Summary
Evnen til å overvåke T-celle-responser i detalj in vivo er viktig for utviklingen av forståelsen av immunresponsen. Her beskriver vi bruk av fluorescerende måloppstill (frihandelsavtaler) i en in vivo T celle analyse som vurderer> 250 parametere samtidig ved flowcytometri.
Abstract
Evnen til å overvåke T-celle responser in vivo er viktig for utviklingen av forståelsen av immunresponsen, og utformingen av immunterapier. Her beskriver vi bruk av fluorescerende target array (FTA) teknologi, som benytter vitale fargestoffer som karboksyfluorescens succinimidyl ester (CFSE), fiolett laser eksiterbare fargestoffer (CellTrace Violet: CTV) og rød laser eksiterbare fargestoffer (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) til combinatorially label muse lymfocytter i> 250 merkes fluorescerende celle klynger. Celle klynger innenfor disse FTAs kan pulseres med store histocompatibility (MHC) klasse I og MHC klasse II-bindende peptider og derved fungere som målceller for CD8 + og CD4 +-T-celler, respektivt. Disse FTA celler forblir levedyktig og fullt funksjonell, og kan derfor gis i mus for å tillate vurdering av CD8 + T celle-mediert dreping av FTA målcellene og CD4 + T-celle-mediterte help FTA B cell målceller i sanntid in vivo ved strømningscytometri. Siden> 250 målceller kan bli vurdert på en gang, gjør teknikken overvåking av T-celle respons mot flere antigen-epitoper ved flere konsentrasjoner, og i flere replikater. Som sådan kan den teknikk å måle T-celle responser på både en kvantitativ (for eksempel den kumulative omfanget av reaksjon), og en kvalitativ (f.eks. Funksjonelle aviditet og epitop-kryssreaktivitet av responsen) nivå. Heri beskrives hvordan disse FTAs er konstruert og gi et eksempel på hvordan de kan bli anvendt for å vurdere T celle responser indusert ved en rekombinant pox-virus-vaksine.
Introduction
T-celler spiller en sentral rolle i den adaptive immunrespons og er ofte målrettet for manipulasjon i immunterapi. CD4 + effektor T-celler svare på fremmed antigen ved å skille cytokiner som regulerer mange aspekter av immunitet og kan også direkte bidra til B-celler til å produsere antistoffer. CD8 + cytotoksiske T-celler (CTLs) kan også svare på fremmed antigen ved å skille cytokiner samt spille en sentral rolle i direkte drepe celler som uttrykker et fremmed antigen. Den grunnleggende interaksjon som initierer disse T-celle-effektor-funksjoner involverer interaksjon av T-cellereseptoren (TCR) med fremmede peptider som vises på MHC-molekyler på overflaten av cellene. CD4 + T-celler gjenkjenner peptider som vises på MHC klasse II-molekyler på antigenpresenterende celler og CD8 + T-celler gjenkjenner peptider som vises på MHC klasse-I-molekyler som er typisk vist på mikrobe infiserte celler.
Forfor å vurdere rollen T-celler spiller i en immunrespons, er det nødvendig at deres effektorfunksjoner blir målt ved pålitelige og følsomme teknikker. Vanlige metoder for T celle respons vurdering inkluderer; MHC class-I/II/peptide tetramer reaktivitet; cytokin produksjon av ELISPOT og intracellulær cytokin flekker; og drepe kapasiteten med 51 Cr-release analyser. Disse assays, men er vanligvis utføres ex vivo-og in vitro-stimulering, eller gir begrenset innsikt i T-celle funksjonen. Ideelt sett, ved måling av T-celle-responser ville det være gunstig å vurdere dem in situ, in vivo når de oppstår, uten manipulering av T-celler, slik som for å unngå endringer i funksjonelle parametre som kan oppstå ved in vitro stimulering. Noen av de mest brukte i vivo T celle funksjonelle analyser er basert på måling av CTL mediert dreping av målceller pulserende med MHC klasse I-bindende peptider, som er oppregnet i vivovia deres deteksjon ved fluorescerende merking med vitale fargestoffer som CFSE. Selv om disse typer av assay kan overvåke CTL-mediert dreping av mål når de skjer in vivo, har de tidligere hatt en forholdsvis begrenset kapasitet for å vurdere avliving av flere mål som representerer forskjellige konsentrasjoner og forskjellige typer av peptid-epitoper, som er nødvendig for å tillate kvalitativ parametre som som funksjonell grådighet og epitope variant kryss-reaktivitet skal vurderes. Disse analysene heller ikke gi noen informasjon om CD4 + T-celle mediert respons.
For å overvinne mange av begrensningene med dagens metoder som brukes for å vurdere T celle responser, vi har nylig utviklet en multiplex analyse basert på fluorescerende måloppstill (frihandelsavtaler), som tillater overvåking av T celle responser mot> 250 målceller samtidig i ett dyr av flowcytometri 1, 2. FTAs består av lymfocytter som er merket med sevtater konsentrasjoner og kombinasjoner av vitale fargestoffer som CFSE, CTV og CPD slik> 250 celle klynger av unik fluorescens som skal genereres. Siden disse cellene forblir levedyktig og funksjonell, kan de injiseres i dyr for å tillate overvåkning av deres interaksjon med effektor-T-celler in vivo 3.. For eksempel kan de fta celleklynger bli pulset med MHC klasse-I-bindende peptider for å tillate vurdering av antigen-spesifikke CTL-mediert dreping av målceller en. I tillegg kan de fta celleklynger også bli pulset med MHC klasse II-bindende peptider, slik at evaluering av antigen-spesifikke T-hjelpercelle (T H) aktivitet ved å vurdere aktivering (ved vurdering av aktiveringsmarkører slik som CD69, CD44 og / eller CD62L) av B-celler innenfor FTA peiling beslektet peptid to. Siden mer enn 250 mål kan detekteres samtidig, er det mulig å måle CTL og T H respons mot mange target celleklynger pulsert med numerous peptider på ulike konsentrasjoner og inkludering av mange gjentak. FTA analysen gir derfor et enestående nivå av T-celle effektor respons vurdering in vivo.
