Summary
Förmågan att övervaka T-cellssvar i detalj in vivo är viktig för utvecklingen av vår förståelse av immunsvaret. Här beskriver vi användning av fluorescerande mål arrayer (frihandelsavtal) i en in vivo cellanalys T som bedömer> 250 parametrar samtidigt med flödescytometri.
Abstract
Förmågan att övervaka T-cellsvar in vivo är viktig för utvecklingen av vår förståelse av immunsvaret och utformningen av immunterapier. Här beskriver vi användningen av fluorescerande mål array (FTA)-teknik, som utnyttjar vitala färgämnen såsom karboxifluorescein succinimidylester (CFSE), violett laser exciterbara färgämnen (CellTrace Violet: CTV) och röd laser exciterbara färgämnen (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) att kombinatoriskt etikett mus lymfocyter i> 250 urskiljbara fluorescerande cell kluster. Cell kluster inom dessa frihandels kan pulsas med major histocompatibility (MHC) klass-I och MHC klass II-bindande peptider, och därigenom agera som målceller för CD8 + och CD4 +-T-celler, respektive. Dessa frihandels cellerna förblir livskraftiga och fullt fungerande, och kan därför administreras i möss för bedömningar av CD8 + T-cell-medierad dödandet av FTA målceller och CD4 + T-cell-mediterade help av FTA B cell målceller i realtid in vivo genom flödescytometri. Eftersom> 250 målceller kan bedömas på en gång, tekniken tillåter övervakning av T-cellsvar mot flera antigenepitoper vid flera koncentrationer och i flera replikat. Som sådan, kan tekniken mäta T-cellsvar på både en kvantitativ (t.ex. kumulativa storleken på svaret) och en kvalitativ (t ex. Funktions aviditet och epitop-korsreaktivitet av svaret) nivå. Häri beskriver vi hur dessa frihandelsavtal är konstruerade och ge ett exempel på hur de kan användas för att bedöma T-cellssvar som induceras av ett rekombinant poxvirus vaccin.
Introduction
T-celler spelar en central roll i det adaptiva immunsvaret och är ofta riktade för manipulation i immunoterapi. CD4 + T-celler svarar på främmande antigen genom att utsöndra cytokiner som reglerar många aspekter av immunitet och kan också direkt hjälper B-celler att tillverka antikroppar. CD8 + cytotoxiska T-celler (CTL) kan även reagera på främmande antigen genom att utsöndra cytokiner och spelar en central roll i att direkt döda celler som uttrycker ett främmande antigen. Den grundläggande interaktion som initierar dessa T-cell effektorfunktioner involverar interaktion av T-cellreceptorn (TCR) med främmande peptider som visas på MHC-molekyler på ytan av celler. CD4 + T-celler känner igen peptider som visas på MHC-klass-II-molekyler på antigenpresenterande celler och CD8 + T-celler känner igen peptider som visas på MHC-klass-I-molekyler som normalt visas på mikrob-infekterade celler.
Föratt bedöma den roll T-celler spelar i ett immunsvar, är det väsentligt att deras effektorfunktioner mäts av tillförlitliga och känsliga tekniker. Vanliga metoder för T-cellsvar bedömning inkluderar; MHC class-I/II/peptide tetramer reaktivitet; cytokinproduktion av ELISPOT och intracellulär cytokin färgning; och dödar kapaciteten med 51 ^ Cr-frisättningsanalyser. Dessa analyser är emellertid vanligen utförs ex vivo med stimulering in vitro, eller ger begränsad insikt i T-cellfunktionen. Helst vid mätning svar T-cell det skulle vara fördelaktigt att bedöma dem på plats, in vivo när de uppstår, utan manipulation av T-celler för att undvika förändringar i funktionella parametrar som kan uppstå genom stimulering in vitro. Några av de mest använda in vivo T-cell-funktionella analyser är baserade på mätning av CTL-förmedlat dödande av målceller pulserade med MHC klass I-bindande peptider, som är uppräknade i vivovia sin upptäckt genom fluorescerande märkning med vitala färgämnen såsom CFSE. Även om dessa typer av analyser kan övervaka CTL medierad dödandet av målen när de råkar in vivo, har de tidigare haft en relativt begränsad förmåga att bedöma dödandet av flera mål som uppvisar olika koncentrationer och olika typer av peptidepitoper, som krävs för att möjliggöra kvalitativa parametrar som funktionell aviditet och epitop variant korsreaktivitet bedömas. Dessa analyser dessutom inte ge någon information om CD4 + T-cellsmedierade reaktioner.
