Summary
Cellulära blåsor spelar viktiga roller i fysiologiska och patologiska processer, inklusive koagulation, immunsvar och cancer eller som potentiella terapeutiska medel vid läkemedelstillförsel eller regenerativ medicin. Detta protokoll presenteras metoder för kvantifiering och storleks karakterisering av isolerade och icke isolerade extracellulära blåsor i olika vätskor med hjälp av avstämbara resistiv puls avkänning.
Abstract
Cellulära vesikler (EVS), inklusive "mikrovesiklar" och "exosomes", förekommer rikligt i kroppsvätskor. De senaste åren har det skett en enorm ökning av intresset för elbilar. Elbilar har visat sig spela en viktig roll i olika fysiologiska och patologiska processer, inklusive koagulation, immunsvar, och cancer. Dessutom EVs har potential som terapeutiska medel, exempelvis som läkemedelsleveransfordon eller som regenerativ medicin. På grund av sin ringa storlek (50 till 1000 nm) exakt kvantifiering och storlek profilering av elbilar är tekniskt utmanande.
Detta protokoll beskriver hur avstämbara resistiv pulsanalys (TRP)-teknik, med användning av qNano systemet, kan användas för att bestämma koncentrationen och storleken av elfordon. Metoden, som bygger på detektion av elfordon vid överföringen genom en nanostora porer, är relativt snabb, räcker användning av små provvolymer och kräver inte purläggande och koncentration av elfordon. Bredvid den ordinarie verksamheten protokollet ett alternativt tillvägagångssätt beskrivs med prov spetsat med polystyrenkulor med känd storlek och koncentration. Denna realtidskalibreringsteknik kan användas för att övervinna tekniska hinder påträffas vid mätning elbilar direkt i biologiska vätskor.
Introduction
Blåsor från cellulära ursprung är mycket rikligt i kroppsvätskor 1. Dessa så kallade extracellulära vesikler (EVS) (50 - 1000 nm i storlek) bildas antingen genom fusion av flera vesikulära organ med cellmembranet eller genom direkt utåt knoppning av cellmembranet. Under senare år har vetenskapligt intresse för elbilar ökat kraftigt, vilket resulterade i en uppsjö av EV-inriktade publikationer, där nya funktioner och egenskaper hos elbilar beskrivs 1. Elbilar är nu tros vara inblandad i ett brett spektrum av fysiologiska och patologiska processer såsom signaltransduktion, immunreglering och blodkoagulering 1-4. I cancer, elbilar tycks spela en roll i bildandet av premetastatic nischer 5,6, överföring av pro-cancer innehåll 7,8 och stimulering av angiogenes 8. Förutom detta är elbilar undersökas som leverans agenter för terapeutiska medel 9.
Trots dessa delingen, tillförlitlig kvantifiering av elbilar är fortfarande utmanande. Traditionellt indirekta kvantifieringsmetoderna används som förlitar sig på kvantifiering av totala proteininnehållet eller specifika proteiner. Även om i stort sett används inte dessa tekniker inte hänsyn till protein-per-EV skillnader, och inte diskriminerar mellan förorenande proteinaggregat och proteiner i elbilar. Dessutom är dessa tekniker kräver isolering av elbilar, vilket i många fall gör jämförelse av EV-koncentrationer i biologiska prover omöjligt.
Därför görs även ansträngningar för att utveckla nya metoder som möjliggör mer exakt och direkt EV mätning 10. Denna rapport beskriver användningen av avstämbara resistiv puls avkänning (TRP) för tillförlitlig kvantifiering och storlek profilering av elbilar.
