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Immunology and Infection

हाई यील्ड शोधन की Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51590
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Division of Infection and Immunity, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2Department of Medical Biology, University of Melbourne

Summary

एंटीबॉडी समारोह मापने प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम मलेरिया के लिए प्रतिरक्षा को समझने की कुंजी है. इस विधि व्यवहार्य खंडजाणु की शुद्धि, और फ्लो द्वारा opsonization निर्भर phagocytosis की माप का वर्णन करता है.

Abstract

प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम merozoite एंटीजन संभावित मलेरिया के टीके के रूप में विकास के तहत कर रहे हैं. मलेरिया के खिलाफ प्रतिरोधक क्षमता का एक पहलू phagocytic कोशिकाओं द्वारा रक्त से मुक्त खंडजाणु को हटाने की है. हालांकि merozoite विशिष्ट opsonizing एंटीबॉडी के कार्यात्मक प्रभावकारिता का आकलन करने के कारण खंडजाणु की कम आधा जीवन और प्राथमिक phagocytic कोशिकाओं की परिवर्तनशीलता को चुनौती दे रहा है. विस्तार से वर्णित इस के साथ साथ E64 protease अवरोध का उपयोग व्यवहार्य खंडजाणु पैदा करने के लिए एक विधि है, और समर्थक monocytic सेल लाइन THP-1 का उपयोग merozoite की एक परख opsonin निर्भर phagocytosis है. इलाज schizonts का निस्पंदन द्वारा जारी किया जाता है जो खंडजाणु के विकास की अनुमति है जबकि E64 schizont टूटना रोकता है. Ethidium ब्रोमाइड लेबल खंडजाणु मानव प्लाज्मा नमूनों के साथ opsonized और THP-1 कोशिकाओं को जोड़ा जाता है. Phagocytosis एक मानकीकृत उच्च throughput प्रोटोकॉल द्वारा मूल्यांकन किया है. व्यवहार्य खंडजाणु numer का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैंपी. के ous पहलुओं प्रतिरक्षा समारोह के मूल्यांकन सहित फाल्सीपेरम जीव विज्ञान,. इस परख द्वारा मापा एंटीबॉडी का स्तर स्वाभाविक रूप से उजागर व्यक्तियों में मलेरिया के लिए नैदानिक ​​उन्मुक्ति के साथ जुड़े रहे हैं. परख भी वैक्सीन प्रेरित एंटीबॉडी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल की जा सकती है.

Introduction

प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम मलेरिया के लिए प्रतिरक्षा के लिए एंटीबॉडी का महत्व 40 साल पहले, hyperimmune वयस्कों से इम्यूनोग्लोबिन जब निष्क्रिय क्रमशः समाप्त रोग 1 में जिसके परिणामस्वरूप गंभीर मलेरिया से पीड़ित बच्चों के लिए हस्तांतरित किया गया था दिखाया गया था. नतीजतन, काफी प्रयास ज्यादातर एलिसा द्वारा पेप्टाइड्स या bacterially व्यक्त प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी titers मापने के माध्यम से, सुरक्षा मलेरिया उन्मुक्ति के लक्ष्यों की पहचान करने की मांग की है. एलिसा आधारित सीरम विज्ञान भी पढ़ाई के बीच अत्यधिक चर साबित हो गया है, और एंटीबॉडी कार्यक्षमता 2 का पता नहीं है. कई मलेरिया एंटीजन एक कोशिकाओ के प्रति आकर्षित होना वाला IgG1 और IgG3 एंटीबॉडी प्रोफाइल, विशेष रूप से merozoite सतह एंटीजन 3 प्रेरित. इस उपवर्ग पूर्वाग्रह फ़ैगोसाइट साथ एंटीबॉडी एफसी रिसेप्टर (FCR) बातचीत antimerozoite एंटीबॉडी 4 opsonizing की प्रेरक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण होते हैं. विकास के अंतर्गत कई merozoite प्रतिजन टीके के लिए तैयार कर रहे हैंभक्षककोशिकीय प्रेरक कार्यों 5, 6 और बटोर कृंतक मलेरिया के मॉडल में एंटीबॉडी FCR बातचीत के महत्व के लिए महत्वपूर्ण सबूत 7-9 से मौजूद है, और कुछ हाल ही के अध्ययन के लिए मानव में मलेरिया के लिए प्रतिरक्षा के लिए कार्यात्मक एंटीबॉडी और भक्षककोशिकीय प्रेरक कार्यों के महत्व का समर्थन करते हैं 10, 11, इस क्षेत्र खराब अध्ययन बनी हुई है. Merozoite विशिष्ट opsonizing एंटीबॉडी में अध्ययन में दो कारकों द्वारा सीमित किया गया है; अच्छी गुणवत्ता खंडजाणु अलग करने में कठिनाई; प्राथमिक कोशिकाओं से और चर phagocytosis के हिमायती हैं.

अभी हाल तक, उच्च गति centrifugation या Percoll gradients घनत्व schizont संस्कृतियों rupturing की संस्कृति supernatants से खंडजाणु अलग करने के लिए उपयोग किया गया. ये खंडजाणु शायद ही कभी व्यवहार्य थे, और अक्सर आगे घनत्व centrifugation द्वारा छेड़छाड़ और कई धोने assays में उपयोग करने से पहले 12 या cryopreservation के 11 पदों. ये processes संभावित merozoite सतह से कई सतही तौर पर जुड़े प्रोटीन, मलेरिया उन्मुक्ति 13 की प्रतिजनी लक्ष्य होने के लिए जाना जाता प्रोटीन को अलग. हाल ही में सिस्टीन protease अवरोध पार Epoxysuccinyl एल leucylamido (4 guanidino) ब्यूटेन (E64) व्यवहार्य खंडजाणु उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. E64 व्यवहार्य खंडजाणु 15, 16 को आजाद कराने के लिए निस्पंदन द्वारा बाधित किया जा सकता है जो झिल्ली संलग्न खंडजाणु 14, सृजन, schizont टूटना रोकता है. इस तकनीक एरिथ्रोसाइट आक्रमण 15, 17-19 के दौरान कई प्रोटीन की स्थानिक संकल्प को जन्म दिया है और कई मलेरिया रोधी दवाओं 16, 20 की अवस्था विशिष्ट प्रभाव स्पष्ट किया है. हालांकि, व्यवहार्य खंडजाणु की पीढ़ी तकनीकी रूप से चुनौती बनी हुई है. उन्मुक्ति के कार्यात्मक assays, एक में व्यवहार्य merozoite शुद्धि और उनके उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए इस तकनीक का और आवेदन के प्रसार में सहायताएंटीबॉडी के मानकीकृत कार्यात्मक परख: opsonization और phagocytosis में सेलुलर सहयोग यहाँ वर्णित है.