Her beskriver vi i detalj konstruksjonen av et FTA og viser hvordan de kan brukes til å vurdere T-celle responser in vivo. Fremgangsmåten beskriver konstruksjonen av et FTA som består av 252 discernable celleklynger ved bruk av tre vitale fargestoffer, som består av seks ganger i 42 celleklynger pulsert med MHC klasse I-og II-bindende peptider. Merkingen av 42 celleklynger forekommer i 10 ml konisk rør og bunn er det nyttig å legge disse ut i et rør Stativ som angitt i tabell 1. Denne metoden kan bli justert for mindre antall av skillbare klaser som er nødvendig ved å redusere mengden av merking av hver farge utført en.
Vi trekker verktøyet til analysen ved å vise hvordan den kan måle responses generert av rekombinant pox-virus vaksinasjon mot flere epitoper i en liten kohort av mus. Dette viser hvordan FTA Målingen kan brukes til å måle kumulativ respons og funksjonelle aviditet gjennom henholdsvis bruk av arealet under kurven (AUC) vurderinger og måling av effektive peptid-konsentrasjon som kreves for å generere ett halv maksimal respons (EC 50).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Mus som brukes under denne protokollen ble håndtert i henhold til retningslinjene fra Australian National University forsøk med dyr Ethics Committee og mus ble avlivet ved halshugging.
En. Dye og peptidpreparat
- Dye forberedelse
Merk: Fargestoffer er prediluted ved forskjellige konsentrasjoner for å tillate merking av celler ved diskrete fluorescensintensiteter. CFSE brukes på syv konsentrasjoner gjort gjennom 3,5-fold seriefortynning, og CTV og CPD brukes ved seks ulike konsentrasjoner gjort gjennom 3,7-fold seriefortynning (se tabell 2-4). Lager konsentrasjoner av fargestoffer som er oppført i Tabeller 2-4 vil bli brukt til å merke målceller på de endelige fargestoffkonsentrasjoner som er oppført i Tabeller 2-4. Fargestoffer reagerer når det utsettes for en vandig oppløsning. Det er derfor viktig at ampuller bli utlignet til RT før åpning for å minimere eksponering av fargestoffer til kondens.- CFSE
Merk: CFSE er kjøpt som karboksyfluorescens diacetat succinimidyl ester (CFDA, SE; MW 557,47), vanligvis ved 25 mg / hetteglass.- Resuspender 25 mg CFSE i 4,48 ml DMSO for å oppnå en 10 mM stamløsning.
- Serielt fortynne CFSE: Legg 35 mL av 10 mM CFSE lager i 87,5 mL av DMSO og gjenta dette med fortynnet lager løsning for å gi hver fargestoff konsentrasjon i tabell 3.
- CTV
Merk: CTV kjøpes typisk i pakker med 9 ampuller, som hver kan bli rekonstituert med 10 pl DMSO for å gi en 10 mM oppløsning av fargestoffet.- Rekonstituere og basseng alle 9 ampuller med CTV med 90 mL av DMSO å gi en 10 mM løsning.
- Serielt fortynne CTV: Legg 11 mL av 10 mM CTV lager i 29,7 mL av DMSO og gjenta dette med fortynnet lager løsning for å gi hver fargestoff konsentrasjon i tabell 2.
- CPD
Merk: CPD (MW 792,6) er typiskly kjøpt som 0,5 mg / hetteglass.- Suspender 0,5 mg av CPD i 63 ml av DMSO å få en 10 mM løsning.
- Serielt fortynnet CPD: til 11 pl av 10 mM CPD lager i 29,7 ul DMSO og gjenta dette med fortynnet stamløsning for å gi hver fargestoff konsentrasjon i tabell 4.
Merk: Dye massen kan lagres ved -20 ° C i flere måneder, og kan bli tint og hvis flere ganger uten vesentlig tap av funksjon.
- CFSE
- Peptidpreparat
Merk: MHC klasse-I-bindende peptider som er vanligvis brukt til å pulsere målceller på 6 forskjellige konsentrasjoner laget ved å bruke 10 gangers fortynning fra en startkonsentrasjon på 1 pM (tabell 5). MHC klasse II-bindende peptider som er vanligvis brukt til å pulsere målceller på 6 forskjellige konsentrasjoner laget ved hjelp av tre gangers fortynning fra en start-konsentrasjon på 400 pM (tabell 5). Hver peptid er laget på 2x endelig konsentrasjon i PBS slik that hvert peptid-konsentrasjon har et minimumsvolum på 250 pl. Peptid stocks kan fremstilles før FTA konstruksjon og lagret ved -20 ° C uten vesentlig tap av funksjon.- Forbereder lager MHC klasse-I-bindende peptider
- Klargjør den høyeste konsentrasjon av hvert peptid-epitop til 2 mM stamløsninger (2 x 1 mm)
- Serielt fortynnet MHC klasse-I-bindende peptider: Tilsett 44,4 pl av 2 pM peptid-stamløsning i 400 pl av PBS. Gjenta dette med fortynnet stamløsning for å gi hvert peptid-konsentrasjon i tabell 5.