För närvarande qNano instrumentet (Figur 1a) är den enda kommersiellt tillgängliga plattform för TRP. I TRPS, ett icke-ledande elastiska membranet inrutat with en nanostora porer är att separera två vätske celler. En av de fluid celler fylls med provet av intresse, medan den andra cellen är fylld med partikelfria elektrolyten. Genom att applicera en spänning, är en jonisk flöde / elektrisk ström etablerad, vilken ändras vid överföringen av partiklar genom poren (figur 1b). Storleken av denna ström blockad (resistiv puls ") är proportionell mot partikelns volym 11 (figur 1c). Blockaden längd kan användas för att bedöma Zeta-potentialen av partiklar, som förlitar sig på partikelegenskaper såsom laddning eller form 12. Storlek profilering av okända partiklar kan utföras genom att jämföra de resistiva pulser orsakade av de okända partiklar med de resistiva pulser orsakade av kalibreringspartiklar med en känd diameter. Förutom storleken på en blockad händelse, är den hastighet som dessa inträffar mäts. This räknehastigheten relies på partikelkoncentrationen. Eftersom koncentrationen och hastigheten för blockad är linjärt proportionell 13, med användning av en enda kalibreringsprov med partiklar med känd koncentration och partikelstorlek möjliggör mätning av koncentration 14 och storleksfördelning 11 av ett okänt prov.
Förflyttning av partiklar genom nanopore bestäms av elektro kinetic- (elektrofores och elektro-osmotiska) och fluidkrafter 15. Genom att använda modulen variabelt tryck (VPM) en tryckskillnad mellan de fluid celler kan induceras som en ytterligare kraft. Applicera positivt tryck ökar flödet av partiklar, som kan vara av nytta när partikelkoncentrationen är låg. Dessutom kan trycket tillämpas för att minska effekten av elektro kinetiska krafter. Detta är särskilt viktigt när man använder nanoporer med en relativt liten pordiameter (NP100, NP150 och NP200 eventuellt) som ofta används för detektion av elbilar.För dessa nanoporer, även vid tillämpningen betydande tryck, de elektro kinetiska krafter kan, beroende på partikelytan laddning, förblir nonnegligible 16. Genom att mäta partikelhastighet vid flera tryck, en elektro kinetiskt korrigeras, och därmed mer exakt, kan EV koncentrationen beräknas.
Här är detaljerade protokoll tillhandahålls för att bestämma storleksfördelning och koncentration av elbilar. Bredvid den ordinarie verksamheten protokollet, är ett alternativt tillvägagångssätt beskrivs där prover spetsas med polystyrenkulor med känd storlek och koncentration 17. Denna realtidskalibreringsteknik kan användas för att övervinna några av de tekniska utmaningar stött vid mätning EVs direkt i biologiska vätskor, såsom urin, plasma och cellkultursupernatant eller när stabiliteten i nanopore under en lång period av mättid inte kan vara säkerställas.
Protocol
1 Standard Operating Protocol
1.1 Instrumentinställning och provberedning
- Anslut instrumentet till en dator med programvaran Izon Control Suite installerat.
- Välj nanopore storlek som ska användas: för storlek och koncentrationsmätning av elbilar en NP150 (mål storlek 85-300 nm) eller NP200 (target storlek 100-400 nm) oftast används. När du arbetar med elbilar som har isolerats med hjälp av ett protokoll som innebär avlägsnande av större elbilar, till exempel genom att leda provet genom ett 220 nm filter, en NP100 por (target storlek 70-200 nm) kan användas. När man arbetar med EV i ett biologiskt prov eller elfordon isolerats med användning av ett annat protokoll kan NP200 användas, eftersom det kommer att bli igensatta så ofta. Andra nanoporer såsom NP300 (mål storleksområde 150-600 nm) eller den NP400 (mål storleksområde 200-800 nm), eller till och med större nanoporer kan användas för större typer av elfordon.
- Välj polystyren kalibreringation partiklar som kompletterar nanopore valde i steg 1.1.2. För en NP100, NP150 och NP200 nanopore använda CPC100, CP100 och CPC200 partiklar, respektive. För exakt storlek uppskattning, se till att kalibreringspartiklarna har en liknande storlek som de okända partiklar.
