Summary
Att mäta antikroppsfunktion är nyckeln till att förstå immunitet mot Plasmodium falciparum malaria. Denna metod avser rening av livskraftiga merozoites, och mätning av opsonisering beroende fagocytos med flödescytometri.
Abstract
Plasmodium falciparum merozoite antigener är under utveckling som potentiella malariavaccin. En aspekt av immunitet mot malaria är att avlägsna fria merozoiter från blodet genom fagocytceller. Men att bedöma den funktionella effekten av merozoite specifika opsoniserande antikroppar är en utmaning på grund av den korta halveringstiden för merozoites och variationen av primära fagocytceller. Beskrivs i detalj häri är en metod för att generera viabla merozoiter med användning av E64-proteasinhibitor, och en analys av merozoit opsonin beroende fagocytos med hjälp av den pro-monocytiska cellinjen THP-1. E64 förhindrar schizont bristning samtidigt som utvecklingen av merozoites som frigörs genom filtrering av behandlade schizonter. Etidiumbromid märkta merozoites är opsoniserad med humana plasmaprover och läggs till THP-1-celler. Fagocytos bedöms av en standardiserad hög genomströmning protokoll. Livskraftiga merozoiter är en värdefull resurs för att bedöma numerOU aspekter av P. falciparum biologi, inklusive bedömning av immunförsvaret. Antikroppsnivåerna mäts av denna analys är förknippade med klinisk immunitet mot malaria i naturligt utsatta individer. Analysen kan också vara till användning för att bedöma vaccin inducerade antikroppar.
Introduction
Betydelsen av antikroppar för immunitet mot Plasmodium falciparum malaria visades för 40 år sedan, när immunglobulin från hyperimmuna vuxna var passivt överföras till barn som lider av svår malaria resulterar i lindras sjukdom 1. Följaktligen har stora ansträngningar försökt att identifiera mål för skyddande malariaimmunitet, främst genom att mäta antikroppstitrar till peptider eller bakteriellt uttryckta proteiner med ELISA. ELISA baserad serologi har också visat sig vara mycket varierande mellan studierna, och tar inte upp antikropps funktionalitet 2. Många malariaantigener inducera en cytophilic IgG1 och IgG3 antikroppsprofil, särskilt merozoite ytantigenerna 3. Denna underklass partiskhet antyder att antikropp-Fc-receptor (FcR) interaktioner med fagocyter är viktiga för effektorfunktionerna för opsoniserande antimerozoite antikroppar 4. Flera merozoit antigen vaccin under utveckling är utformade för attframkalla phagocyte effektorfunktioner 5, 6 och även om betydande bevis för betydelsen av antikropps-FcR interaktioner i modeller av gnagare malaria existerar 7-9, och några nya studier stöder betydelsen av funktionella antikroppar och phagocyte effektorfunktioner för immunitet mot malaria hos människor 10, 11, förblir detta område dåligt undersökta. Studie i merozoite specifika opsoniserande antikroppar har begränsats av två faktorer; svårigheten att isolera god kvalitet merozoites; och variabla fagocytos svar från primära celler.
Fram till nyligen var höghastighetscentrifugering eller Percoll densitetsgradienter utnyttjas för att isolera merozoiter från odlingssupernatanter av bristning schizont kulturer. Dessa merozoites var sällan lönsamt, och ofta ytterligare manipuleras genom densitetscentrifugering och flera tvättsteg 12, eller frysförvaring 11 före användning i analyser. Dessa proccesser potentiellt loss många perifert associerade proteiner från merozoite ytan, proteiner som är kända för att vara antigena mål för malaria immunitet 13. Nyligen cysteinet proteasinhibitor trans Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butan (E64) har använts för att generera viabla merozoiter. E64 förhindrar schizont bristning, genererar membran bifogade merozoites 14, som kan störas av filtrering för att frigöra livskraftiga merozoites 15, 16. Denna teknik har lett till den rumsliga upplösningen i många proteiner under erytrocyt invasionen 15, 17-19 och har klar scenen specifik effekt av flera läkemedel mot malaria 16, 20. Men uppkomsten av livskraftiga merozoites fortfarande tekniskt utmanande. För att underlätta spridningen av denna teknik och tillämpning av funktionella analyser av immunitet, ett detaljerat protokoll för livskraftig merozoit rening och deras användning i ettstandardiserad funktionell analys av antikropps: cellulär samarbete opsonisering och fagocytos beskrivs här.
