirilmez. DNA önce ekstre eklenmiş, IC ekstraksiyon işlemi için bir kontrol olarak işlev görür. Seçenek olarak ise, IC 1 ul Mg şişe her ana karışıma ilave edilebilir. Mg ile birlikte ana karışımı eklenir, IC tek bir amplifikasyon c olarak hareket ederontrol.
Aynı zamanda zorunlu olduğunu reaktif kurmak için (Pipet ve ipuçları dahil olmak üzere) temiz bir başlık kullanılması gerektiğini tüm QPCR reaksiyonların set-up sırasında. Bu başlık içindeki manipüle herhangi bir amplifikasyon ürünleri, yani sonrası gerçek zamanlı ya da geleneksel PCR, olmamalıdır. Bu amplifikasyon ürünleri aerosolleşebilir ve yanlış pozitif sonuçlara yol açan, daha sonra hazırlanan QPCR tepkiler kirletebilir. Birçok laboratuar bile olmayan nükleik asit reaktif ve numune eklemek için ikinci bir başlık ve ekipmanları pipetleme kadar tayin davlumbaz ve ekipman olarak gidin ve nükleik asit kontrol. Bireysel laboratuvarları en iyi bireysel alan kısıtlamaları verilen ne çalıştığını karar vermelisiniz.
Beklenmeyen sonuçlar giderme işlemi sırasında gerekli olabilir. Bir numunenin IC (yani düz hat) amplifikasyonu hiçbir kanıt yoktur ise, ilk orijinal DNA extracti ikinci QPCR reaksiyon tekrar önerilirBir pipetleme hata sağlamak için numune hazırlama sırasında tepki meydana gelmedi. IC tekrar reaksiyon üzerinde düz bir çizgi kalır ve kalan yeterli biyopsi dokusu varsa, ikinci bir DNA ekstraksiyon ekstraksiyon işlemi sırasında IC eklemek için dikkatli olmak, gerçekleştirilebilir olabilir. Bu yeniden ekstre edilmiş numune, aynı zamanda, düz bir çizgi IC gösteriyor ise, orijinal numune içinde mevcut olan bir reaksiyon inhibitörü yok muhtemeldir. QPCR reaksiyon kontrol uygun gerçekleştirmek etmedi çünkü bu durumda, test sonucu CMV tespiti için belirsiz olacaktır.
Su, hiçbir hedef kontrolü (NTC) hedef amplifikasyon gösteriyor, ilk koşmak pozitifliği oranını analiz etmek için tavsiye edilir. Run, normal pozitiflik oranı daha yüksek varsa, herhangi bir reaktif manipülasyon herhangi bir potansiyel çevresel kontaminasyonu belirlemek için yapılır alanların tokatlamak testlerini gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Çevresel kirlenme dışladı ise, kullanmakHer zamanki pozitif kontroller ile birlikte yeni açılan su kontrolü. Yeni açılan su kontrol bir amplifikasyon ürünü göstermezse, önceki su kontrol hedef sekans ile kirlenmiş muhtemeldir. Bu yeni su kontrol tekrar kirlenmiş Bununla birlikte, eğer, bu hedef sekans ile kirlenmiş olan reaktifler veya davlumbaz herhangi bir veya tüm olasılığını yükseltir. Bu durumda, bu süreçte kullanılan tüm davlumbaz arındırmak ve daha sonra (pozitif ve su) kontrol yeni bir dizi çalışan tüm yeni reaktifleri kullanmak için iyi olurdu. Sorun devam ederse, işleme alanları ve davlumbaz iş akışı, yanı sıra ürün üreticileri temas yeniden değerlendirilmesi yapılmalıdır.
Kalite standartları (QS) amplifikasyon sırasında uygun kopya sayısını göstermek yok vadede dahil ederseniz, her şeyden önce QS (4, 3, 2, 1, ve QS4 bir 1:10 seyreltme) çalıştırmak için tavsiye edilir. Bu standartlar uygun aralıkları içinde düşerse, daha sonra tekrardaha önce uygun bir kontrol ile belirtilen örnekler. QS, uygun aralıklar içinde yer yoksa, o zaman protokolü (3.4), kalite kontrol bölümünde açıklandığı gibi yeni bir standart eğri oluşturmak. Sorun devam ederse, mevcut ya da yeni bir çok dizi yeni açılan QS ile yeni bir standart eğri üreten teşebbüs olabilir. Bu adımlar, başarısız ise, üreticisine başvurarak garanti olacaktır.
Altın standart olarak (H & E ve İHK), geleneksel yöntemleri kullanarak hesaplamalara dayalı GI biyopsi CMV'nin tespit için duyarlılık ve QPCR özgüllüğü hemen altın standart olarak daha analitik hassas QPCR yöntemini kullanarak, bir tanı avantajı göstermek olmasa da büyük ölçüde bu artırır hesaplamaları 5.. Ayrıca, 18 şüpheli biyopsilerin 14 (% 78) bu çalışmada qPCR CMV için pozitif test. Bu noktalar QPCR H & ya da çok daha fazla duyarlı olduğunu görüşünü desteklemektedir hissedilirTek başına E, ya da GI biyopsi materyalinde CMV tespit de İHK ile birlikte. Ayrıca, şüpheli İHK boyanma vakalarda, ek seviyeleri elde mevcut standart yöntemlerle karşılaştırıldığında herhangi bir yararı olması pek mümkün değildir.
Birlikte ele alındığında, qPCR FFPE GI biyopsi dokusunda CMV enfeksiyonu tespit etmek son derece hassas ve özeldir. Özellikle kullanışlı belirsiz CMV İHK boyanma veya CMV için klinik son derece şüpheli ile GI biyopsiler üzerinde QPCR performansı olduğunu. Geleneksel histoloji ile karşılaştırıldığında, GI biyopsi materyalinin QPCR test böylece daha erken ve daha etkili hasta yönetimi lider, kısa sürede doğru tanı kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz rakamlar hazırlanmasında emekleri için bu yazının hazırlanması ile ona yardım için Amy Thomasson ve Fredrik Skarstedt ve Ryan Christy kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