- För att få en jämn kalibreringspartiklar, skaka snabbt (30 sek). Eventuellt gäller ultraljudsbehandling för att avlägsna aggregat.
- Späd kalibreringspartiklarna i PBS för att målkoncentrationen i en volym på minst 40 | il. Obs: Målet koncentrationen varierar beroende på nanopore valdes i steg 1.1.2. Target koncentrationer levereras med nanoporer.
- Ansök och direkt ta bort 78 l PBS på nedre vätske cellen; denna vätning av den nedre fluid cellen minskar risken för luftbubbelbildning under nanopor vid tillämpning en elektrolyt till den nedre fluid cell när nanopor är i läge.
- Placera nanopore på de 4 armarna i instrumentet. Användde digitala skjutmått för att mäta avståndet mellan två motsatta armar och ange avståndet i mm i "Stretch" inmatningsfältet och klicka på "kalibrera stretch" för att kalibrera nanopore stretch.
- Sträck nanopor till 47 mm, genom att vrida sidohjulet och därigenom öka avståndet mellan de motstående armarna hos instrumentet innan ansöka om ett nytt 78 pl PBS till den nedre vätskecell.
Obs: Elektriska störningar kan avsevärt påverka kvaliteten på mätningarna. När du använder en bärbar dator för att köra Izon Control Suite programvara, se till att den bärbara datorn är ansluten till elnätet med hjälp av ett jordat uttag och stickpropp. Mobiltelefoner hållas nära instrumentet kan också vara en källa för elektrisk interferens. Elektriska störningar observeras som ständigt upprepade toppar i baslinjen Ström, ofta med effektivvärde (RMS) brus> 10 pA.
Notera: Nästan vilken buffert kan användas för att späda ut kalibreringspartiklar och elfordon för TRPS characteritionen. Närvaron av salter är en förutsättning för upprättande av en elektrisk ström. För EV mätningar använder PBS som en buffert. Kalibreringspartiklar bör alltid spädas i samma buffert som de elfordon för att säkerställa noggranna mätningar.
1,2. Bestäm optimala inställningar för mätning
Obs: Innan inspelningen, är det viktigt att fastställa inställningar optimala mätning. Blockaden magnitud som orsakas av en partikel som passerar genom nanopore är beroende av den pålagda sträckningen och den pålagda spänningen. För tillförlitliga mätningar RMS buller bör vara <10 pA och läget blockad magnitud bör vara> 0,1 nA.
- Placera den övre vätske cellen och skärm bur på nanopore och införa 40 pl utspädda kalibreringspartiklar i övre vätske cellen. Använd VPM att tillämpa ≥0.8 kPa övertryck.
- Minska tillämpade sträckan långsamt mot 44 mm samtidigt analysera blockad händelser som orsakas av kalibreringenpartiklar. OBS: Vid minskning av pordiameter rörelsen av partiklar genom nanopore det mindre troligt och därmed partikelhastigheten minskar. På grund av ökad relativ blockad av poren en större blockad händelse inträffar resulterar i förbättrad signal-till-brus-förhållande. En ökning av spänningen kan ytterligare öka blockad magnitud men kan också öka RMS buller.
- Minska sträckan fram lämpliga blockad händelser (Figur 1c) observeras i "Signal Trace" panelen. (Mode> 0,1 nA) och motsvarande partikelhastigheten är> 100 / min. Obs: Partikelhastigheten är en mindre strikt cut-off, men som mätningar av minst 500 partiklar är perfekta, kommer partikelhastigheter på <100 / min orsaka inspelning löptider på minst 5 min. Partikel priser högre än 2.000 / min kan resultera i mindre noggranna mätningar (om den finns, bör provspäd utföras).
1.3 Mätning av kalibreringPartiklar, Tvättning av Uper Fluid Cell och provmätning
- I detta avsnitt elbilar från cellkultursupernatanten av glioblastoma multiforme cellinje U87-MG / EGFRvIII karaktäriseras. Isoleringen och beredning av dessa elbilar har tidigare beskrivits och visualiseras 18.