Denna teknik visar ett stort framsteg jämfört med tidigare analyser in vitro av merozoit opsonization såsom neutrofila respiratory burst, antikroppsberoende cellulär Inhibition (ADCI), och alternativa merozoit fagocytos analyser. Dessa analyser är dåligt reproducerbar beroende på variation i parasit ingångar och aktiviteten av primära fagocytiska celler 11, 21. Förorenande hemozoin kan också grunden påverka fagocytfunktionen 22. En nyligen rapporterat robust och reproducerbar merozoit fagocytos analys 23 utnyttjar promonocytic cellinje THP-1 24. Detta är en idealisk celltyp för hög genomströmning flödescytometri analyser eftersom det är icke-vidhäftande och specifikt utför Fc-receptorförmedlad fagocytos 25, 26. En ytterligare komplexitet samtidigt som investeraretigating fagocytos är att graden av fagocytos är beroende av det antal merozoiter i förhållande till THP-1-celler och plasmakoncentration. För att säkerställa reproducerbarhet mellan experiment, bör merozoites räknas upp och en definierad koncentration som används. På grund av sin ringa storlek, flödescytometrisk kvantifiering krävs.
Det förfarande som beskrivs här tar bort hemozoin och skapar livskraftiga merozoites, och beskriver en tillämpning av dessa merozoites för flödescytometrisk räkning av merozoites följt av opsonisering och fagocytos. Även tekniskt krävande, kan den teknik som beskrivs vara användbar för att belysa bidrag merozoit yta specifikt antikroppssvar på naturligt förvärvad och vaccin inducerad immunitet.
Protocol
NOTERA: Alla steg, förutom att centrifugering och flödescytometri, bör utföras inom en huv med laminärt flöde för att upprätthålla sterilitet. Se till lämpliga försiktighetsåtgärder vidtas avseende hanteringen av prover från människa. Analysen är mycket känslig för små mängder av plasma. De spädningar som är optimal för att lösa svar som sträcker sig från 5 till 78% med plasma från semi-immuna barn från Papua Nya Guinea (PNG). Den optimala utspädningen kan variera med plasma-apparater som testas, och därför rekommenderas att plasma titreras för att bestämma experimentella förhållanden för varje applikation. Se till att inkludera 2 negativa kontroller THP-1-celler med merozoites i frånvaro av plasma; och THP-1-celler med merozoiter opsoniserad med en pool av plasma från malaria naiva individer. Detta kommer att möjliggöra kontroll för merozoit anslutning till THP-1 celler och för att möjliggöra noggrann flödescytometri slussning av fagocytos händelser.
Användningen av PNG-plasmaprover vargodkänts av Vetenskaps rådgivande kommittén, Papua Nya Guinea hälsoministeriet, Walter och Eliza Hall Institute Human forskningsetiska kommittén (projektnummer 04/04). Skriftligt samtycke erhölls från föräldrar / vårdnadshavare för alla deltagare.
1. THP-1 Kultur
- Bibehåll den humana monocytiska cellinjen THP-1 i RPMI-1640-medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS) och 55 | aM 2-mercapthoethanol (THP-1-medium) och vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad inkubator.
- Behåll cellerna vid en densitet under 5 x 10 5 celler / ml. NOTERA: överväxt kommer att resultera i differentiering till adherenta celler och nedreglering av Fc-receptorer. När cellerna har passe cirka 10 gånger, tina en ny flaska för att upprätthålla cellens fenotyp.
2. Antikroppsprovberedning och späd
- Värme inaktivt plasma som ska testas och malaria-naiva kontrollplasma genom inkubation vid 56 °; C under 30 min
- Seriellt utspädda plasmaprover till 1/2, 000 i THP-1-medium.
- Butiks utspädd plasma vid -20 ° C.
3. Kultur av lång Synkroniserad P. falciparum
OBS: GFP-uttryckande parasit linje D10-PfPHG 27 utnyttjades på grund av dess 48 h livscykel som hjälper synkronisering av parasiter och kontrollerade tidpunkten för E64 tillägg. Dessutom, eftersom denna linje uttrycker GFP i cytosolen, denna linje tillåter detektion av parasitemin och gratis merozoites genom flödescytometrisk detektion av GFP. Emellertid är den GFP-fluorescensintensiteten inte tillräcklig för att tillhandahålla visualisering i THP-1-celler, och därför är merozoiter motfärgades med etidiumbromid (EtBr). Andra parasitstammar kan användas, förutsatt att snäva synkronisering är möjligt. Synkronisera parasiter med hjälp av en kombination av sorbitol behandling för att lysera mogna former 28 och heparin för att förhindra invasionen 15
- Bibehåll P. falciparum-parasiter i O + humana erytrocyter (RBC) vid 3% hematokrit i RPMI-1640 medium (pH 7,4) kompletterat med 25 mg / ml HEPES, 50 | ig / ml hypoxantin, 10% sammanslaget humant serum, 2 mg / ml natriumbikarbonat och 20 mikrogram / ml gentamycin (Parasite medium). Lägg till 5 mg / ml Blasticidin S-hydroklorid till odlingsmediet för att selektera för GFP + parasiter.
- Inkubera kulturer i lufttäta lådor eller alternativt dubbel slutna odlingskolvar vid 37 ° C i en atmosfär av 1% O2, 4% CO2 och 95% N2.