- Forbereder lager MHC klasse-II-bindende peptider
- Klargjør den høyeste konsentrasjon av hvert peptid-epitop til 800 uM stamløsninger (2x 400 pM).
- Serielt fortynnet MHC klasse II-bindende peptider: Tilsett 150 ul av 800 uM peptid løsning i 300 ul PBS. Gjenta dette med fortynnet stamløsning for å gi hvert peptid-konsentrasjon i tabell 5.
2. FTA Forberedelse
Merk: Fremgangsmåten nedenfor skisserer bygging av en FTA består av celler pulserende med syv forskjellige peptidepitoper på seks ulike konsentrasjoner (dvs. 42 celle klynger.) Gjentatte seks ganger for å generere 252 merkes celle klynger. Innenfor hver gjentakelse, en celle klynge ikke pulserende med en hvilken som helst epitop (Nil), er inkludert som en kontroll. Det er nyttig for FTAs å ha en CD45 allotype forskjell fra vertsdyr for å tillate deres diskriminering av mottakercellene med antistoffmerking ved tidspunktet for analyse. Ellers FTAs kan merkes med andre fargestoffer som PKH-26 for dette formål (beskrevet i trinn 2.6). Vanligvis er FTA forberedelse prosedyren utføres fra start til slutt i løpet av en sittende.
- Etikett 42, 10 ml konisk plastrør bunnet 1-42 (som i tabell 1 for eksempel).
- Fremstilling av cellene
- Isoler milt og / eller lymphnodes fra mus. Forbered enkelt celle suspensjon fra vev ved å mose gjennom en 70 mikrometer studert sikt med en 5 ml sprøyte stempelet og telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Resuspender lymfocytter ved opp til 200 x 10. 6 celler / ml i 11,5 ml av Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI, eller tilsvarende) som inneholdt 5% føtalt kalveserum (FCS). Merk: Det er viktig å bruke en buffer med høy amininnhold for å redusere fargestoff giftighet for celler tre.
- CTV merking
Merk: Cellene er i utgangspunktet merket med 6 konsentrasjoner av CTV.- Grundig resuspender cellene ved å vende røret flere ganger. Legg 1,9 ml cellesuspensjon til seks av de 10 ml rør merket 37-42, tar seg ikke å fukte den øverste halvdelen av rørene.
- Slik merker du celler med CTV, fjerne korken og legge røret horisontalt.
- Til 83 mL PBS til den ikke fuktede parti på toppen av røret, og til dette legger til 17 pl av lager CTV (se Table 2 hvor stamløsningen er tilordnet hvilken tube). Merk: Et ikke fuktes røret er viktig for å hindre cellesuspensjon bevegelse og for tidlig blanding av celleløsningen med fargestoff oppløsning.
- Lokk på røret, og bland cellesuspensjonen med fargestoff raskt og grundig ved å virvle.
- Gjenta trinn 2.3.2-2.3.4 for aksje løsninger av CTV i de utpekte rør som er beskrevet i Tabell 2.
- Inkuber cellene i minst 5 minutter ved RT (20 ° C).
- CFSE merking
- Etter CTV merking, tilsett 5 ml RPMI inneholdende 5% FCS til hvert rør og grundig resuspender cellene ved virvling.
- Fra røret 37 overføre 1 ml av cellesuspensjonen til rør 31, 25, 19, 13, 7, og en.
- Fra røret 38 overføre 1 ml av cellesuspensjonen til rør 32, 26, 20, 14, 8, og to.
- Fra røret 39 overføre 1 ml av cellesuspensjonen til rør 33, 27, 21, 15, 9, og 3..
- Fra røret 40 overføre 1 ml av cellesuspensjon til rørene 34, 28, 22, 16, 10, og fire.
- Fra røret 41 overføre 1 ml av cellesuspensjonen til rør 35, 29, 23, 17, 11, og 5.
- Fra røret 42 overføre 1 ml av cellesuspensjonen til rørene 36, 30, 24, 18, 12 og 6
Merk: Pass på ikke å fukte den øverste halvdelen av rørene under trinn 2.4.1.1-2.4.1.6.
- Slik merker du celler med CFSE, fjerne korken og legge røret horisontalt.
- Legg 103 ml PBS til den ikke fuktede parti på toppen av røret, og til dette legger til 7 ml av lager CFSE (se tabell 3 hvor stamløsningen er tilordnet hvilken tube).
- Lokk på røret, og bland cellesuspensjonen med fargestoff raskt og grundig ved å virvle.
- Gjør trinn 2.4.2-2.4.4 for aksje løsninger av CFSE på anviste rør som er beskrevet i Tabell 3.
- Inkuber cellene i minst 5 minutter ved RT (20 ° C).
- Vask celler: Fortynn cellesuspensjon med 9 ml, 20 ° CRPMI inneholdende 5% FCS, sediment etter sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 20 ° C, og supernatantene fjernes ved aspirering med en overførings pipette.
- Etter CTV merking, tilsett 5 ml RPMI inneholdende 5% FCS til hvert rør og grundig resuspender cellene ved virvling.