- Placera kalibreringspartiklarna i det övre vätskecell. Applicera tryck (t.ex. 0,8 kPa) med VPM och spela in> 500 partiklar.
- Om utför en mätning med flera tryck, ökar den applicerade tryck (exempelvis till 1,0 kPa) och spela in ett andra kalibreringsfilen. Obs: Minst 0,2 kPa skillnad krävs.
- Ta bort kalibreringsprov från den övre vätske cellen. Tvätta den övre fluid cell 3 gånger med 100 pl PBS för att avlägsna restpartiklar. Före införandet av provet i det övre vätske cell använder luddfri trasa för att avlägsna eventuell kvarvarande PBS från övre vätske cellen.
- Introducera provet till den övre fluid cell. Se till baslinjen ström ligger inom 3% av utgångsström observeras vid mätning av kalibreringspartiklar. Om inte inom 3%, tillämpa den strategi som beskrivs nedan för att stabilisera baslinjeströmmen. Applicera de exakta trycket som tillämpas för de kalibreringspartiklar och registrera exempelfilerna.
Anm: Partikelhastigheten tomt bör uppvisa konstant partikeldetektering (figur 2a). Vid plötsligt avbryter partikel upptäckt, ett plötsligt baslinjeströmmen, eller en plötslig ökning av RMS buller, kan poren vara tilltäppt; alltså, pausa inspelningen. För att återställa baslinjen trycker du på eller vrida skärmlocket, applicera kolven, eller helt ta bort nanopore och tvätta den med avjoniserat vatten och sätt tillbaka den på instrumentet.
Obs: Du kan också öka nanopore sträckan till 47 mm i kombination med maximalt tryck från VPM i ca 5 min.
1.4 Dataanalys
- Klicka på ", Analysera data "-fliken för att komma in i analysdelen av programvaran. Bearbeta kalibreringen och exempelfiler genom att högerklicka på "Obearbetad filer" och välja "Process filer".
- Klicka på kryssrutan bredvid provet i "Kalibrerade" kolumnen till par exempelfilerna till kalibrerings inspelningar. Välj motsvarande prov och kalibreringsfiler och klicka "OK". Obs: när du använder kalibrerings alternativet multitryck välj "Multi-tryck Kalibrering" fliken till vänster för att koppla flera prover till flera kalibreringsfiler.
- När framgångsrikt kopplade kommer Izon kontroll Suite visa olika prov egenskaper såsom storlek-fördelning (figur 2b), baslinjen löptider, full bredd halv max (FWHM) och en koncentration analys. Valfritt: För varje prov, enskilda datapunkter kan exporteras som en kommaseparerad fil.
2.lternative Protokoll - Tillsats Prover med Kalibrerings Pärlor
OBS: I allmänhet kan det standardförfarande användas vid arbete med isolerade elbilar. När du arbetar med icke-isolerade elbilar i biologiska prover, eller isolerade EV preparat förorenade med stora proteinaggregat, drift av instrumentet kan vara en utmaning. Dessa utmaningar består i huvudsak av en hög nanopore blockering (plötsliga baslinjen ström), oförmåga att återhämta baslinjen strömmar inom 3% av kalibreringsmätning eller signifikanta skillnader i partikelhastigheter mellan identiska prover (Figur 3a). För prov som visar dessa svårigheter ett alternativt protokoll att kvantifiera elfordon utvecklades 17. Denna metod förlitar sig på att införa större kalibrerings polystyren kulor i provet av intresse (figur 3b). En detaljerad procedur för denna alternativa protokoll diskuteras nedan.
2,1. ProvFramställning
Obs: När du förbereder prov med den alternativa metoden, är det önskvärt att upprätta ett förhållande mellan EV-till-sträng av cirka 1 Dessutom är det viktigt att inkludera en "kalibrerings pärla bara" prov, för att möjliggöra noggrann "gating" av kalibreringspärlor, och för att bestämma antalet bakgrundspartiklar (t.ex. proteinaggregat) närvarande i bufferten.