- Förbered tunna smear slides, fixa i 100% metanol i 10 sek, och fläcken med 10% Giemsa lösning i 6,7 mM (pH 7,1) fosfatbuffert (Giemsalösning) under 10 minuter för att övervaka parasitemia. Efter färgning skölj glida i vatten och lufttorka. Bedöma parasitemia med hjälp av en 100X oljeimmersionslins.
- Behåll parasit kulturer på ett parasitemia under 5% infekterad RBC genom att dela upp kulturer och lägga oinfekteradeRBC efter behov.
- Om du vill synkronisera med heparin, lägga 20 IU / ml av medicinsk kvalitet heparin till ring-stegs kulturer.
- När majoriteten av parasiter är i schizont skede pellets cellerna vid 300 x g under 5 min, avlägsna heparin-innehållande medium och återsuspendera i parasit-medium för att tillåta schizont bristning och merozoit invasion.
- Efter 4 timmar, tillsätt 20 IU / ml heparin tillbaka till kulturer, blockera ytterligare merozoit invasion. OBS: Flera cykler av sorbitol och heparinbehandling kan krävas innan parasiter är tillräckligt synkroniserade. För att generera lämpliga mängder merozoites, förbereda 150 ml parasitkultur till 3 - 5% parasitemin.
4. Isolering av Late Stage P. falciparum Trophozoites
- Trettiosex timmar efter åter heparin till kulturer, pelle odlade cellerna vid 300 x g under 5 min och återsuspendera pelleten i parasit-medium vid 25% hematokrit.
- Bifoga en stor magnetisk kolonn (matrisvolym på 6,3ml) till en magnet, och jämvikt kolumnen med parasiten mediet, vilket gör att alla luftbubblor avlägsnas.
- Lägg det omblandade P. falciparum kultur till kolonnen, och justera flödeshastigheten till en droppe per sekund.
- När kulturen har passerat genom kolonnen, tvätta kolonnen med parasiten mediet tills genomströmning är klart.
- Eluera parasiter från kolonnen i 30 ml av 37 ° C parasit medium.
- Bered en tunn utstryk av parasiter, fixera i 100% metanol under 10 sekunder och färgas med Giemsa-lösning i 3 min. Undersök bilden i mikroskop, och se till att parasiter fyller nästan den röda blodkroppar, och verkar vara i tidiga schizont skeden. Om parasiterna inte har nått rätt mognad skede återgå renade parasiter till en 37 ° C inkubator i en atmosfär av 1% O 2, 4% CO2 och 95% N2 tills välutvecklad. OBSERVERA: renhet större än 90% infekterade röda blodceller krävs för att säkerställa RKand. inte förorenar merozoite förberedelser.
- Behandla isolerade schizonter med 10 pM E64 (Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butan (E64) under 6-10 tim. OBSERVERA: Längre inkubationstider med E64 är möjliga, men de merozoiter som produceras kommer inte längre att vara invasiva.
5. Isolering av P. falciparum merozoiter
- Efter inkubation med E64, smeta parasiter, fix-celler i 100% metanol, och fläcken med Giemsa-lösning för att bedöma bildningen av membran-innesluten merozoiter. OBS: En god avkastning på merozoites erhålls om mer än 50% av parasiter har bildat membran slutna merozoites.
- Pellet E64 behandlade schizonter vid 1900 x g under 8 min. Tvätta med 50 ml av RT RPMI-1640-medium (pH 7,4) kompletterat med 25 mg / ml HEPES, 50 | ig / ml hypoxantin, 2 mg / ml natriumbikarbonat och 20 ug / ml gentamycin (tvättmedium) för att avlägsna kvarvarande humant serum .
- Återsuspendera pelleten i 2 ml tvättmedium. OBS: Om du använder FCS-innehållande THP-1 media kommer att producera skumning under filtreringen.
- Filtrera de 2 ml återsuspenderat E64-schizonter genom en 1,2 μm/32 mm sprutfilter. Samla upp filtratet i ett 10 ml rör. OBS: Filtratet innehåller merozoites och hemozoin kristaller, med un-spruckit schizonter och skräp som samlas i filtret.
- Fäst en liten magnetisk kolumn till en magnet, och jämvikt med 500 l THP-1 medium.
- Passera filtratet över den magnetiska kolonnen. Samla genomströmning. Anmärkning hemozoin kommer att binda till kolonnen, medan merozoiter kommer att passera genom.
- Passera genomflödet över kolonnen två gånger till för att avlägsna hemozoin, samla flödet genom varje gång.
- Skölj kolonnen med 2 ml RT THP-1 medium för att samla in eventuella kvar merozoites.
- Lägg EtBr på 10 mikrogram / ml (slutlig koncentration) och fläcken i 30 min vid RT. Skyddas mot ljus för att förhindra fotoblekning. OBS: Se till att alla EtBr förorenad vätska och pLastic avfallet bortskaffas på ett sätt som lämpar sig för cytotoxiska kemikalier. Merozoites inte längre invasiva följa denna inkubation.