- Peptid pulserende og celle vasking
Merk: Etter at cellene har blitt merket med CTV og CFSE, er de pulserende med MHC klasse-I og / eller MHC klasse-II bindende peptider (utarbeidet i 1.2). En av cellepopulasjoner må heller ikke pulset med peptid (f.eks. Nil i tabell 1), og brukt som en negativ kontroll for beregning av T-celle-responser.- Peptid pulserende
- Resuspender celler i et totalvolum på 250 ul av RPMI inneholdende 5% FCS. Merk: Typisk 50 ul av cellesuspensjonen blir igjen etter inhalering av supernatanten ved slutten av trinn 2.4.7 derfor tilsett 200 ul av medium til cellepelleten.
- Til 250 pl av pre preparerte peptid bestander (som i tabell 5) å hensiktsmessig betegnet rør (som i tabell 1) og være sure til å omfatte et kontrollrøret PBS tilsettes alene uten peptid som Nil kontroll.
- Bland cellesuspensjoner med en virvel. Merk: Det er viktig at hvert peptid-epitop og hvert peptid-konsentrasjon er tilordnet et enkelt rør, og dette registreres tydelig basert på den forventede fluorescens av cellene i dette røret, siden fluorescens signatur av denne gruppen vil definere dette peptid (som i tabell 1 for eksempel).
- Inkuber cellene ved 37 ° C i 1 time.
- Cell vasking
- Tilsett 5 ml av iskald (4 ° C) RPMI inneholdende 5% FCS til cellesuspensjonen og resuspender cellene ved å vende røret. Underlag nøye cellesuspensjonen med 3 ml iskald (4 ° C) FCS.
- Sedimentere cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Bruk sakte akselerering og bremsing for å sikre at grenseflaten i FCS, og cellesuspensjonen løsningen blir opprettholdt.
- Nøye aspirer av RPMI og deretterFCS med en overføring pipette, forlater de vasket celle pellets uforstyrret. Merk: Anvendelse av en FCS underlag for å vaske cellene med på å sikre like mye peptid-løsning blir fjernet fra cellene som mulig og derved begrenser eksponeringen av cellepopulasjoner til flere frie peptider når cellene er gruppert.
- Vask cellene igjen: Resuspender cellepelletene i 10 ml 4 ° C RPMI inneholdende 5% FCS. Sedimentere cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Hell av supernatanten.
- Pool alle cellepopulasjoner sammen til et enkelt rør med en pipette med 6 ml 4 ° C RPMI som inneholder 5% FCS. Sediment sammenslåtte celler ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Aspirer av supernatant med en overføring pipette.
- Peptid pulserende
- CPD Cell merking
Merk: På dette punktet seks intra analyse gjentak kan genereres ved merking peptid pulserende celler med seks ulike konsentrasjoner av CPD.- Legg 11,4 ml 20 ° CRPMI inneholdende 5% FCS til den sammenslåtte cellepelleten og resuspender grundig ved hjelp av en pipette.
- Legg 1,9 ml cellesuspensjon til 6, 10 ml rør merket AF, tar seg ikke å fukte den øverste halvdelen av rørene.
- Slik merker du celler med CPD, fjerne korken og legge røret horisontalt.
- Til 92 mL PBS til den ikke fuktede parti på toppen av røret, og til dette legger til lager CPD (se tabell 4 for antallet av lagerløsningen er tilordnet til hvert rør).
- Lokk på røret, og bland cellesuspensjonen med fargestoff raskt og grundig ved å virvle.
- . Har trinn 2.6.3-2.6.5 for stamløsninger av CPD i de utpekte rør som er beskrevet i Tabell 4. Merk: I motsetning CFSE og CTV, er CPD merking konsentrasjonen ikke nøyaktig lineært relatert til den resulterende fluorescens intensiteten i merkede celler, og slik merking konsentrasjon anvendt for å oppnå like langt fluorescerende topper i flere merkede populasjoner har værtbestemmes empirisk (se tabell 4).
- Inkuber cellene i minst 5 minutter ved RT (20 ° C).
- Vask cellene to ganger: Suspender cellene til 10 ml med 20 ° C RPMI som inneholder 5% FCS. Sedimentere cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 20 ° C. Aspirer av supernatant med en overføring pipette. Gjenta.
- Pool alle celler sammen til et enkelt rør ved hjelp av 8 ml 4 ° C RPMI som inneholder 5% FCS med en pipette. Sediment sammenslåtte celler ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C, og suge av supernatanten med en overførings pipette.
- (Valgfritt) PKH-26 Cell merking
Merk: Hvis FTAs ikke kan konstrueres med celler som uttrykker et CD45 allotypic forskjellen å være vert for mus, de kan være merket med PKH-26 for å tillate deres diskriminering av mottakercellene.- Til 2,9 ml av 20 ° C PBS til den samlede cellepelleten og resuspender grundig med en pipette.
- Legg cellesuspensjon til et nein fuktet 10 ml tube, tar seg ikke å fukte den øverste halvdelen av røret.
- Fjern korken og legge røret horisontalt.
- Legg 58 pl fortynningsmiddel C (i PKH-26 fargestoff kit) til den ikke fuktede parti på toppen av røret, og til dette legger til 42 pl 1 mM stock PKH-26.
- Lokk på røret, og bland celle løsningen med fargestoffet grundig ved å virvle.
- Inkuber cellene i minst 10 minutter ved RT (20 ° C).