- Centrifugera 100 pl cellodlingssupernatant för 7 min vid 300 xg
- Lägg 20 pl av supernatanten till 20 pl av PBS och 10 pl av 75 gånger utspädd 335 nm polystyrenpärlor (lager 7E10 / ml).
2.2. Prov Mätning
- Använd den strategi som beskrivs i avsnitt 1.2 för att fastställa optimala inställningar instrument.
- Mät "kalibrerings pärla bara" prov först. Kontrollera att bakgrunds detektering av små icke-bead partiklar är så låg som möjligt (<10% av pärlorna).
- Mät varje individuell SAmple gång innan inspelningen replikerar för att fördela fluktuation i nanopore förhållanden jämnt över de olika proverna. Mät minst 3 replikat av varje prov.
- Mät den "kalibrerings pärla bara" prov efter avslutad inspelning av alla prover.
2,3. Dataanalys
OBS: När du använder alternativt protokoll innebär ensamrätt till Izon kontroll Suite inte räcker för att beräkna koncentrationen. Ytterligare kalkylprogram krävs. Tabell 1 visar ett exempel på beräkning av koncentrationen av de prover som visas i figur 3.
- Öppna "kalibrerings pärla bara" prov och en eller flera exempelfiler.
- Bestäm vilken blockad händelse storlek (i nA) kan användas som en cut-off för skillnad mellan elbilar och polystyrenkulor. Fastställande av blockad värde (nA) som motsvarar den vänstra basen av polystyrenpärlor populationen (
- Hämta värdena för det totala antalet partiklar för varje prov genom att klicka på "Particle Analysis Sammanfattning" fliken av provet.
- Filtrera datamängder med hjälp av cut-off nivå bestäms i steg 2.3.2. genom att välja "Datafiltrering" pop-up. Display partiklar endast mindre än cut-off.
- Hämta värdena för EV antalet för varje prov från "partikelanalys i sammandrag".
- Subtrahera den mängd elfordon från de totala partiklama för att bestämma mängden av kalibreringspärlor.
- Bestäm förhållandet EV-till-pärlan genom att dividera EV räkna med kalibrering pärla räknas.
- Bestäm de genomsnittliga bakgrundsförhållande som genomsnittet förhållandena fastställs för varje &# 8220; bead bara "kalibreringsprov. Subtrahera detta värde från varje enskilt prov.
- Multiplicera den justerade EV-till-kula-förhållande med koncentrationen av kalibreringspärlor för att bestämma koncentrationen av elfordon för varje prov.
- Multiplicera koncentration hittades i steg 2.3.9 med EO utspädningsfaktor som införs genom tillsats av kalibreringspärlor till EV provet. Obs: I exemplet prov setup, är den totala utspädningen av provet i PBS och kalibreringspärlor 2,5 gånger och därmed koncentrationen finns i steg 2.3.9 multipliceras med 2,5 för att bestämma EV provkoncentrationen råa.
- Beräkna statistik såsom medelvärden, standardavvikelse och standardfel av medelvärdet för varje grupp av replikat.
Obs: I vissa fall överlappar mellan elbilar och spetsade polystyrenkulor observeras. Om korrigering för underskattning av EV koncentration krävs, bör prover utan spetsade polystyrenkulor också mätas. Använd samma skärav som bestäms i steg 2.3.2 för att bestämma en "pärla till EV"-förhållande, för att beräkna förhållandet mellan elfordon som faller inom området för de spetsade polystyrenpärlorna. Denna pärla till EV kvoten bör läggas till EV-till-pärlan förhållande bestäms i steg 2.3.8.
2,4. Tillval: EV storleksfördelning med den alternativa metod.
- Öppna en provinspelning två gånger i kontroll Suite.