För att övervinna många av de begränsningar med nuvarande metoder som används för att bedöma T-cellssvar, har vi nyligen utvecklat en multiplex-analys baserad på fluorescensmålgrupp kedjor (frihandels), som möjliggör kontroll av T-cellsvar mot> 250 målceller samtidigt i ett djur genom flödescytometri 1, 2. Frihandels består av lymfocyter märkta med SEVmänna koncentrationer och kombinationer av vitala färgämnen som CFSE, CTV och CPD möjliggör> 250 cell kluster av unika fluorescens som ska genereras. Eftersom dessa celler förblir livskraftiga och fullt fungerande, kan de injiceras i djur för att möjliggöra övervakning av deras interaktion med effektor T-celler in vivo 3. Till exempel kan cellkluster FTA pulsas med MHC klass-I-bindande peptider för att medge utvärdering av antigen-specifik CTL-medierad avdödning av målceller ett. Dessutom kan cellkluster FTA även pulsas med MHC-klass-II-bindande peptider, vilket möjliggör bedömning av antigenspecifik T-hjälparceller (T H)-aktivitet genom att utvärdera aktivering (genom bedömning av aktiveringsmarkörer såsom CD69, CD44 och / eller CD62L) av B-celler i frihandelsavtalet som bär besläktade peptid 2. Sedan mer än 250 mål kan upptäckas samtidigt, är det möjligt att mäta CTL och T H svar mot många mål cell kluster pulsade med numerous peptider vid olika koncentrationer och inkluderandet av många replikat. FTA-analysen ger därför en oöverträffad nivå av T-cell effektor svar bedömning in vivo.
Här beskriver vi i detalj konstruktionen av en FTA och visa hur de kan tillämpas för att bedöma T-cellssvar in vivo. Förfarandet beskriver konstruktionen av en FTA består av 252 urskiljbara cellkluster genom användning av tre vitala färgämnen, bestående av sex upprepningar av 42 cellkluster pulsade med MHC-klass-I och II-bindande peptider. Märkningen av 42 cellkluster förekommer i 10 ml konisk botten rör och det är bra att lägga dem i ett provrörsställ som visas i tabell 1. Kan Metoden anpassas för mindre antal urskiljbara kluster som krävs genom att minska mängden av märkning för varje färgämne utförs 1.
Vi belyser nyttan av analysen genom att visa hur det kan mäta responses genereras av rekombinant pox-virus vaccination mot flera epitoper i en liten kohort av möss. Detta visar hur FTA-analysen kan användas för att mäta kumulativa svar och funktionell affinitet genom respektive användning av arean under kurvan (AUC) bedömningar och mätning av effektiv peptid koncentration som krävs för att generera halva maximala svar (EC 50).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Möss som används inom ramen för detta protokoll hanterades i enlighet med riktlinjerna i Australian National University djurförsöks etikkommitté och möss avlivades genom halshuggning.