यह तकनीक ऐसी न्युट्रोफिल सांस फट, एंटीबॉडी पर निर्भर सेलुलर निषेध (ADCI), और वैकल्पिक merozoite phagocytosis assays के रूप merozoite opsonization के पिछले इन विट्रो assays, पर एक महत्वपूर्ण अग्रिम दर्शाता है. ये assays कारण परजीवी आदानों में भिन्नता और प्राथमिक phagocytic कोशिकाओं 11, 21 की गतिविधि को खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं. Contaminating hemozoin भी गहराई से भक्षककोशिकीय समारोह 22 को प्रभावित कर सकता है. एक हाल ही में सूचना दी मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य merozoite phagocytosis परख 23 promonocytic सेल लाइन THP-1 24 का इस्तेमाल करता. यह गैर पक्षपाती है और विशेष रूप से एफसी रिसेप्टर मध्यस्थता phagocytosis 25, 26 से करता है क्योंकि यह उच्च throughput फ्लो assays के लिए एक आदर्श सेल प्रकार है. एक अतिरिक्त जटिलता जांच करते हुएphagocytosis tigating phagocytosis की डिग्री THP-1 कोशिकाओं और प्लाज्मा एकाग्रता के सापेक्ष खंडजाणु की संख्या पर निर्भर है. प्रयोगों के बीच reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, खंडजाणु प्रगणित किया जाना चाहिए और एक परिभाषित एकाग्रता का इस्तेमाल किया. कारण अपने छोटे आकार, cytometric मात्रा का ठहराव आवश्यक है प्रवाह.

यहाँ वर्णित प्रक्रिया hemozoin हटा और व्यवहार्य खंडजाणु उत्पन्न करता है, और opsonization और phagocytosis द्वारा पीछा खंडजाणु के प्रवाह cytometric गणन के लिए इन खंडजाणु का एक आवेदन का वर्णन करता है. तकनीकी रूप से मांग हालांकि, वर्णित तकनीकों स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया और टीका उन्मुक्ति प्रेरित करने merozoite सतह विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का योगदान elucidating में उपयोगी साबित हो सकता है.

Protocol

नोट: सभी कदम, centrifugation और प्रवाह cytometry इसके अलावा, बाँझपन बनाए रखने के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड के भीतर किया जाना चाहिए. उचित सावधानियों मानव नमूनों की हैंडलिंग के बारे में ले रहे हैं सुनिश्चित करें. परख प्लाज्मा की छोटी मात्रा के लिए बहुत संवेदनशील है. 78% पापुआ न्यू गिनी (पीएनजी) से अर्द्ध प्रतिरक्षा बच्चों से प्लाज्मा के साथ - प्रदान की dilutions 5 से लेकर प्रतिक्रियाओं को हल करने के लिए उपयोगी हैं. इष्टतम कमजोर पड़ने प्लाज्मा सेट का परीक्षण किया जा रहा है साथ भिन्न हो सकते हैं, और इसलिए यह प्लाज्मा प्रत्येक आवेदन के लिए प्रयोगात्मक शर्तों का निर्धारण करने के लिए titrated हो कि सिफारिश की है. प्लाज्मा के अभाव में खंडजाणु साथ 2 नकारात्मक नियंत्रण THP-1 कोशिकाओं का समावेश सुनिश्चित करना; और खंडजाणु साथ THP-1 कोशिकाओं मलेरिया भोले व्यक्तियों से प्लाज्मा का एक पूल के साथ opsonized. इस THP-1 कोशिकाओं को merozoite पालन करने के लिए नियंत्रण की अनुमति देगा और phagocytosis घटनाओं की कठोर प्रवाह cytometry gating सकें.

पीएनजी प्लाज्मा नमूनों का उपयोग किया गया थाचिकित्सा अनुसंधान सलाहकार समिति, स्वास्थ्य की पापुआ न्यू गिनी मंत्रालय, वाल्टर और एलिजा हॉल इंस्टिट्यूट ऑफ ह्यूमन रिसर्च आचार समिति (परियोजना संख्या 04/04) ने मंजूरी दे दी. लिखित सहमति के सभी प्रतिभागियों के माता - पिता / अभिभावक से प्राप्त हुई थी.

1. THP-1 संस्कृति

  1. एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) और 55 माइक्रोन 2 mercapthoethanol (THP-1 मध्यम) के साथ पूरक RPMI 1640 मध्यम में और 37 डिग्री सेल्सियस पर मानव monocytic सेल लाइन THP-1 को बनाए रखें.
  2. 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल नीचे एक घनत्व कोशिकाओं को बनाए रखें. नोट: अतिवृद्धि पक्षपाती कोशिकाओं में और नीचे विनियमन एफसी रिसेप्टर्स के भेदभाव का परिणाम देगा. कोशिकाओं लगभग 10 बार passaged किया गया है एक बार, सेल phenotype बनाए रखने के लिए एक नई शीशी पिघलना.

2. एंटीबॉडी नमूना तैयार करना और कमजोर पड़ने

  1. गर्मी निष्क्रिय प्लाज्मा 56 डिग्री पर incubating द्वारा परीक्षण किया और मलेरिया भोले नियंत्रण प्लाज्मा होने के लिए; 30 मिनट के लिए सी
  2. क्रमानुसार THP-1 मध्यम में 1/2, 000 के लिए प्लाज्मा नमूने पतला.
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर पतला प्लाज्मा

अति सिंक्रनाइज़ पी. के 3. संस्कृति फाल्सीपेरम

नोट: GFP-व्यक्त परजीवी लाइन D10-PfPHG 27 कारण परजीवी के तुल्यकालन और E64 अलावा नियंत्रित समय सहायता करता है जो अपनी 48 घंटा जीवन चक्र के लिए उपयोग किया गया था. इस लाइन cytosol में GFP व्यक्त क्योंकि इसके अलावा, इस लाइन GFP के प्रवाह cytometric पता लगाने के द्वारा parasitaemia और फ्री खंडजाणु का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. हालांकि, GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता THP-1 कोशिकाओं के भीतर दृश्य प्रदान करने के लिए पर्याप्त नहीं है, और इसलिए, खंडजाणु ethidium ब्रोमाइड (EtBr) के साथ counterstained रहे हैं. अन्य परजीवी उपभेदों तंग synchrony प्राप्त है, बशर्ते कि उपयोग किया जा सकता है. आक्रमण 15 को बाधित करने के लिए परिपक्व रूपों 28 और हेपरिन lyse करने sorbitol उपचार के संयोजन का उपयोग परजीवी सिंक्रनाइज़