- Ange filteralternativ för ett av proven du bara vill visa partiklar större än cut-off bestäms ovan. Detta visar bara kalibreringspartiklar.
- Ställ det filtrerade provet till "kalibreringsfil" och ange läget storleken på kalibreringspärlor.
- Par exempelfilen och "kalibreringsfilen" skapades i steg 2.4.3 som beskrivs i 1.4.2. Exempelfilen kommer nu att visa en storleksfördelning både elbilar och kalibreringspärlor utifrån de spetsade kalibreringspärlor.
Obs: Standard operating-protokollet kommer oftast räcker för bestämning av storlek-fördelningar av elbilar. Ibland dock exakta buffertkomponenter är okända (t.ex. i plasma eller urin) som gör det omöjligt att framställa ett prov av kalibreringspärlor i samma buffert som EVS av intresse. Ett EV prov spetsat med kalibreringspartiklar kan användas för EV storleksuppskattning i dessa särskilda villkor.
Representative Results
För att använda TRPS instrumentet, har en icke-ledande nanopore att placeras på de fyra grenarna av maskinen (Figur 1a) och en spänning (Figur 1b) måste tillämpas. När en elektrisk utgångsström är etablerad, kommer resistiva pulser orsakade av partiklar som passerar genom poren att upptäckas som illustreras i figur 1c.
Elfordon renades från cellodlingssupernatant av glioblastomcellinje U87-MG / EGFRvIII genom ultracentrifugering. En stabil partikelhastighet-plot observeras vid mätning av de isolerade elfordon (Figur 2A) på en NP100 nanopor. Denna stabila partikelhastighet-plot krävs för en tillförlitlig mätning EV koncentration. Efter parning EV-provinspelning till en inspelning av 115 nm kalibrerings polystyren pärlor, en storleksfördelning (figur 2b) och koncentration uppskattning av EV-provet kan erhållas (data visas ej).
(Figrue 3a). Detta resulterar i felaktiga uppskattningar EV koncentrationsläger. Genom tillsatta provet med polystyrenkulor med känd koncentration och storlek, kan en EV-till-pärla förhållande bestämmas. Figur 3b illustrerar resultaten som erhållits efter tillsatta cellodlingssupernatant med polystyrenkulor av 335 nm i storlek. Två tydliga populationer observeras. Partiklarna som inducerar en blockad av mindre än 0,46 nA är beslutsamma elbilar, de större partiklarna bestäms polystyrenkulor. Förhållandet av EO till polystyrenpärlor används för att beräkna den råa koncentration av elfordon (tabell 1). Figur 3c illustrerar storleken uppskattning av de två populationer baserat på de spikade polystyrenpärlor. Den nanopor uppspänning reerat i upptäckten av elfordon> 140 nm i storlek. Detta kan sänkas genom att minska nanopore öppningen, men detta kommer också att leda till mer igensättnings händelser.