- Spinn ner merozoites vid 4000 xg under 10 minuter.
- Kassera supernatanten i lämplig avfallsbehållare.
- Resuspendera merozoit pelleten i 4 ml THP-1 medium och spinn ner vid 4000 xg under 10 minuter.
- Lägg till THP-1-medium till en volym av 15 ml, och skyddas mot ljus.
6. Kvantifiera merozoite Koncentration av flödescytometri
- Ta räkna pärlor till RT.
- Förbered PBS med 0,5% BSA för att späda merozoiter.
- Räkna merozoites på 3 spädningar; 1 i 100; 1 av 50 och 1 av 25. Förbered 3 FACS rör med 940, 930 och 910 l PBS 0,5% BSA, respektive. Lägg 10, 20 och 40 | il av renade merozoiter per rör, respektive.
- Vortex räkna pärlor för 30 sek, och tillsätt 50 l av pärlor per FACS rör innehållande utspädda merozoites.
- Kör tre dileras merozoite proverna på en flödescytometer utrustad med en 488 nm laser. Ställ en stringent grind för merozoites baserade på EtBr och GFP fluorescens dubbla fluorescens, och gate räkna pärlor genom fluorescens i en separat kanal. Förvärva händelser fram till 2000 pärlor samlas. OBS: Dessa instruktioner avser räkna GFP + merozoites som har mot-färgade med EtBr. Om inte utnyttja GFP uttrycka parasiter sedan som merozoite grindar baserade på sidospridning och EtBr fluorescens.
- Bestäm förhållandet merozoites: pärlor genom att dividera antalet merozoite händelser av 2000 räknar pärla händelser, beräkna ett förhållande för varje utspädning. Använd räknings pärla sats specifikationer för att bestämma antalet pärlor i 50 l av pärlor tillsatta per rör.
- Multiplicera antalet pärlor i 50 | il med spädningsfaktorn och av merozoite: bead-förhållande för att utspädningsfaktorn. Detta antal är lika med koncentrationen av merozoiter per ml. Utför these steg för varje utspädning.
- Medelvärdet merozoite koncentrationer som uppmätts i de tre utspädningar. OBS: Standard avvikelser på över 10% för halter som bestäms i 1 i 100, 1 i 50, och 1 i 25 späd indikerar tekniska felaktigheter i förberedelserna räkna prover.
- Resuspendera merozoites på 8 x 10 6 merozoites / ml i THP-1 medium för att säkerställa ett slutligt förhållande av fyra merozoites per THP-1-cell. OBS: Annan merozoite till THP-1-förhållanden kan användas, och halterna bör ändras i enlighet därmed.
7. Fagocytos analys
- Lägg till 200 l av värme inaktiva FCS per brunn av 96 väl U-bottenplattor, och lämna vid RT O / N för att blockera plattorna. Efter inkubation, ta bort FCS och tvätta brunnarna två gånger med 200 l steril PBS. Avlägsna PBS och lagra plattorna vid 4 ° C tills de behövdes.
- Beräkna antalet av THP-1-celler som krävs för att testa plasmaprover och kontroller, så att tredubbla brunnar per prov vid 1 x 10
- Bestäm THP-1 kultur koncentration genom att ladda 10 l av kultur på en hemocytometer bild. Räkna antalet celler som finns i 4 uppsättningar av 16 hörn torg i hemocytometer i mikroskop, då i genomsnitt räkningarna. Multiplicera den genomsnittliga räkningen med 10000 för att beräkna antalet celler per ml.
- Centrifugera ner nödvändigt antal THP-1-celler vid 500 x g under 5 min och resuspendera vid 6,7 x 10 5 celler / ml i THP-1-medium.
- Addera 150 pl av THP-1-celler i THP-1-medium per brunn i ett FCS-blockerad 96 brunnars U-bottnad platta, vilket resulterar i 10 5 celler / brunn. Förbered tre brunnar per prov som ska testas. Återgå plattan inkubator tills den ska lägga merozoites.
- Tillsätt 150 l av merozoit förberedelse på 8 x 10 6 / ml per brunn till en separat FCS-blockerad 96 och U-bottenplatta. Förbered en brunn per prov testas
- Tillsätt 10 l av preparerade utspädda plasmaprover per brunn, till tHan platta som innehåller merozoites, och blanda väl för att säkerställa homogen lösning.
- Avlägsna THP-1 platta från inkubatorn, och tillsätt 50 ìl av merozoite / plasma-lösning per brunn innehållande THP-1-celler, med tre brunnar per plasmaprov.
- Blanda väl och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2 fuktad inkubator under 40 minuter. Täck med folie för att skydda mot ljus.
- Efter 40 min, centrifug prover för 5 min vid 500 x g i en 4 ° C kyld centrifug för att gripa fagocytos.