  1. पी. बनाए रखें फाल्सीपेरम RPMI 1640 मध्यम में 3% hematocrit 25 मिलीग्राम / एमएल HEPES, 50 माइक्रोग्राम / एमएल hypoxanthine, 10% जमा मानव सीरम, 2 मिलीग्राम / एमएल सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ पूरक (7.4 पीएच) में O + मानव एरिथ्रोसाइट्स (आरबीसी) में परजीवी, और 20 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin (परजीवी मध्यम). + GFP परजीवी के लिए चयन करने के लिए संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीग्राम / एमएल Blasticidin एस हाइड्रोक्लोराइड जोड़ें.
  2. 1% 2 हे, 4% सीओ 2 और 95% एन 2 के माहौल में 37 डिग्री सेल्सियस पर हवा तंग बक्से या वैकल्पिक रूप से डबल सील संस्कृति बोतल में संस्कृतियों सेते हैं.
  3. , पतली धब्बा स्लाइड तैयार करें 10 सेकंड के लिए 100% मेथनॉल में ठीक है, और 6.7 मिमी (पीएच 7.1) पेरासाइटिमिया नजर रखने के लिए 10 मिनट के लिए फॉस्फेट बफर (Giemsa समाधान) में 10% Giemsa समाधान के साथ दाग. धुंधला के बाद, पानी और हवा शुष्क में स्लाइड कुल्ला. एक 100X तेल विसर्जन लेंस का उपयोग पेरासाइटिमिया का आकलन करें.
  4. संस्कृतियों बंटवारे और असंक्रमित जोड़कर 5% संक्रमित आरबीसी नीचे एक पेरासाइटिमिया पर परजीवी संस्कृतियों को बनाए रखनेआरबीसी के रूप में आवश्यक.
  5. हेपरिन के साथ सिंक्रनाइज़ करने के लिए, संस्कृतियों चरण अंगूठी करने के लिए चिकित्सा ग्रेड हेपरिन की 20 आइयू / एमएल जोड़ें.
  6. परजीवी के बहुमत schizont चरण में होते हैं, तो 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली कोशिकाओं, schizont टूटना और merozoite आक्रमण की अनुमति देने के परजीवी माध्यम में हेपरिन युक्त मध्यम और resuspend हटा दें.
  7. 4 घंटे के बाद, किसी भी आगे merozoite आक्रमण अवरुद्ध, वापस संस्कृतियों के लिए 20 आइयू / एमएल हेपरिन जोड़ें. नोट: परजीवी पर्याप्त सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं पहले sorbitol और हेपरिन उपचार के कई चक्र की आवश्यकता हो सकती है. 5% parasitaemia - खंडजाणु की उपयुक्त संख्या उत्पन्न करने के लिए, 3 पर परजीवी संस्कृति के 150 मिलीलीटर तैयार करते हैं.

स्वर्गीय स्टेज पी. के 4. अलगाव फाल्सीपेरम ट्रोफोजोइट्स

  1. छत्तीस घंटे संस्कृतियों को हेपरिन लौटने के बाद, 5 मिनट के लिए 300 XG पर संवर्धित कोशिकाओं गोली, और 25% hematocrit पर परजीवी मध्यम में resuspend गोली.
  2. एक बड़े चुंबकीय स्तंभ (6.3 की मैट्रिक्स मात्रा अटैचमिलीलीटर) एक चुंबक के लिए, और सभी हवाई बुलबुले को हटा रहे हैं, यकीन है परजीवी माध्यम के साथ स्तंभ संतुलित करना.
  3. Resuspended पी. जोड़ें फाल्सीपेरम संस्कृति स्तंभ के लिए, और प्रति सेकंड एक बूंद के लिए प्रवाह दर को समायोजित.
  4. संस्कृति स्तंभ के माध्यम से पारित कर दिया गया है एक बार प्रवाह के माध्यम से स्पष्ट चलाता है जब तक, परजीवी माध्यम के साथ स्तंभ धो लो.
  5. 37 डिग्री सेल्सियस परजीवी माध्यम के 30 मिलीलीटर में स्तंभ से परजीवी Elute.
  6. परजीवी की एक पतली धब्बा तैयार करें 10 सेकंड के लिए 100% मेथनॉल में ठीक है, और 3 मिनट के लिए Giemsa समाधान के साथ दाग. खुर्दबीन के नीचे स्लाइड की जांच, और परजीवी लगभग लाल रक्त कोशिका को भरने, और जल्दी schizont चरणों में होना दिखाई देते हैं सुनिश्चित करते हैं. परजीवी उपयुक्त परिपक्वता चरण में पहुंच नहीं है, तो उपयुक्त रूप से विकसित किया है, जब तक 1% 2 हे, 4% सीओ 2 और 95% एन 2 के माहौल में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में शुद्ध परजीवी वापसी. नोट: 90% से अधिक संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं की पवित्रता आर सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैबीसी merozoite तैयारियों को दूषित नहीं है.
  7. . 10 माइक्रोन E64 6 (Epoxysuccinyl एल leucylamido (4 guanidino) ब्यूटेन (E64) के साथ अलग schizonts समझो - 10 घंटा नोट: E64 साथ अब ऊष्मायन बार संभव हो रहे हैं, लेकिन उत्पादन खंडजाणु को अब आक्रामक हो जाएगा.