Figur 1: qNano instrumentet och driftsätt. (A) Fotografi av instrumentet. En nanopor är placerad på instrumentet, separerar en nedre fluid cell från en övre vätskecell. Fluid cellerna skyddas från miljö elektriska störningar av skärmlocket. (B) Illustration beskriver avstämbara resistiv puls avkänning (TRP). En icke ledande elastisk nanopore är att separera två vätske celler. Genom att lägga en spänning en elektrisk ström etableras genom poren punkterade i nanopore. Som extracellulära blåsor rör sig genom nanopore, är den joniska flödet ändras och detekteras som en resistiv puls. I TRPS öppnings storlek nanopore kan stämmas (minskad eller ökad) genom att sträcka nanopore genom att öka avståndet mellan de motstående armar av instrumentet, eller minska detta avstånd. (C) Illustrativ exempel på resistiva pulser. Storleken på en enda resistiv puls är proportionell mot partikelns volym:. Större pulser indikerar större partiklar Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Partikel räkna-tomten och storleksfördelning som erhållits från mätning isolerade elbilar från U87-MG / EGFRvIII cellodlingssupernatant (A) Partikel räkna-plot anger övergripande konstant upptäckt partikel.. Kortfattad reduktion av particle upptäckt observerades mellan 80 och 100 sekunder för inspelning. Efter att pausa inspelningen och trycka på skärmlocket stabiliserades partikelhastigheten efter vilken inspelningen återupptogs. (B) Storleksfördelningen av isolerade elbilar plottas efter kalibrering det okända provet (EV) till 115 nm kalibrerings polystyren pärlor. (5 nm bin storlek). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: TRPS kvantifiering av elbilar i cellodlingssupernatant använder alternativt protokoll. (A) Typiska partikel ränta tomter som erhålls vid mätning elbilar direkt i en biologisk vätska. Pore igensättning orsakar korta avbrott och variationer i graden av partikeldetektering. VarjeTomten är en kopia mätning av samma prov. (B) Tre replikat storleksfördelningsdiagram erhållna efter tillsatta cellodlingssupernatant med 335 nm kalibrerings polystyren pärlor. Alla partiklar som inducerar en resistiv puls på mindre än 0,46 nA väljs som elbilar. (C) De spetsade polystyrenkulor kan användas för att få en storleksfördelning av provet. (5 nm bin storlek). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mätning | Kalibrering enda # 1 | Kalibrering bara # 2 | Supematant # 1 | Supematant # 2 | Supematant # 3 |
| Medelström (nA) | 117 | 120 | <td> 116118 | 120 | |
| Partikelhastighet | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| cutoff används (nA) | 0,46 | 0,46 | 0,46 | 0,46 | 0,46 |
| Totalt partiklar | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| Extracellulära vesiklar | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| Spetsade kalibrerings pärlor | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| EVS / kalibrerings pärlor | 0,01 | 0,003 | 0,772 | 0,788 | 0,884 |
| Prov - bakgrund | 0,765 | 0,781 | 0,877 | ||
| Extracelullar vesiklar (10 7) / Ml | 7,14 | 7,29 | 8,18 | ||
| Prov 2.5x utspädd | |||||
| Raw koncentrations elbilar (10 7) / ml | 17,85 | 18,22 | 20,46 |
Tabell 1:. Exempel beräkning av EV koncentration med hjälp av alternativa protokollet Ett gränsvärde är fast besluten att skilja elbilar från kalibreringspärlor. Därefter kan det totala antalet elbilar och pärlor hämtas. För varje mätning av EV-till-pärla Faktorn beräknas. Mängden bakgrunds partiklar i elektrolyten (t.ex. proteinaggregat) beräknas som genomsnittet av de EV-till-pärla förhållande för de enskilda mätningar av "endast kalibrerings pärlor" prov. För varje prov bakgrundsförhållandet subtraheras från den erhållna kvoten. Denna adjusted kvoten multipliceras med koncentrationen av kalibreringspärlor i urvalet (i detta exempel: 9.33e7 / ml). För att bestämma den outspädda koncentrationen av elfordon, är den erhållna koncentrationen multipliceras med den totala EVs utspädningsfaktor (i detta exempel: 2,5).
Discussion
Protokollen i detta manuskript erbjuder metoder för kvantifiering och storlek karakterisering av elbilar använder TRPS. De stora fördelarna med TRP-plattformen är det lilla urvalet, relativt korta mätningstiden och avsaknaden av behov prov manipulation.
Förutsättning för exakt TRPS mätning är att hålla förhållanden identiska mellan kalibrering och provmätningar. Detta omfattar användningen av identiska buffertar samt identiska instrumentinställningar, till exempel nanopore storlek, spänning och pålagt tryck. Den ursprungliga VPM saknar en mekanism för exakt inställning av det applicerade trycket och därmed orsakar mindre skillnader i applicerat tryck mellan proverna. Dessutom kan avdunstning av priming vätska i VPM framkalla små tryckskillnader vid mätning vid olika tidpunkter och VPM bör därför ofta åter primas. Dessa begränsningar har potentiellt lösts genom införandet av VPM2, vilkethar en klickbaserad skalning och lufttryck bygger.