- Vask cellene to ganger: Suspender cellene til 10 ml med 20 ° C RPMI som inneholder 5% FCS. Sedimentere cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 20 ° C. Aspirer av supernatant med en overføring pipette. Gjenta.
- Injisering frihandelsavtaler i vertsdyr
Merk: For å måle T-celle responser in vivo, blir FTAs injisert i dyr som har en aktiv immunrespons og venstre in situ i opp til 24 timer. Det er viktig at de FTAs blir også injisert i et naivt dyr som en negativ kontroll.- Telle og resuspender celler på 2,5 x 10 8 celler per ml i PBS. Injiser 200 ul av celler intravenøst inn i verts musene, inkludert et naivt dyr som en kontroll.
Tre. Flowcytometri
- 18-24 timer etter høsting FTA injeksjon blod eller milt (eller andre vev av interesse) fra verts mus.
- Forbered enkelt celle suspensjon fra vev ved å mose gjennom en 70 mikrometer studert sikt med en 5 ml sprøyte stempelet.
- Suspender cellene på opp til 65 x 10 6 celler / ml i PBS som inneholder 0,1% BSA.
- Tilsett 100 ul alikvoter av cellesuspensjonen i brønner i en mikrotiterplate for antistoff-merking.
- Etikett celler med fluorokromkonjugerte merket antistoffer og fluorescerende levedyktighet prober med spectrally kompatibel fluorescens til CFSE, CTV og CPD. Merk: Antistoff mot B-celle markører som B220 og aktivisering markører som CD69 er viktig å måle B-celleaktivering hvis du bruker FTEn for å måle T H celle responser to. Omfatte et antistoff til CD45.1-og / eller CD45.2 hvis FTAs og verts mus har en CD45 allotypic forskjell.
- Tilsett 100 ul av 2 x stamløsning av antistoffer / levedyktighet fargestoffer (i PBS inneholdende 0,1% BSA) til 100 ul porsjoner av celler,, bland godt og inkuber på is (4 ° C) i 30 min.
- Vask celler: Sediment celler ved sentrifugering ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C og fjerne supernatanten. Resuspender celler i 200 ul PBS inneholdende 0,1% BSA, celler sediment ved sentrifugering ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C og fjerne supernatanten.
- Resuspender celler i et totalvolum på 400 pl PBS inneholdende 0,1% BSA, filtrer cellene gjennom en 70 um maske og analysere ved strømningscytometri i et strømningscytometer som kan detektere de relevante fluorescerende fargestoffer og konjugater. Samle opp til 3 x 10 6 lymfocytter hendelser for å løse hver FTA celle klynge og få nok celler for statistiskecal analyse. Merk: Sørg for at alle de typiske kontroller (for eksempel enkelt farget kontroller) for flowcytometri er ansatt. Vanligvis krever CFSE eksitasjon fra en blå laser kilde (typisk ved 488 nm) og påvisning med bandet pass filter sentrert over 520 nm; CTV krever eksitasjon fra en fiolett laser kilde (typisk 405 nm) og påvisning med bandet pass filter sentrert over 450 nm; og CPD krever eksitasjon fra en rød laser kilde (typisk på 633 nm eller 640 nm) og påvisning med bandet pass filter sentrert over 670 nm.
4. Data Analysis
- Analyser flowcytometri data ved hjelp av standard flowcytometri programvare (se representativt resultat for et eksempel på den type gating strategi ansatt).
- For% spesifikk drap, beregne antall celler i hver FTA celle klynge pulserende med MHC klasse-I-bindende peptider og de FTA klynger som ikke ble peptid pulserende ("null") og bruker følgende formel for å beregne% Spesifikk Killing.
% Spesifikk Killing
Merk: I den ovenfor angitte formel "primet" refererer til målene fra dyr som er antatt å ha en immunrespons mot målet peptider, "naive" refererer til målene fra naive dyr, "peptid" viser til målene pulset med peptider og "null" refererer til målene ikke pulserende med noen peptider. - For B-celleaktivering som et mål på T H aktivitet, beregne den geometriske midlere fluorescensintensitet (GMFI) for CD69-antistoff fluorescens på FTA B-celler pulsert med MHC klasse II-bindende peptider i "primet" dyr og fra denne trekker den GMFI av CD69 ekspresjon av de tilsvarende FTA B-celler i "naive" dyr for å gi et mål på T H aktivitet.
- Fra statistikken som genereres i trinn 4,2 og 4,3, brukmatematisk regneark programvare som GraphPad Prism å beregne andre kvantitative og kvalitative parametre som areal under kurven og EC 50 (en inngående beskrivelse av hvordan disse beregningene er utført for AUC finner du på
http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, og for EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel på bruken av fta-analysen, ble en BALB / c mus immunisert med rekombinant vaccinia virus (VV) som uttrykker HIV-I-epitoper (VV-HIV) og responser til HIV-I CTL-epitoper, Gag, Gag mut, Env og Pol, VV CTL-epitoper F2L og F2L mut, og HIV-I-T H-celle-epitop, Gag Th (som beskrevet i 2) ble undersøkt ved hjelp av en 252 parameter FTA-analysen (figur 1B). Epitop varianter av Gag (Gag mut) og F2L (F2L mut) er ikke uttrykt i VV-HIV vektor og derfor reaksjoner mot disse epitoper er reflekterende av epitop variant kryss reaktive T celle responser. Naive mus ble også injisert med FTA som en negativ kontroll. FTA ble diskriminert fra vertsmuseceller ved PKH-26 merking og FTA B-celler diskriminert av B220 antistoffarging via flowcytometri (figur 1A og 1B). Hver av de seks intra dyre gjentak var gated basert på CPD fluorescens (figur 1C (fig. 1D). % Spesifikk Killing av hver replikat ble vurdert ved å sammenligne FTA klynge celledød i primet dyrene i forhold til tilsvarende FTA klynger i naive dyr (figur 1D). T H aktivitet ble vurdert ved å sammenligne FTA B-celle oppregulering av CD69 i primet dyrene i forhold til tilsvarende FTA B celle klynger i naive dyr (Figur 1E).