पी. के 5. अलगाव फाल्सीपेरम खंडजाणु

  1. E64 के साथ ऊष्मायन के बाद, 100% मेथनॉल में कोशिकाओं को ठीक करने, और झिल्ली संलग्न खंडजाणु के गठन का आकलन करने के लिए Giemsa समाधान के साथ दाग, परजीवी धब्बा. नोट: परजीवी के 50% से अधिक झिल्ली संलग्न खंडजाणु का गठन किया है अगर खंडजाणु की अच्छी पैदावार प्राप्त हो जाएगा.
  2. गोली 8 मिनट के लिए 1,900 XG पर schizonts E64 इलाज. शेष मानव सीरम दूर करने के लिए आर टी RPMI 1640 मध्यम के 50 एमएल 25 मिलीग्राम / एमएल HEPES, 50 माइक्रोग्राम / एमएल hypoxanthine, 2 मिलीग्राम / एमएल सोडियम बाइकार्बोनेट, और 20 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin (धोने मध्यम) के साथ पूरक (7.4 पीएच) के साथ धोएं .
  3. धोने के माध्यम से 2 मिलीलीटर में गोली Resuspend. नोट: THP-1 मीडिया एफसीएस युक्त का उपयोग निस्पंदन दौरान झाग का उत्पादन होगा.
  4. एक 1.2 μm/32 मिमी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से resuspended E64-schizonts के 2 मिलीलीटर तक. एक 10 मिलीलीटर ट्यूब में छानना लीजिए. नोट: छानना फिल्टर में एकत्र संयुक्त राष्ट्र उठी schizonts और मलबे के साथ, खंडजाणु और hemozoin क्रिस्टल होते हैं.
  5. एक चुंबक के लिए एक छोटे चुंबकीय स्तंभ देते हैं, और 500 μl THP-1 मध्यम के साथ संतुलित करना.
  6. चुंबकीय स्तंभ पर छानना गुजरती हैं. प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए. नोट: खंडजाणु के माध्यम से समाप्त हो जाएगी जबकि hemozoin, स्तंभ के लिए बाध्य होगा.
  7. हर बार के माध्यम से प्रवाह का संग्रह, hemozoin दूर करने के लिए स्तंभ और दो बार से अधिक प्रवाह के माध्यम से गुजरती हैं.
  8. किसी भी शेष खंडजाणु एकत्र करने के लिए आर टी THP-1 मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ स्तंभ कुल्ला.
  9. 10 माइक्रोग्राम / एमएल (अंतिम एकाग्रता) और आरटी पर 30 मिनट के लिए दाग पर EtBr जोड़ें. Photobleaching को रोकने के लिए प्रकाश से सुरक्षित रखें. नोट: यह सुनिश्चित करें कि सभी EtBr दूषित तरल और पीlastic अपशिष्ट साइटोटोक्सिक रसायन के लिए उपयुक्त ढंग से निपटाया है. खंडजाणु इस ऊष्मायन के बाद अब कोई आक्रामक रहे हैं.
  10. 10 मिनट के लिए 4000 XG पर खंडजाणु स्पिन.
  11. उचित अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  12. 4 मिलीलीटर THP-1 मध्यम में merozoite गोली Resuspend, और 10 मिनट के लिए 4000 XG पर नीचे स्पिन.
  13. 15 मिलीलीटर की एक मात्रा को THP-1 मध्यम ऊपर जोड़ें, और प्रकाश से बचाने के लिए.

फ्लो द्वारा 6. बढ़ाता Merozoite एकाग्रता

  1. आर टी के लिए मोती गिनती लाओ.
  2. खंडजाणु गिराए के लिए 0.5% BSA के साथ पीबीएस तैयार करें.
  3. 3 dilutions पर खंडजाणु गिनती; 100 में 1; 50 में 1 और 25 में 1. क्रमश: पीबीएस 0.5% BSA के 940, 930 और 910 μl के साथ 3 FACS ट्यूबों तैयार करें. क्रमशः, ट्यूब प्रति शुद्ध खंडजाणु की 10, 20 और 40 μl जोड़ें.
  4. 30 सेकंड के लिए भंवर गिनती मोती, और पतला खंडजाणु युक्त FACS ट्यूब प्रति मोतियों की 50 μl जोड़ें.
  5. तीन दिल भागोएक प्रवाह पर uted merozoite नमूने कोशिकामापी एक 488 एनएम लेजर के साथ सुसज्जित. एक अलग चैनल में प्रतिदीप्ति द्वारा EtBr और GFP प्रतिदीप्ति दोहरी प्रतिदीप्ति पर आधारित खंडजाणु, और फाटक गिनती मोती के लिए एक कड़े गेट सेट करें. 2,000 मोती एकत्र कर रहे हैं जब तक की घटनाओं मोल. नोट: ये निर्देश EtBr साथ काउंटर से सना गया है कि GFP + खंडजाणु गिनती करने के लिए देखें. फिर ओर तितर बितर और EtBr प्रतिदीप्ति पर आधारित merozoite फाटकों सेट परजीवी व्यक्त GFP का उपयोग नहीं हैं.
  6. खंडजाणु के अनुपात का निर्धारण: 2,000 गिनती मनका घटनाओं से merozoite घटनाओं की संख्या से विभाजित करके मोती, प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए एक अनुपात की गणना. ट्यूब प्रति गयी मोतियों की 50 μl में मोतियों की संख्या निर्धारित करने के लिए गिनती मनका बैच विशिष्टताओं का प्रयोग करें.
  7. कमजोर पड़ने कारक द्वारा और merozoite द्वारा 50 μl में मोतियों की संख्या को गुणा: कि कमजोर पड़ने कारक के लिए मनका अनुपात. यह संख्या प्रति मिलीलीटर खंडजाणु की एकाग्रता के लिए equates. वें प्रदर्शन करनाप्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए कदम ese.
  8. तीन dilutions भर में मापा merozoite सांद्रता औसत. 50 में 100, 1 में 1 के लिए निर्धारित सांद्रता के लिए 10% से अधिक मानक विचलन, और 1 से 25 में dilutions गिनती नमूने तैयार करने में तकनीकी अशुद्धियों का संकेत: ध्यान दें.
  9. THP-1 सेल प्रति चार खंडजाणु के अंतिम अनुपात सुनिश्चित करने के लिए THP-1 मध्यम में 8 x 10 6 खंडजाणु / एमएल खंडजाणु Resuspend. THP-1 के अनुपात को अन्य merozoite इस्तेमाल किया जा सकता है, और सांद्रता तदनुसार संशोधित किया जाना चाहिए: नोट.

7. Phagocytosis परख

  1. 96 अच्छी तरह से यू नीचे प्लेटों के प्रति अच्छी तरह से गर्मी निष्क्रिय FCS के 200 μl जोड़ें, और प्लेट ब्लॉक करने के लिए आर टी ओ / एन पर छोड़ दें. ऊष्मायन के बाद, एफसीएस हटाने और 200 μl बाँझ पीबीएस के साथ दो बार कुओं धो लो. जब तक आवश्यक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस और दुकान प्लेटों निकालें.
  2. 1 एक्स 10 पर नमूना प्रति तीन प्रतियों कुओं की अनुमति, प्लाज्मा नमूनों और नियंत्रण का परीक्षण करने के लिए आवश्यक THP-1 कोशिकाओं की संख्या की गणना
  3. एक रुधिरकोशिकामापी स्लाइड करने पर संस्कृति के 10 μl लोड करके THP-1 संस्कृति एकाग्रता का निर्धारण. एक खुर्दबीन के नीचे लोहितकोशिकामापी की 16 कोने वर्ग के 4 सेट में मौजूद कोशिकाओं की संख्या की गणना, तो मायने रखता है औसत. मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए 10,000 से औसत गिनती गुणा करें.
  4. 5 मिनट के लिए 500 XG पर THP-1 कोशिकाओं की संख्या स्पिन, और THP-1 मध्यम में 6.7 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल में resuspend.
  5. 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से है, जिसके परिणामस्वरूप एक एफसीएस अवरुद्ध 96 अच्छी तरह से यू नीचे थाली को अच्छी तरह से प्रति THP-1 मध्यम में THP-1 कोशिकाओं के 150 μl जोड़ें. परीक्षण किया जाएगा कि नमूना प्रति 3 कुओं को तैयार है. खंडजाणु जोड़ने के लिए तैयार है जब तक इनक्यूबेटर थाली लौटें.
  6. अच्छी तरह से एक अलग एफसीएस अवरुद्ध 96 अच्छी तरह से यू नीचे की थाली के लिए 8 x 10 6 / मिलीलीटर प्रति पर merozoite तैयारी की 150 μl जोड़ें. का परीक्षण नमूना प्रति एक अच्छी तरह से तैयार करें
  7. टी करने के लिए, अच्छी तरह से प्रति तैयार पतला प्लाज्मा नमूनों की 10 μl जोड़ेंवह उस खंडजाणु शामिल थाली, और समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण.
  8. इनक्यूबेटर से THP-1 थाली निकालें, और प्लाज्मा नमूना प्रति तीन प्रतियों कुओं के साथ, अच्छी तरह से THP-1 कोशिकाओं से युक्त प्रति merozoite / प्लाज्मा समाधान के 50 μl जोड़ें.
  9. अच्छी तरह मिक्स, और 5% सीओ 2, 40 मिनट के लिए humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी के साथ कवर.
  10. 40 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस में 500 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नमूने phagocytosis गिरफ्तार करने के लिए अपकेंद्रित्र prechilled बाद.
  11. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और ठंडा पीबीएस 0.5% बीएसए 2 मिमी EDTA (FACS बफर) में कोशिकाओं को दो बार धो लो. नोट: EDTA प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए एक एकल कक्ष निलंबन को बनाए रखने में सुविधा होगी.
  12. पीबीएस 0.5% बीएसए 2 मिमी EDTA (FACS लगानेवाला) में 2% paraformaldehyde (पीएफए) के 90 μl में कोशिकाओं को ठीक करें. प्रकाश से रक्षा अधिग्रहण, जब तक बर्फ पर छोड़ दें.