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellerna två gånger i iskall PBS 0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS-buffert). OBSERVERA: EDTA kommer att underlätta att bibehålla en enkelcellsuspension för flödescytometrianalys.
- Fix celler i 90 l av 2% paraformaldehyd (PFA) i PBS + 0,5% BSA 2 mM EDTA (FACS fixeringsmedel). Lämna på is fram till förvärv, skyddat från ljus.
8. Flödescytometri
- Skaffa prover med användning av en flödescytometer utrustad with en 488 nm laser och hög kapacitet fästplattläsare. OBS: Detta kommer att göra det möjligt för upp till 400 plasmaprover som ska testas från ett merozoit förberedelse. Celler kan också överföras till rör för manuell laddning av prov.
- Gate livskraftiga THP-1 celler genom framåt-och sidospridning.
- Ställ EtBr positiv grind grundat på "THP-1-celler med merozoiter och inga plasmakontroll.
- Skaffa minst 10.000 evenemang per prov.
9. Dataanalys
- Analysera data med hjälp av flödescytometri analys programvara, och ställa stränga portarna för EtBr positiva händelser.
- Beräkna procentandelen fagocytos för varje prov: den% av EtBr + celler för provet minus% positiva celler med icke-immun plasma.
- Genomsnittliga resultat i tre exemplar. OBS: Standardavvikelser för en tre exemplar på över 10% indikerar experimentella felaktigheter. Vissa bakgrunds EtBr positiva händelser kan observeras som en följd av merozoite vidhäftning till ytan av THP-1-celler, men bör vara enhetligt för alla prover som innehåller merozoites. Ställa grinden utifrån de "THP-1 celler med merozoites och ingen plasma-kontroll, och sedan subtrahera någon bakgrund av de" THP-1-celler med icke-immunplasma "kontroll resulterar i% fagocytos som speglar fluorescensen på grund av internaliserade / fagocyteras endast merozoiter.
Representative Results
Den mognadsstadiet av parasiter innan E64 behandling är avgörande för att generera membraninneslutna merozoites. Figur 1ai visar lämplig mognadsstadiet av schizonter för att lägga till E64. Parasiterna bör vara stor och nästan fylla den röda blodkroppen. En fläckig utseende Giemsa fläcken tyder merogony har påbörjats, och E64 bör läggas för att ge membran slutna merozoites (Figur 1Aii). Om E64 läggs tidigare att trophozoite scen parasiter, är membraninneslutna merozoites genereras inte ens efter 12 timmar av E64. Istället parasiter ta på onormal morfologi såsom utvidgning av matsmältnings vacuole (Figur 1Bi och 1Bii), och merozoiter bildas inte. Om E64 läggs senare till schizonter är membraninneslutna merozoites inte genereras som schizont bristning ohämmad (Figur 1Ci och 1Cii). En hög nivå av parasit synkront krävs, andravis en rad alla tre utfall som beskrivs kommer att ses efter E64 behandling.
Borttagning av hemozoin är ytterligare ett viktigt steg för att rena merozoites. Om merozoiter inte renas från hemozoin sedan merozoit-hemozoin kluster bildas som inte kan rubbas genom pipettering. Dessa aggregat köras på cytometern som enstaka händelser, om än med olika framåtspridning och sidospridningsegenskaper än enstaka merozoiter, vilket resulterar i felaktig merozoit räkning genom flödescytometri (Figur 2A). Eftersom THP-1-celler kan också phagocytose hemozoin kan dessa merozoite-hemozoin kluster också fagocyteras (Figur 2B). Dessa aggregat är mycket EtBr fluorescerande eftersom de innehåller flera merozoites. Fagocytos av aggregat ger en THP-1 EtBr fluorescens profil som motsvarar den som observerades för fagocytos av flera enskilda merozoiter. Därför, om hemozoin inte tas bort, kommer EtBr fluorescens av THP-1-celler vara en overestimate av opsoniserande potentialen för plasman som skall testas. Hemozoin rapporteras också att signifikant ändra fagocytfunktionen. GFP-positiva merozoiter är motfärgades med EtBr öka visualisering av merozoiter fagocyteras av THP-1-celler. Med hjälp av de villkor som beskrivs i detta protokoll är alla GFP positiva merozoites motfärgas med EtBr som har en ljusare fluorescensintensitet (figur 3A). Fagocytos bedömning EtBr fluorescens möjliggör överlägsen upplösning på merozoit fagocytos än GFP fluorescens (Figur 3B).