Fra denne analysen, VV-HIV-infeksjon genereres sterke CTL-respons mot den immundominante epitopen VV F2L, med 100% av fta målceller pulset med 0,001 mM eller mer av den epitop som blir fjernet fra milten (figur 2A). Det var også en sterk respons generert mot variant form av F2L, F2L mut, med 100% av fta målceller pulset med 0,01 mM eller mer av den epitop som blir fjernet fra milten. SidenF2L mut er ikke tilstede i den infiserende virus indikerer denne reaksjon en epitop variant kryssreaktiv respons. Det var også en forholdsvis moderat reaksjon genereres av mål som uttrykker HIV-gag-epitopen og en svak kryssreaktiv respons mot variant form av denne epitop, HIV gag mut. Det syntes å være ubetydelige reaksjoner genereres til de HIV Pol og HIV Env CTL epitoper.
I tillegg til CTL-responser, er FTA eksempel assay vist måles også T H responser ved å vurdere aktivering av FTA B-celle som uttrykker HIV MHC klasse II-bindende epitop HIV gag Th (figur 2B). Dette viste antigenspesifikk B-celleaktivering skjedde i primet dyr tyder generasjon av HIV Gag Th-spesifikke T H celle effektorer.
Disse mål på T-cellerespons magnitude kan oppsummeres ved å generere areal under kurven (AUC) verdier for hver av de epitoper (figur 2C) som measures den kumulative størrelsen av responsen.
I tillegg til størrelsen av antigen-spesifikke og epitop variant kryssreaktive respons, tillater FTA assay funksjonelle aviditet målinger gjøres. For eksempel, de effektive peptid-konsentrasjoner som brukes til å pulsere fta målceller som kreves for å gi halv maksimal respons (EC 50), er vist for de CTL-effektorer (figur 2D). Dette viste den funksjonelle avidity til epitoper F2L mut, HIV Gag og HIV Gag mut, var ca 10, 100 og 4000 ganger lavere, henholdsvis, enn svarene som genereres til den dominerende VV epitope F2L.
Tabell 1. Oppsett av en 252 parameter FTA. Typisk oppsett av en gjengivelse av en 252 FTA består av 42 prøver / rør pulserende med syv forskjellige peptidepitoper på seks forskjellert konsentrasjoner og inkludert en un pulset (Nil) prøve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tube Antall | Volum (mL) | Dye lager (mM CTV) | Endelig konsentrasjon (mikrometer) |
| 37 | 0 | 0 | 0 |
| 38 | 17 | 0.053 | 0,451 |
| 39 | 17 | 0.197 | 1.48 |
| 40 | 17 | 0,73 | 6.21 |
| 41 | 17 | 2.7 | 23 |
| 42 | 17 | 10 | 85 |
Tabell 2. CTV aksjer brukes til å merke celler. Volum av børsnoterteCTV lager som brukes til å merke celler i 2 ml for å gi den endelige merking fargestoffkonsentrasjon.
| Tube Antall | Volum (mL) | Dye lager (mM CFSE) | Endelig konsentrasjon (mikrometer) |
| 37 - 42 | 0 | 0 | 0 |
| 31-36 | 7 | 0.022 | 0.139 |
| 25 - 30 | 7 | 0.078 | 0.492 |
| 19 - 24 | 7 | 0,23 | 1,45 |
| 13 - 18 | 7 | 0,82 | 5,17 |
| 7 - 12 | 7 | 2,9 | 18.3 |
| 1-6 | 7 | 10 | 63.1 |
Tabell 3. CFSE aksjer brukes til å merke celler. Volum av børsnoterte CFSE lager ossed å merke celler i 1,11 ml for å gi den endelige merking fargestoffkonsentrasjon.
| Tube Antall | Volum (mL) | Dye lager (mM CPD) | Endelig konsentrasjon (mikrometer) |
| A | 0 | 0 | 0 |
| B | 4 | 0.053 | 0.106 |
| C | 6.3 | 0.197 | 0,62 |
| D | 7.5 | 0,73 | 2,74 |
| E | 7.3 | 2.7 | 9.86 |
| F | 7.7 | 10 | 38.5 |
Tabell 4. CPD aksjer brukes til å merke celler. Volum av børsnoterte CPD lager brukes til å merke celler i 2 ml å gi den endelige labeling fargestoff konsentrasjon.
| Peptidkonsentrasjon (mikrometer) | |||||||
| MHC klasse I-bindende peptider | 0 | 0,00002 | 0.0002 | 0.002 | 0.012 | 0,2 | 2 |
| MHC klasse II-bindende peptider | 0 | 3,29 | 9.88 | 29,6 | 88.9 | 266 | 800 |
Tabell 5. MHC-klasse I-og II-bindende peptid arkiv konsentrasjoner. Typiske foto konsentrasjoner av en peptid-epitoper som brukes til å konstruere en fta en. Disse konsentrasjoner er 2x de endelige konsentrasjoner som benyttes til puls målceller.