8. फ्लो

  1. वाई सुसज्जित एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर नमूने मोलएक 488 एनएम लेजर और उच्च throughput प्लेट रीडर लगाव वें. नोट: यह एक merozoite तैयारी से परीक्षण किया जाना 400 प्लाज्मा नमूनों को सक्षम हो जाएगा. कोशिकाओं को भी मार्गदर्शन नमूना लोड करने के लिए ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सकता है.
  2. आगे और पक्ष बिखराव से गेट व्यवहार्य THP-1 कोशिकाओं.
  3. नियंत्रण 'खंडजाणु और कोई प्लाज्मा के साथ THP-1 कोशिकाओं' पर आधारित EtBr सकारात्मक गेट सेट करें.
  4. नमूना प्रति 10,000 की घटनाओं का एक न्यूनतम मोल.

9. डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry, और EtBr सकारात्मक घटनाओं के लिए कड़े फाटकों सेट का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण.
  2. गैर प्रतिरक्षा प्लाज्मा के साथ नमूना शून्य% सकारात्मक कोशिकाओं के लिए EtBr + कोशिकाओं का%: प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिशत phagocytosis की गणना.
  3. Triplicates भर में औसत परिणाम. नोट: 10% से अधिक में एक तीन प्रतियों के लिए मानक विचलन प्रयोगात्मक अशुद्धियों से संकेत मिलता है. कुछ पृष्ठभूमि EtBr सकारात्मक घटनाओं merozoi का एक परिणाम के रूप में देखा जा सकता हैते THP-1 कोशिकाओं की सतह के लिए आसंजन, लेकिन खंडजाणु युक्त सभी नमूनों भर में लगातार होना चाहिए. तब नियंत्रण 'THP-1 खंडजाणु और कोई प्लाज्मा के साथ' कोशिकाओं, और नियंत्रण 'गैर प्रतिरक्षा प्लाज्मा साथ THP-1 कोशिकाओं' के किसी भी पृष्ठभूमि घटाकर पर आधारित गेट स्थापना कारण भाँति प्रतिदीप्ति को दर्शाता है% phagocytosis में परिणाम होगा / केवल खंडजाणु phagocytosed.

Representative Results

पूर्व E64 इलाज के लिए परजीवी की परिपक्वता चरण झिल्ली संलग्न खंडजाणु पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है. चित्रा 1Ai E64 जोड़ने के लिए schizonts की उचित परिपक्वता चरण से पता चलता है. परजीवी बड़ा हो सकता है और लगभग लाल रक्त कोशिका को भरने चाहिए. Giemsa दाग का एक विचित्र उपस्थिति merogony शुरू हो गई है इंगित करता है, और E64 झिल्ली संलग्न खंडजाणु (चित्रा 1Aii) उपज के लिए जोड़ा जाना चाहिए. E64 मंच परजीवी trophozoite पहले जोड़ा जाता है, झिल्ली संलग्न खंडजाणु भी E64 के 12 घंटे के बाद उत्पन्न नहीं कर रहे हैं. इसके बजाय परजीवी ऐसे पाचन रिक्तिका (चित्रा 1Bi और 1Bii) की वृद्धि के रूप में असामान्य आकारिकी पर ले, और खंडजाणु का गठन नहीं कर रहे हैं. E64 schizonts को बाद में जोड़ा गया है, तो schizont टूटना (चित्रा 1Ci और 1Cii) uninhibited है, झिल्ली संलग्न खंडजाणु को तैयार नहीं हैं. परजीवी synchrony की एक उच्च स्तर की आवश्यकता है, अन्यवर्णित सभी तीन परिणामों के लिहाज से एक श्रृंखला E64 उपचार के बाद देखा जाएगा.

Hemozoin का हटाया सफ़ाई खंडजाणु के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है. खंडजाणु hemozoin से शुद्ध नहीं कर रहे हैं तो merozoite-hemozoin समूहों pipetting द्वारा उखाड़ फेंकना नहीं किया जा सकता जो फार्म. इन समुच्चय फ्लो (2A चित्रा) द्वारा गलत merozoite गिनती में जिसके परिणामस्वरूप, एकल खंडजाणु से अलग आगे तितर बितर और पक्ष बिखराव विशेषताओं के साथ यद्यपि, एकल घटनाओं के रूप में cytometer पर चलाते हैं. THP-1 कोशिकाओं को भी hemozoin phagocytose सकते हैं, इन merozoite-hemozoin समूहों भी चित्रा (2 बी) phagocytosed किया जा सकता है. वे कई खंडजाणु होते ही इन समुच्चय अत्यधिक EtBr फ्लोरोसेंट हैं. कई व्यक्ति खंडजाणु की phagocytosis के लिए मनाया है कि एक THP-1 EtBr प्रतिदीप्ति प्रोफाइल बराबर में समुच्चय के परिणाम की phagocytosis. Hemozoin हटा नहीं है इसलिए, अगर, THP-1 कोशिकाओं की EtBr प्रतिदीप्ति एक ओ हो जाएगाजांच की जा रही प्लाज्मा के लिए opsonizing क्षमता का verestimate. Hemozoin भी काफी भक्षककोशिकीय समारोह में परिवर्तन करने की सूचना दी है. GFP सकारात्मक खंडजाणु काउंटर THP-1 कोशिकाओं द्वारा phagocytosed खंडजाणु के दृश्य बढ़ाने के लिए EtBr साथ दाग रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों का उपयोग, सभी GFP सकारात्मक खंडजाणु एक उज्जवल प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 3) है जो EtBr साथ counterstained रहे हैं. EtBr प्रतिदीप्ति द्वारा phagocytosis मूल्यांकन GFP प्रतिदीप्ति (3B चित्रा) से merozoite phagocytosis के श्रेष्ठ संकल्प सक्षम बनाता है.