Antalet merozoiter till analys modulerar mängden fagocytos observeras. Av denna anledning är korrekt räkna med flödescytometri kritisk. Ökande förhållanden av merozoiter: THP-1 resulterar i ökad vidhäftning av merozoiter till THP-1-celler i frånvaro av plasma (Figur 4A). Ökad merozoite: THP-1-förhållanden även resulterar i ökad phagocytosis svar när merozoites är opsoniserad (Figur 4B). A 04:01 merozoite: THP-1-förhållande rekommenderas för robusta fagocytiska svar. Med hjälp av detta förhållande, och utspädningen av plasma anges är denna analys kunna lösa låga, mellan och höga nivåer av opsoniserande antikroppar. Mellan 0 och 78 procent fagocytos reaktioner har observerats med hjälp av PNG plasmaprover och övriga förhållanden som beskrivs. Sådana svar är nyligen visat att associera med naturligt förvärvad klinisk immunitet mot malaria 10. Figur 5 visar exempel på de fyra kvartilerna för fagocytos svar från PNG individer.
Figur 1. Tidpunkt för E64 dessutom är avgörande för att generera membraninneslutna merozoites. (A) Lämplig maturatio. n skede av parasiter i) före E64 behandling, och ii) membran slutna merozoites producerats efter 6 timmar av E64 behandling (B) membran slutna merozoites genereras inte om E64 läggs till omogna parasiter; i) sen trofozoiter, och ii) efter 12 timmar av E64 (C) schizont bristning inte hämmas om E64 läggs till sent segmente schizonter.; i) sen schizonter, och ii) efter 6 timmar av E64. Skala stapel representerar 10 mikrometer.
Figur 2. Avlägsnande hemozoin är kritiskt för att alstra en encelliga merozoit suspension. Merozoit-hemozoin aggregat form efter filtrering av membraninneslutna merozoiter, såvida hemozoin är magnetiskt separerad från merozoiter. (A) Framåt scatter och sido-spridningsdiagram av merozoiter med hemozoin avlägsnadesoch hemozoin behållas. (B) hemozoin-merozoit aggregat kan fagocyteras av THP-1-celler. Diff-Quick färgade cyto-spin diabilder av THP-1-celler inkuberade med PNG plasma opsoniserad merozoite preparat med eller utan hemozoin. Skala stapel representerar 10 mikrometer.
Figur 3. Etidiumbromidfärgning möjliggör överlägsen upplösning på merozoit fagocytos. D10-GFP renade merozoiterna motfärgas med EtBr att förbättra fluorescensintensiteten. (A) Flödescytometri histrogram av renade merozoites med gating på GFP positiva merozoites, och en dot blot visar EtBr fluorescens inom denna gated GFP-positiva populationen. (B) Framåt spridning mot GFP och ljusspridning framåt kontra EtBr av THP-1-celler efter fagocytos av GFP och EtBr dubbla fluorescerande merozoiter. Gates var d Rawn baserad på THP-1-celler med merozoiter och ingen kontrollplasma.
Figur 4 Den merozoite:. THP-1-förhållande påverkar graden av fagocytos iakttas. (A) Fem merozoite: THP-1 förhållanden skildras; 50:1, 20:01, 10:01, 04:01, 01:01. Celler som endast kontroll indikerar bakgrundsfluorescens på grund av THP-1-celler. THP-1 EtBr fluorescens för varje förhållande är indicerat för merozoiter opsoniserad med en pool av PNG-plasma eller med icke-immunt australiska plasma (B) Medel-fluorescensintensiteten hos THP-1 celler för olika merozoite:. THP-1-förhållanden och opsonisering med en pool av PNG-plasma eller nonimmune Australian plasma (medelvärde + SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Ett stort utbud av opsoniserande antikroppar kan mätas. Merozoites var opsoniserad med plasma från PNG individer och inkuberas med THP-1-celler. Fyra representativa fagocytos svar visas. Gates drogs utifrån de THP-1-celler med merozoites och ingen plasma-kontroll, och siffrorna anger% fagocytos efter subtraktion av THP-1-celler med icke-immunplasma kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
För att mäta merozoit fagocytos, är goda kunskaper i två tekniker som krävs: rening av merozoites och THP-1 fagocytos analysen. De mest kritiska stegen för att kombinera dessa två tekniker är: 1) Mycket synkroniserade parasiter; 2) Lägga E64 vid rätt tidpunkt för att ge membran slutna merozoites; 3) Avlägsnande hemozoin att undvika kross; 4) Exakt merozoit räkna med flödescytometri; 5) utspädning av plasma som används; och 6) att upprätthålla låg celldensitet och passagenummer av THP-1-celler. Noggrant övervägande av dessa viktiga aspekter kommer att säkerställa robusta fagocytos svar observeras.