Figur 1. Typisk strømningscytometri-analyse av FTAs. Splenocytter fra BALB / c-mus ble brukt til å konstruere et 252 parameter FTA, som beskrevet i teksten. FTA klynger ble pulserende med 6 konsentrasjoner (som oppført i tabell 5) av syv ulike virus epitoper, inkludert MHC klasse-I-bindende epitoper, F2L (SPYAAGYDL, en L d-restricted vacciniavirus (VV) epitop); F2L mut (SP G AAGYDL, en variant av F2L), Gag (AMQMLKETI, en K d-restricted HIV Gag epitop 4), Gag mut (AMQMLK D TI, en variant av HIV Gag 5), Pol (VGPTPVNII, en D d -restricted HIV pol epitope 6), Env (RGPGRAFVTI, en D d-restricted HIV env epitop 7); og MHC klasse II-bindende peptid Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, en H-2 d-bundne HIV gag epitop 4). Frihandelsavtaler ble injisert iv. inn i en BALB / c-mus som var blitt infisert intranasalt (i). seks dager tidligere med recombinant VV uttrykker HIV epitoper (VV-HIV, primet dyr). Den FTA ble også injisert i naive mus som kontroll. Etter 18 timers in vivo, ble FTA celler i splenocytt suspensjoner fra verts mus analysert ved flowcytometri. A) Typisk progressiv gating strategi for å identifisere FTA celler som viser porter for lymfocytter, singleter og PKH-26 + FTA celler (det er også nyttig å løse levende celler ved hjelp av en levedyktighet fargestoff som Hoechst 33258, ikke vist). B) 3D plott som viser alle FTA klynger fra naive vert mus. C) Histogram plott som viser FTA CPD fluorescens merking hver av de seks intra dyret gjentak. D) 2D plott som viser en av de seks intra-dyr FTA B-celle replikerer å presentere forskjellige typer og konsentrasjoner av epitoper fra naive og grunnede dyret. Dette viser fraværet av FTA celler i det grunnede dyr i forhold til den naive dyr, avslører «dreper hendelser"etter CTLs som danner grunnlaget for FTA drepe analysen en. E) Histogram analyse av FTA B-celle uttrykk for aktivering markør CD69 i primet dyr i forhold til naiv dyr, som danner grunnlaget for den FTA T helper analysen to. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. FTAs muliggjøre måling av størrelsen og aviditet for T-celle responser in vivo. A 252 parameter FTA ble brukt for å vurdere T-celle-responser i mus infisert med VV-HIV som beskrevet i figur 1. A)% Spesifikk dreping ble beregnet for alle CTL-epitoper og resultater fra hver av de seks gjenplicates vist (venstre panel), samt middel og standardavvik av middel (høyre panel) er vist. B) T H respons ble vurdert ved å måle aktiveringen av FTA B-celle som presenterer HIV Gag Th-epitopen for hver av de seks intra animalske replikater ( venstre panel), og middel-og standard feil av en anordning (høyre panel) beregnet. C) AUC-målinger for% spesifikk dreping (a) og T-hjelper responser (b) ble beregnet som et mål for den kumulative størrelsesorden. D) EC 50 målinger ble beregnet for% Spesifikke draps data (a) som et mål på funksjonell grådighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelen med FTA-baserte analyser er at de tillater diskriminering av> 250 levedyktig og funksjonell target cellepopulasjoner fra en enkelt vertsdyr ved strømningscytometri. Dette gir et nivå av kompleksitet til in vivo flowcytometri baserte analyser som ikke har vært mulig før. Dette er fremhevet i de to dyreforsøk vist ovenfor, hvor responser til 7 forskjellige virale epitoper i 6 konsentrasjoner kan bli overvåket i replikater på 6 samtidig i ett enkelt dyr slik parametre som for eksempel AUC og EC 50 som skal bestemmes for T-celle responser in vivo .
I tillegg til å måle T-celle responser in vivo, kan de FTA-baserte analyser modifiseres til å måle responser in vitro 1.. Dette innebærer i hovedsak å legge FTAs til T-celler i kultur for å måle responser over flere timer in vitro. En mulig begrensning til in vitro-baserte analyser ved hjelp av frihandelsavtaler er than tendensen for de merkede cellene i FTA å overføre merking fargestoff til omkringliggende celler 1, 3. Dette kan resultere i redusert oppløsning på FTA celle klynger som deres fluorescens blir mindre tydelig mellom hver populasjon. Dette er mer tydelig i in vitro prøver, sammenlignet med in vivo-analyser, fordi cellene er i umiddelbar nærhet til de lengre tidsrom ved in vitro assays. Dette tap i oppløsning på fta cellepopulasjoner kan minimeres i in vitro assays ved å redusere kulturen tidspunktet FTAs med effektor-T-celler og ved hjelp av FTAs som har et mindre mål-cellepopulasjoner som har en større mengde av "fluorescerende mellomrom» mellom dem, slik at at dye transfer har mindre betydning.
Vi har også registrert tap i oppløsning på FTA cellepopulasjoner når frihandelsavtaler ble plassert i vivo i 48 timer en. Dette viste seg å være et resultat av målet B-celler innen FTA proliferangering og dermed redusere fargestoff fluorescensintensitet. Dette er sannsynligvis et resultat av B-celler som presenterer beslektet antigen til antigen-spesifikke effektor CD4 + T celler som resulterte i B-celle stimulering. Det anbefales derfor at analysen være begrenset til ~ 24 timer eller mindre når B-celle mål blir overvåket.