परख करने के लिए जोड़ा खंडजाणु की संख्या मनाया phagocytosis की राशि मिलाना होगा. इस कारण से, फ्लो द्वारा सटीक गिनती महत्वपूर्ण है. खंडजाणु का अनुपात बढ़ाने: THP-1 प्लाज्मा के अभाव में THP-1 कोशिकाओं को खंडजाणु की वृद्धि हुई पालन (चित्रा -4 ए) में परिणाम होगा. Merozoite बढ़ाने: THP-1 के अनुपात में भी वृद्धि हुई पीएच में परिणामagocytosis प्रतिक्रियाओं खंडजाणु (चित्रा 4 बी) opsonized रहे हैं. एक 4:1 merozoite: THP-1 अनुपात मजबूत phagocytic प्रतिक्रिया के लिए सिफारिश की है. इस अनुपात, और संकेत प्लाज्मा के कमजोर पड़ने का उपयोग करना, इस परख opsonizing एंटीबॉडी के, कम मध्यवर्ती और उच्च स्तर को हल करने में सक्षम है. 0 के बीच और 78 प्रतिशत phagocytosis प्रतिक्रियाओं पीएनजी प्लाज्मा नमूनों और वर्णित अन्य शर्तों का उपयोग मनाया गया है. इस तरह की प्रतिक्रियाओं हाल ही में. चित्रा 5 पीएनजी व्यक्तियों से phagocytosis प्रतिक्रियाओं के 4 चतुर्थकों के उदाहरण से पता चलता है मलेरिया से 10 स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया नैदानिक ​​उन्मुक्ति के साथ संबद्ध करने के लिए दिखाए जाते हैं.

चित्रा 1
E64 अलावा चित्रा 1. समय झिल्ली संलग्न खंडजाणु पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है. (ए) उपयुक्त maturatio. E64 अपरिपक्व परजीवी के लिए जोड़ा जाता हैं तो मैं) पिछले E64 इलाज के लिए परजीवी के चरण, और द्वितीय) E64 उपचार के 6 घंटे के बाद उत्पादन झिल्ली संलग्न खंडजाणु (बी) झिल्ली संलग्न खंडजाणु उत्पन्न नहीं कर रहे हैं; मैं) देर से मंच ट्रोफोजोइट्स, और E64 देर schizonts खंडों में जोड़ा जाता है, तो द्वितीय) E64 के 12 घंटे के बाद (सी) Schizont टूटना हिचकते नहीं है.; मैं) देर से मंच schizonts, और द्वितीय) E64 के 6 घंटे के बाद. स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Hemozoin हटाने hemozoin चुंबकीय खंडजाणु से अलग किया जाता है जब तक. Merozoite-hemozoin समुच्चय, झिल्ली संलग्न खंडजाणु की निस्पंदन निम्नलिखित फार्म एक एकल कोशिका merozoite निलंबन उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है. (ए) खंडजाणु के आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर भूखंडों के साथ hemozoin हटायाऔर hemozoin बनाए रखा. (बी) hemozoin-merozoite समुच्चय THP-1 कोशिकाओं द्वारा phagocytosed किया जा सकता है. पीएनजी प्लाज्मा के साथ incubated THP-1 कोशिकाओं की डिफ त्वरित दाग cyto स्पिन स्लाइड hemozoin साथ या बिना merozoite तैयारी opsonized. स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. Ethidium ब्रोमाइड धुंधला (ए) GFP सकारात्मक खंडजाणु पर gating साथ शुद्ध खंडजाणु की histrogram प्रवाह cytometry. D10-GFP शुद्ध खंडजाणु प्रतिदीप्ति तीव्रता में सुधार करने के लिए EtBr साथ counterstained रहे हैं. Merozoite phagocytosis का बेहतर समाधान के लिए अनुमति देता है, और EtBr दिखा एक डॉट धब्बा इस gated GFP सकारात्मक आबादी के भीतर प्रतिदीप्ति. (बी) GFP बनाम आगे तितर बितर और GFP और EtBr दोहरी फ्लोरोसेंट खंडजाणु की phagocytosis निम्नलिखित THP-1 कोशिकाओं की EtBr बनाम आगे तितर बितर. गेट्स चाहते थे Rawn खंडजाणु और कोई प्लाज्मा नियंत्रण के साथ THP-1 कोशिकाओं पर आधारित है.

चित्रा 4
चित्रा 4 merozoite:. THP-1 अनुपात मनाया phagocytosis की डिग्री को प्रभावित करती है. (ए) पांच merozoite: THP-1 के अनुपात में चित्रित कर रहे हैं; 50:1, 20:01, 10:01, 04:01, 01:01. कोशिकाओं ही नियंत्रण की वजह से THP-1 कोशिकाओं को पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति इंगित करता है. . प्रत्येक अनुपात के लिए THP-1 EtBr प्रतिदीप्ति (बी) विभिन्न merozoite के लिए THP-1 कोशिकाओं का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता पीएनजी प्लाज्मा का एक पूल के साथ या nonimmune ऑस्ट्रेलियाई प्लाज्मा के साथ opsonized खंडजाणु के लिए संकेत दिया जाता है: THP-1 के अनुपात, और एक पूल के साथ opsonization पीएनजी प्लाज्मा या nonimmune ऑस्ट्रेलियाई प्लाज्मा (+ SEM मतलब है) के. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

ove_content "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 5
चित्रा 5. Opsonizing एंटीबॉडी की एक बड़ी रेंज मापा जा सकता है. खंडजाणु पीएनजी व्यक्तियों से प्लाज्मा के साथ opsonized और THP-1 कोशिकाओं के साथ incubated रहे थे. चार प्रतिनिधि phagocytosis प्रतिक्रियाओं से पता चला रहे हैं. गेट्स खंडजाणु और कोई प्लाज्मा नियंत्रण के साथ THP-1 कोशिकाओं पर आधारित तैयार की, और संख्या गैर प्रतिरक्षा प्लाज्मा नियंत्रण के साथ THP-1 कोशिकाओं के घटाव के बाद% phagocytosis का संकेत कर रहे थे. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

Merozoite phagocytosis मापने के लिए, दो तकनीक में दक्षता की जरूरत है: खंडजाणु और THP-1 phagocytosis परख की शुद्धि. इन दो तकनीकों के संयोजन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) अति सिंक्रनाइज़ परजीवी; 2) झिल्ली संलग्न खंडजाणु उपज के लिए सही समय पर E64 जोड़ना; 3) समुच्चय से बचने के लिए hemozoin निकाला जा रहा है; फ्लो ने 4) सटीक merozoite गिनती; 5) का इस्तेमाल किया प्लाज्मा के कमजोर पड़ने; और 6) कम सेल घनत्व और THP-1 कोशिकाओं के पारित होने संख्या को बनाए रखने. इन महत्वपूर्ण पहलुओं पर सावधानी से विचार मजबूत phagocytosis प्रतिक्रियाओं मनाया जाता है यह सुनिश्चित करेंगे.