Även om, som beskrivs här är att förbereda merozoites för bedömning av fagocytos, kan tekniken användas för ett brett spektrum av applikationer. Oberoende av den nedströms metodik, optimala merozoite beredningar beror på korrekt timing E64 förutom i syfte att generera merozoiter. Den E64 metod som beskrivs här har visat sig yield invasiva merozoites för användning i hög upplösning mikroskopi av invasion händelser och drogkänslighetsanalyser 15-20. Medan merozoit viabilitet är inte väsentlig för fagocytos, krävs för integriteten hos merozoit yta päls. Därför E64 metod som beskrivs här möjliggör högkvalitativa merozoites skall tas fram för bedömning av antikroppssvar till ytan pälsen. Som visas i figur 1, om E64 läggs för tidigt eller för sent membran slutna merozoiter bildas inte. Av detta skäl är mycket synkrona parasitkulturer krävs. Här är användningen av sorbitol och heparinbehandlingar att tätt synkronisera D10-GFP parasitkulturer till ett fönster av 2 tim beskrivs. Heparin kan främja gametocytogenesis i andra labb isolat, och därför bör användas försiktigt. Alternativa synkroniseringsmetoder såsom alanin kan också användas, förutsatt att tätt synkroniserade parasiter produceras 29. Om E64 läggs till asynkrona parasiter, en lägre proportion av membraninneslutna merozoites kommer att produceras och resterande parasit-infekterade RBC kommer antingen brista normalt eller utveckla onormal morfologi. Förekomsten av parasiter som inte har utvecklats till membraninneslutna merozoites leder till igensättning av filtret och avsevärt minska merozoite avkastning erhålls.
Vid filtrering av membraninneslutna merozoites är hemozoin befriad från mag vakuoler och är närvarande som fria kristaller i lösningen. Hemozoin är mycket proinflammatoriska och har rapporterats att modulera monocyter och makrofager fagocytos svar 30, 31. Förutom att modulera fagocytos, såsom visas i fig 2, kan hemozoin bilda aggregat med merozoiter i lösning. Som THP-1 celler kan phagocytose dessa aggregat, kan detta vara ett stort confounder för upplösningen av antikroppsmedierad fagocytos. Därför är det nödvändigt att avlägsna hemozoin i denna analys till AVoid ytterligare komplexitet hemozoin på fagocytsystemet biologi. Dessutom kan underlåtenhet att ta bort hemozoin också vara skadlig när du använder denna teknik för att generera fria merozoites för andra tillämpningar, i synnerhet när det krävs merozoit kvantifiering.
Såsom beskrivs översiktligt i fig 4 var antalet merozoiter tillsatt i analysen kan påverka graden av fagocytos av THP-1-celler. Även flödescytometri möjliggör räkning av merozoit koncentration, noggrann pipettering och replikera räkningar av merozoites är nödvändiga för att förbättra noggrannheten. Detta är särskilt viktigt om flera parasitlinjer ska testas sida vid sida. Det har tidigare visats att plasma från semi-immuna barn från PNG signifikant kan spädas före responser avböja 23. Beskrivs här är den optimala utspädning av plasma (1/120, 000 slutlig spädning av plasma) för en kohort av 5 - 12 år gamla PNG barn som producerade det stora utbudet av phagocyt. Osis svar som beskrivs i Figur 5 Detta intervall tillåts för stratifiering av svaren i fyra grupper (0 - 19%, 20-39%, 40-59% och 60-79% fagocytos), och regressionsmodellering visade att opsoniserande svar var associerade med skydd mot klinisk sjukdom och hög densitet parasitemin 10 För olika kohortstudier det kan vara nödvändigt att justera plasmaspädning för att säkerställa att fagocytos av THP-1-celler inte är mättad eller under nivån för detektering.
Flödescytometri möjliggör snabb och kvantifierbara fagocytos med förbättrad noggrannhet över mikroskopi. Detta protokoll är en hög genomströmning, platta baserad och automatiserad förvärv av 96 brunnars plattor för att studera naturligt förvärvad humoral immunitet. Metoden kräver färgning av merozoiter med etidiumbromid, men alternativa DNA-fläckar som SYBRGreen, DAPI och propidium jod, membran fläckar eller proteinfläckar kunde utnyttjas. Denna analys skulle vara mottaglig för priy monocyter eller neutrofiler, och skulle kunna anpassas om fagocytsystemet eller FcR biologi var av intresse. Primära celler eller THP-1 celler differentierade in vitro med PMA kan användas för att studera fagocytos i malaria och andra patogener 12, 32-34. Men med hjälp av primära celler kan vara en utmaning eftersom dessa celler är vidhäftande och även visa icke-antikroppsmedierad fagocytos 35. Dessutom variabilitet i renhet, viabilitet och funktionalitet är några viktiga begränsningar för användning av primära fagocytiska celler. De Fc-receptorer som är inblandade i merozoit fagocytos förblir uncharacterized, och därför använder blockerande antikroppar till specifika Fc receptorer skulle kunna belysa bidraget från varje Fc-receptorn till merozoite fagocytos. Som THP-1 fagocytos är FcR beroende, gör denna enkla tolkning av fagocytos iakttas. Denna analys lämpar sig också för att ta itu med den antigen specificitet opsoniserande antikroppar som skulle kunna uppnås genom utilizing knock-out parasiter för merozoit ytantigener, eller med hjälp av affinitets renade humana antikroppar mot merozoite ytproteiner. Dessutom, i djupstudier av cytokinsvar efter merozoit fagocytos saknas, och kan uppnås med hjälp av denna analys.