Evnen til å merke flere (> 96) unike celleklynger fluorescensmerket har blitt rapportert tidligere ved hjelp av faste ikke-levedyktige celler 8. Denne farging av levende celler, har imidlertid vært mer problematisk med tilgjengeligheten av kompatible vitale fargestoffer, og bare 8-12 levedyktige celler klynger som er oppnådd tidligere er 9. Evnen til å generere> 250 unikt fluorescensmerkede levedyktige og fungerende celler som presenteres her, er avhengig av egenskapene til CFSE-lignende vitale fargestoffer. Flere av disse fargestoffer, slik som CTV og CPD, har kun nylig blitt tilgjengelige. Disse fargestoffer har karakteristikkene av å være i standmerking av celler med en høy fluorescens-intensitet, er det langlevde og med lav varians 3.. Disse egenskaper sammen med det faktum at det er en lineær relasjon (særlig i tilfelle av CFSE og CTV) mellom konsentrasjonen av det fargestoff som brukes for merking og fluorescensintensiteten av de merkede celler, innebærer at cellene kan være merket med flere (opp til 7 vist her) intensiteter av hver farge som lett kan skilles ved flowcytometri. Videre, siden fluorescensemisjonen fra CFSE, CPD og CTV har minimal spektral overlapping, kan de brukes i kombinasjon for å merke celler, noe som tillater opp til> 250 fluorescerende celle-signaturene for å bli detektert ved strømningscytometri. Det bør bemerkes at for å oppnå merking av celler med dette antall discernable fluorescerende signaturer, er det viktig at cellemerking utføres raskt 10, 11 (lav til å generere fluorescens varians) og i en passende buffer inneholdfrie aminer 3 (til buffer fargestoff toksisiteten som ellers kan oppstå med disse fargestoffer i høye konsentrasjoner). Det er også viktig at under oppkjøpet av frihandelsavtaler med flowcytometri at feilaktige svingninger i hendelsen fluorescens overvåkes (for eksempel ved å måle CFSE, CTV og / eller CPD fluorescens intensitet over tid). Dette er viktig fordi slike endringer i arrangement fluorescens som skyldes maskinen innførte feil kan resultere i feiltolkning av korrekt målcellen cluster posisjonering som i sin tur kan føre til feil i de endelige mål på T-celle-effektor-funksjon. Slike flowcytometer introdusert feil kan begrenses ved å sikre prøver av høy kvalitet er forberedt (spesielt betalende oppmerksomhet til filtrering celler gjennom en 70 mikrometer mesh for å minimere okklusjon av fluidic linjer i flowcytometer av store celleaggregater) og at flowcytometeret er opprettholdt til en høy standard.
Måling av T-celle responser in vivohar vært utført i mange år, ved bruk av vitale fargestoffer som CFSE å overvåke målceller death in vivo 12.. Vanligvis er disse analysene har imidlertid bare vært i stand til å overvåke opp til 7-8 forskjellige målceller på en gang 13 og så gi en begrenset kapasitet til å vurdere dreping av mål som uttrykker flere konsentrasjoner av flere epitoper som normalt kreves for å generere en detaljert vurdering av parametere slik som den funksjonelle aviditet for T-celle-responser. I denne forbindelse kan tetramer dissosiasjon assays bli brukt til å gi et mål på T-celle aviditet fra nylig isolerte effektor-T-celler 14-16. Denne teknikken er imidlertid måler MHC / TCR binding aviditet, og det er ikke et fullstendig bilde av funksjons aviditet, som også kan være avhengig av endringer i strukturen av den immunologiske synapse og tilstanden av T-celle signalisering komponenter 17. Derfor, ideelt sett, krever funksjonelle aviditet dose-respons-forsøk som skal utføres. Detteer blitt oppnådd tidligere ved hjelp av in vitro-teknikker som for eksempel 51 Cr-frigjøring assay, den intracellulære cytokiner fargings assay 18, 19 eller ELISPOT-analysen 20, 21. Disse teknikkene er imidlertid ofte kreve at effektor-T-celler stimuleres in vitro, noe som kan endre den samlede funksjonelle aviditet av befolkningen 22.. De fta assays derfor gir en forbedring i forhold til eksisterende teknikker, som måler CD4 + T-celle-og CD8 + T-celle dose-respons in situ, i sanntid mot flere epitoper samtidig, og så gi et verdifullt tillegg til eksisterende teknikker for å måle T-celle effektorfunksjon. Vi antar at bruken av fta-teknologi kan bli verdifulle i screening immunterapi strategier laget for å generere høykvalitets T-celle-responser, for eksempel vaksiner rettet mot HIV-1 og hepatitt C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av prosjekttilskudd # 1010395 (BQ og CP) og # 525431 (CR), og et program Grant # 455395 (CP) fra National Health and Medical Research Council of Australia, en Australian Centre for hepatitt og HIV Virology EOI 2012 stipend (CR og RJJ) og et stipend fra Gordon og Grete Bootes Foundation (BQ og CR). Vi ønsker å takke Harpreet Vohra og Michael Devoy for deres utmerkede vedlikehold av JCSMR FACS laboratorium, den australske Cancer Research Foundation Biomolekylære Resource Facility, JCSMR, ANU, for peptidsynteser, og Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australia for å gi foreldre HIV vaksineaksjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