यहाँ वर्णित है, हालांकि phagocytosis का आकलन करने के लिए खंडजाणु की तैयारी है, तकनीक आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोग किया जा सकता है. चाहे डाउन स्ट्रीम कार्यप्रणाली के इष्टतम merozoite तैयारी सही ढंग से खंडजाणु उत्पन्न करने के क्रम में E64 इसके अलावा समय पर निर्भर करते हैं. यहाँ वर्णित E64 विधि Y दिखाया गया हैआक्रमण की घटनाओं और दवा संवेदनशीलता assays 15-20 के उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी में उपयोग के लिए आक्रामक खंडजाणु ield. Merozoite व्यवहार्यता phagocytosis के लिए आवश्यक नहीं है, merozoite सतह कोट की अखंडता के लिए आवश्यक है. इसलिए यहाँ वर्णित E64 विधि उच्च गुणवत्ता खंडजाणु सतह कोट करने के लिए एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए उत्पादन किया जा सकता है. E64 बहुत जल्दी गयी है या बहुत देर हो चुकी झिल्ली संलग्न खंडजाणु का गठन नहीं कर रहे हैं, चित्रा 1 में उल्लिखित. इस कारण से, अत्यधिक तुल्यकालिक परजीवी संस्कृतियों के लिए आवश्यक हैं. इधर, कसकर को sorbitol और हेपरिन उपचार के उपयोग 2 घंटा की एक खिड़की को D10-GFP परजीवी संस्कृतियों सिंक्रनाइज़ वर्णन किया गया है. हेपरिन अन्य प्रयोगशाला आइसोलेट्स में gametocytogenesis प्रोत्साहित कर सकते हैं, और इसलिए सावधानी से इस्तेमाल किया जाना चाहिए. ऐसे alanine के रूप में वैकल्पिक तुल्यकालन तरीकों में भी कसकर सिंक्रनाइज़ परजीवी 29 उत्पादन किया जाता है, बशर्ते कि इस्तेमाल किया जा सकता है. E64 अतुल्यकालिक परजीवी को जोड़ा जाता है, तो एक कम सहाराझिल्ली संलग्न खंडजाणु की ortion उत्पादन किया है और शेष आरबीसी सामान्य रूप से टूटना या असामान्य आकृति विज्ञान का विकास होगा या तो परजीवी से संक्रमित हो जाएगा. झिल्ली संलग्न खंडजाणु के रूप में विकसित नहीं किया है कि परजीवी की उपस्थिति फिल्टर के clogging में परिणाम और काफी प्राप्त merozoite उपज कम हो जाएगा.

झिल्ली संलग्न खंडजाणु की छानने के दौरान, hemozoin पाचन रिक्तिकाएं से मुक्त है और समाधान में मुफ्त क्रिस्टल के रूप में मौजूद है. Hemozoin अत्यधिक proinflammatory है और एककेंद्रकश्वेतकोशिका और बृहतभक्षककोशिका phagocytosis प्रतिक्रियाओं 30, 31 मिलाना करने के लिए सूचित किया गया है. चित्रा 2 में दिखाया गया है phagocytosis नियमन करने के अलावा,, hemozoin समाधान में खंडजाणु साथ समुच्चय के रूप में कर सकते हैं. THP-1 कोशिकाओं इन समुच्चय phagocytose सकते हैं, यह एंटीबॉडी मध्यस्थता phagocytosis के समाधान के लिए एक प्रमुख confounder हो सकता है. इसलिए, hemozoin को हटाने ए वी इस परख में आवश्यक हैभक्षककोशिकीय जीव विज्ञान पर hemozoin की OID अतिरिक्त जटिलता. Merozoite मात्रा का ठहराव आवश्यक है, खासकर जहां अन्य अनुप्रयोगों के लिए नि: शुल्क खंडजाणु उत्पन्न करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करते समय इसके अलावा, hemozoin दूर करने के लिए विफलता भी हानिकारक हो सकता है.

चित्रा 4 में उल्लिखित, खंडजाणु की संख्या THP-1 कोशिकाओं द्वारा phagocytosis की डिग्री को प्रभावित कर सकते परख करने के लिए जोड़ा. फ्लो merozoite एकाग्रता, सावधान pipetting और खंडजाणु की गणना को दोहराने की गणना के लिए अनुमति देता है हालांकि सटीकता में सुधार के लिए आवश्यक हैं. कई परजीवी लाइनों पक्ष द्वारा साइड का परीक्षण किया जाना है अगर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. यह पहले से प्रतिक्रियाओं 23 में गिरावट से पहले पीएनजी से अर्द्ध प्रतिरक्षा बच्चों से प्लाज्मा काफी पतला किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया है. Phagocyt की बड़ी रेंज का उत्पादन किया है कि 12 वर्षीय पीएनजी बच्चों - 5 की एक पलटन के लिए प्लाज्मा के इष्टतम कमजोर पड़ने (1/120, प्लाज्मा के 000 अंतिम कमजोर पड़ने) यहाँ है वर्णित. (- 19%, 20-39%, 40-59% और 60 - 0 79% phagocytosis) चित्रा 5 में वर्णित Osis प्रतिक्रियाएं इस श्रृंखला को चार समूहों में प्रतिक्रियाओं के स्तरीकरण के लिए अनुमति दी, और प्रतिगमन मॉडलिंग opsonizing प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़े थे कि पता चला विभिन्न पलटन के लिए नैदानिक ​​रोग और उच्च घनत्व parasitaemia 10 से सुरक्षा या पता लगाने के स्तर से नीचे संतृप्त नहीं है यह THP-1 कोशिकाओं द्वारा phagocytosis सुनिश्चित करने के लिए प्लाज्मा कमजोर पड़ने समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है अध्ययन करता है.