Dessa två tekniker är betydande förskott till studiet av funktionella antimerozoite antikroppar. Reningen av högkvalitativa merozoites är fördelaktigt att använda frysförvarade merozoites eller fluorescerande mikrosfärer belagda med merozoite antigener. Även om denna analys har använts som ett verktyg för att utvärdera naturligt förvärvad immunitet, kan det visa sig vara ett viktigt verktyg för att ta itu med förvärvet av immunitet som svar på vaccination. Även om det har nyligen visat att fagocytos eller opsonised merozoites är förknippad med skydd mot klinisk malaria, är det inte möjligt att dra direkta slutsatser från in vitro-THP-1 fagocytos till in vivo phagocytosis av merozoites som fagocytos i denna analys sker under statiska förhållanden och i avsaknad av konkurrerande röda blodkroppar. De potentiella anpassningar av denna analys kan därmed ge ett mångsidigt verktyg för vidare förståelse av malaria och merozoit fagocytos.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna barn och vuxna plasmagivare, och personalen på Papua Nya Guinea institutet för medicinsk forskning. Författarna vill tacka Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller och Diana S Hansen för deras bidrag till utvecklingen av denna teknik, och tacka den australiska Röda korset för blod-och serum förpackningar. Detta arbete har gjorts möjlig genom viktoriansk delstater Operational Infrastruktur Support och australiska regeringen NHMRC IRIISS. Detta arbete stöddes av National Health och medicinska forskningsråd beviljar # 1031212 och # 637.406, och National Institutes of Health bidrag # AI089686.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 cell line | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 31800-089 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 10099-141 | |
| 2-mercapthoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | Use in Fume Hood |
| Pen/Strep Solution (100x) | Sigma | P0781 | |
| HEPES | SAFC | 90909C | Cell culture grade |
| Hypoxanthine | Calbiochem | 4010 | |
| Human Serum | Donation from Australian Red Cross | Available commercially (i.e. Invitrogen) | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1.06329.0500 | |
| Gentamycin | Pfizer | 61022027 | Injection Quality |
| Heparin Sodium BP (5000 IU/ml) | Pfizer | Porcine origin | |
| Blasticidin S-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | 50-70-4 | |
| E64 Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132-10MG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 98281-100G | Use for phosphate buffer |
| Na2HPO4.2H20 | Merck | 10383.4G | Use for phosphate buffer |
| Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in 6.7 mN Phosphate buffer (make fresh each stain) |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1 M, pH 7.2 |
| Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm | Pall Life Sciences | 4656 | |
| QuadroMACS Separator (for small column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-091-051 | Interchangeable with MidiMACS |
| VarioMACS Separator (for large columns) | MACS Miltenyi BioTec | 130-090-282 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Column (small magnetic column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Large magnetic column | MACS Miltenyi BioTec | 130-041-305 | |
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1510433 | Cytotoxic |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitogen | C36950 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader | BD Biosciences | ||
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1 M, pH 7.2 |
| FlowJo cytometry analysis software | Tree Star |
References
- Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria. Nature. 192, 733-737 (1961).
- Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. PLoS Medicine. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).
- Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes. The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).
- Jafarshad, A., et al. A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII. Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).
- Genton, B., et al. A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea. The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).
- Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine. The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).
- Llewellyn, D., et al. Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome. Journal of leukocyte biology. , (2013).
- McIntosh, R. S., et al. The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria. PLoS pathogens. 3, 72 (2007).
- Pleass, R. J., et al. Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection. Blood. 102, 4424-4430 (2003).
- Hill, D. L., et al. Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria. PLoS One. 8, (2013).
- Joos, C., et al. Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies. PLoS ONE. 5, (2010).
- Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).
- Richards, J. S., et al. Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development. The Journal of Immunology. , (2013).
- Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).
- Boyle, M. J., et al. Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).
- Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).
- Angrisano, F., et al. Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
- Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).
- Zuccala, E. S., et al. Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite. PLoS ONE. 7, (2012).
- Marapana, D. S., et al. Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion. Traffic. 13, 1457-1465 (2012).
- Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture. International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).
- Schofield, L., Mueller, I. Clinical immunity to malaria. Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).
- Hill, D. L., et al. Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites. PLoS ONE. 7, (2012).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).
- Ataíde, R., et al. Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria. PLoS ONE. 5, (2010).
- Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays. Malar J. 9, 152 (2010).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase. C. Nature. 332, 457-459 (1988).
- Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms. J Immunol. 174, 475-484 (2005).
- Schofield, L., Tachado, S. D. Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa. Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).
- Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals. Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).
- Lunov, O., et al. Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line. ACS. 5, 1657-1669 (2011).
- Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro. Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).
- McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance. Blood. 96, 3231-3240 (2000).