Den alternativa protokoll som beskrivs i detta manuskript är speciellt lämpad för mätning av elfordon i icke renade biologiska prover 17. Vi tror att buffertkomponenter, såsom socker, lipider, proteiner och andra större skräp, kan i vissa fall påverka mätningsförhållandena för mycket för standardprotokollet för att kunna tillämpas. Tillsats av kalibreringspärlor till provet i stället för att jämföra två separata mätningar introducerar "realtidskalibrering". Denna metod är särskilt lämplig när man jämför prover (t.ex. blodplasma olika givare) som har olika och / eller okända fluidbakgrunds innehåll. Även om skillnader finns mellan elbilar och polystyrenpartiklar (t.ex. partikeltäthet och yta avgift), teoretiska modeller samt experimentella data stryker användbarheten av polystyrenkulor för kvantifiering och storlek profilering av elbilar,under förutsättning att betydande tryck appliceras 15,19. För att minimera påverkan av elektrokinetiska krafter, är användning av den relativt större NP150 / NP200 nanopore och betydande övertryck rekommenderas.
Elbilar och kalibreringspärlor utmärks av storlek. Följaktligen måste nanopore som öppnas genom att sträcka, till en diameter där detektering av både elbilar och de större kalibreringspartiklar observeras. Sedan öppnandet av por minskar känsligheten för mindre partiklar, EVS bara större än en viss storlek registreras (ofta EV> 120 nm vid användning av en 335 nm kalibrering pärla). Den lägsta detektionsgränsen för elbilar kan minskas till cirka 90 nm, med hjälp av 203 nm kalibrerings pärlor på en NP150 nanopore. Dock kan denna inställning vara olönsamma när större elbilar inducerar ofta igensättning av nanopore. Förekomsten av dessa hindrar elbilar kan tvinga användningen av en installation där en population av elbilar, för liten för att reach tröskeldetektering, inte kommer att detekteras.
Svårigheten att driva systemet ökar när man försöker mäta partiklar mindre än 100 nm i storlek. I sådana fall kan detekteringen förbättras genom att öka saltkoncentrationen i elektrolyten. En ökad jonkoncentration inducerar relativt ökade blockad magnituder för små partiklar (större signal-till-brus-förhållande). Lönsamheten för denna teknik för mätning av elbilar måste valideras dock som ökade saltkoncentrationer kan påverka volymen av elfordon.
Sammanfattningsvis kan det TRPS plattform användas för direkt kvantifiering och storlek karakterisering av elbilar. Eftersom ingen isolering eller EV manipulation (antikroppsbindande eller fluorescerande märkning) krävs, är plattformen lämpar sig för direkt EV kvantifiering i biologiska vätskor. Ett alternativt protokoll tillhandahålls som kan vara till nytta för prover där buffertkomponenter inducerar betydande por clogging händelser, vilket gör tillförlitlig användning av standardprotokollet olönsamt.
Disclosures
Utvecklingen av den skisse protokoll och skrivandet av detta manuskript har ekonomiskt stöd, delvis av den nederländska Hjärnfonden, Schumacher Kramer Foundation och Bohnenn fonden. Produktionen av denna video-artikeln delvis sponsorted av Izon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
| Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
| Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
| (Mini) vortexer | Multiple available | ||
| Lift-free tissues | Multiple available | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
| Windows based computer | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |
References
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews. Drug discovery. 12, 347-357 (2013).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9, 871-881 (2008).
- Bobrie, A., et al. Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression. Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nature medicine. 18, 883-891 (2012).
- Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).
- Dommelen, S. M., et al. Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).
- Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).
- Kozak, D., et al. Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS. 6, 6990-6997 (2012).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosensor. 31, 17-25 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions. Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).
- Vrij, J., et al. Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing. Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (3037), (2012).
- Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing. Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).