फ्लो माइक्रोस्कोपी पर सुधार सटीकता के साथ तेजी से और quantifiable phagocytosis की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल एक उच्च throughput, थाली आधारित है और स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया humoral रोगक्षमता अध्ययन करने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों के अधिग्रहण से स्वचालित है. विधि ऐसे SYBRgreen, DAPI और propidium आयोडीन, झिल्ली दाग ​​या प्रोटीन दाग के रूप में हालांकि वैकल्पिक डीएनए दाग उपयोग किया जा सकता है, ethidium ब्रोमाइड के साथ खंडजाणु की धुंधला की आवश्यकता है. यह परख primar करने के लिए उत्तरदायी होगाभक्षककोशिकीय या FCR जीव विज्ञान ब्याज की थी, तो Y monocytes या neutrophils, और अनुकूलित किया जा सकता है. पीएमए के साथ इन विट्रो में भेदभाव प्राथमिक कोशिकाओं या THP-1 कोशिकाओं मलेरिया और अन्य रोगजनकों 12, 32-34 में phagocytosis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन कोशिकाओं को पक्षपाती हैं और भी गैर एंटीबॉडी मध्यस्थता phagocytosis 35 प्रदर्शित हालांकि प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इसके अलावा, शुद्धता, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता में परिवर्तनशीलता प्राथमिक phagocytic कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. Merozoite phagocytosis में शामिल एफसी रिसेप्टर्स uncharacterized बने हुए हैं, और इसलिए विशिष्ट एफसी रिसेप्टर्स के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध phagocytosis merozoite करने के लिए प्रत्येक एफसी रिसेप्टर के योगदान को स्पष्ट कर सकता का उपयोग कर. THP-1 phagocytosis FCR निर्भर करता है, इस मनाया phagocytosis की सीधी व्याख्या में सक्षम बनाता है. यह परख भी स्रोतों के उपयोग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो एंटीबॉडी opsonizing के प्रतिजन विशिष्टता को संबोधित करने के लिए उधार देता हैmerozoite सतह प्रतिजनों के लिए नाक आउट परजीवी izing, या सतह प्रोटीन merozoite को समानता विशुद्ध मानव एंटीबॉडी का उपयोग. इसके अलावा, गहराई में merozoite phagocytosis निम्नलिखित साइटोकाइन प्रतिक्रियाओं की पढ़ाई कमी कर रहे हैं, और इस परख का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.

इन दोनों तकनीकों कार्यात्मक antimerozoite एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए काफी अग्रिमों का गठन. उच्च गुणवत्ता खंडजाणु की शुद्धि cryopreserved खंडजाणु, या merozoite एंटीजन के साथ लेपित फ्लोरोसेंट microspheres का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है. इस परख स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया उन्मुक्ति के मूल्यांकन के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है, यह टीकाकरण के जवाब में प्रतिरोधक क्षमता के अधिग्रहण के समाधान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो सकता है. यह हाल ही में phagocytosis या opsonised खंडजाणु नैदानिक ​​मलेरिया से बचाव के साथ जुड़ा हुआ है कि दिखाया गया है, उस में विवो phagocyto के लिए इन विट्रो THP-1 phagocytosis से सीधा निष्कर्ष निकालना संभव नहीं हैइस परख में phagocytosis रूप खंडजाणु की बहन स्थिर परिस्थितियों में और लाल रक्त कोशिकाओं प्रतिस्पर्धा के अभाव में होता है. इस परख की संभावित रूपांतरों इस प्रकार मलेरिया और merozoite phagocytosis के आगे समझने के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान कर सकता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों बच्चों और वयस्क प्लाज्मा दाताओं, और चिकित्सा अनुसंधान के पापुआ न्यू गिनी संस्थान में स्टाफ स्वीकार करना चाहते हैं. लेखकों के लिए इस तकनीक के विकास के लिए उनके योगदान के लिए एमेंडीन बी Carmagnac, कैथरीन क्यू एनआईई, डैनी डब्ल्यू विल्सन, इवो म्यूएलर और डायना एस हैनसेन का शुक्रिया अदा करना, और रक्त और सीरम पैक के लिए ऑस्ट्रेलियाई रेड क्रॉस शुक्रिया अदा करना होगा. इस काम विक्टोरियन राज्य सरकार आपरेशनल बुनियादी सुविधाओं का समर्थन और ऑस्ट्रेलियाई सरकार NHMRC IRIISS के माध्यम से संभव बनाया गया था. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया # 1031212 और # 637,406 अनुदान, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान का अनुदान # AI089686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
THP-1 cell line American Type Culture Collection TIB-202
RPMI-1640 Gibco 31800-089
Fetal Calf Serum (FCS) Invitrogen 10099-141
2-mercapthoethanol  Sigma-Aldrich M6250-100ML Use in Fume Hood
Pen/Strep Solution (100x) Sigma P0781
HEPES SAFC 90909C Cell culture grade
Hypoxanthine Calbiochem 4010
Human Serum  Donation from Australian Red Cross Available commercially (i.e. Invitrogen)
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 1.06329.0500
Gentamycin Pfizer 61022027 Injection Quality
Heparin Sodium BP (5000 IU/ml) Pfizer Porcine origin
Blasticidin S-hydrochloride Sigma-Aldrich 15205
D-Sorbitol Sigma-Aldrich 50-70-4
E64 Protease Inhibitor Sigma-Aldrich E3132-10MG
KH2PO4 Sigma-Aldrich 98281-100G Use for phosphate buffer
Na2HPO4.2H20 Merck 10383.4G Use for phosphate buffer
Giemsa's azur eosin methylene blue solution Merck 1.09204.0500 1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain)
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1 M, pH 7.2
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm Pall Life Sciences 4656
QuadroMACS Separator (for small column) MACS Miltenyi BioTec 130-091-051 Interchangeable with MidiMACS 
VarioMACS Separator (for large columns) MACS Miltenyi BioTec 130-090-282
MACS MultiStand MACS Miltenyi BioTec 130-042-303
LS Column (small magnetic column) MACS Miltenyi BioTec 130-042-401
Large magnetic column MACS Miltenyi BioTec 130-041-305
Ethidium Bromide Bio-Rad 1510433 Cytotoxic
CountBright Absolute Counting Beads Invitogen C36950
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader BD Biosciences
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1 M, pH 7.2
FlowJo cytometry analysis software Tree Star

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इम्यूनोलॉजी अंक 89 परजीवी रोग मलेरिया, Hemozoin एंटीबॉडी एफसी रिसेप्टर opsonization merozoite phagocytosis THP-1
हाई यील्ड शोधन की<em&gt; प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emOpsonizing एंटीबॉडी Assays में इस्तेमाल के लिए&gt; खंडजाणु
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Hill, D. L., Eriksson, E. M.,… More

Hill, D. L., Eriksson, E. M., Schofield, L. High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays. J. Vis. Exp. (89), e51590, doi:10.3791/51590 (2014).

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