1. Dye och peptid Förberedelse
- Dye beredning
OBS: Färgämnen är förspädda vid olika koncentrationer för att möjliggöra märkning av celler vid diskreta fluorescensintensiteter. CFSE används vid sju koncentrationer som görs via 3,5-faldig seriespädningar, och CTV och CPD används vid sex olika koncentrationer som görs via 3,7-faldig spädningar (se tabell 2-4). Aktie koncentrationerna av färgämnen som anges i tabellerna 2-4 kommer att användas för att märka målceller vid de slutliga färgämneskoncentrationer som anges i tabellerna 2-4. Färgämnen reagerar vid exponering för vattenlösning. Det är därför viktigt att flaskorna de återfå rumstemperatur innan du öppnar för att minimera exponeringen av färgämnen till kondens.- CFSE
OBS: CFSE köps som carboxyfluorescein diacetat succinimidylester (CFDA, SE, MW 557,47), vanligen vid 25 mg / flaska.- Resuspendera 25 mg CFSE i 4,48 ml DMSO för att erhålla en 10 mM stamlösning.
- Seriellt utspädd CFSE: Lägg till 35 pl av 10 mM CFSE lager i 87,5 ^ il DMSO och upprepa detta med utspädd förrådslösning för att ge varje färgämneskoncentrationen i tabell 3.
- CTV
Obs: CTV typiskt köpt i förpackningar om nio flaskor, vilka vardera kan rekonstitueras med 10 | il av DMSO för att generera en 10 mM lösning av färgämnet.- Bered och samla alla 9 flaskor CTV med 90 l av DMSO för att ge en 10 mM lösning.
- Seriellt utspädd CTV: Addera 11 pl av 10 mM CTV lager i 29,7 ^ il DMSO och upprepa detta med utspädd förrådslösning för att ge varje färgämneskoncentrationen i tabell 2.
- CPD
Anmärkning: CPD (MW 792,6) är typisktly köpas som 0,5 mg / flaska.- Resuspendera 0,5 mg CPD i 63 ml DMSO att få en 10 mM lösning.
- Seriellt utspädd CPD: Lägg till 11 pl av 10 mM CPD lager i 29,7 ^ il DMSO och upprepa detta med utspädd förrådslösning för att ge varje färgämneskoncentrationen i Tabell 4.
Anm: Dye lagren kan lagras vid -20 ° C under flera månader och kan tinas och refrozen flera gånger utan väsentlig förlust i funktion.
- CFSE
- Peptid beredning
Anm: MHC klass-I-bindande peptider är i allmänhet används för att pulsera målcellerna vid sex olika koncentrationer med användning av 10-faldiga utspädningar från en utgångskoncentration av 1 fiM (tabell 5). MHC klass II-bindande peptider är i allmänhet används för att pulsera målcellerna vid sex olika koncentrationer med användning av 3-faldiga utspädningar från en utgångskoncentration av 400 pM (Tabell 5). Varje peptid görs vid 2x slutlig koncentration i PBS sådan that varje peptidkoncentration har en minimivolym på 250 pl. Peptid lager kan förberedas före FTA konstruktion och förvaras vid -20 ° C utan att förlora sin funktion.- Förberedelse lager MHC klass-I-bindande peptider
- Förbered den högsta koncentrationen av varje peptidepitop till 2 ^ M stamlösningar (2x 1 mikrometer)
- Serie späda MHC klass-I-bindande peptider: till 44,4 l av 2 ^ M peptidstamlösning till 400 l PBS. Upprepa detta med utspädd förrådslösning för att ge varje peptidkoncentration i tabell 5.
- Förbereda lager MHC klass II-bindande peptider
- Förbered den högsta koncentrationen av varje peptid epitop till 800 pM stamlösningar (2x 400 pM).
- Serie späda MHC klass II-bindande peptider: lägga 150 l av 800 ^ M peptidlösning i 300 l av PBS. Upprepa detta med utspädd förrådslösning för att ge varje peptidkoncentration i tabell 5
2. FTA Förberedelse
Obs! Nedan beskrivs konstruktionen av en FTA består av celler pulserade med 7 olika peptidepitoper vid 6 olika koncentrationer (dvs. 42 cell kluster.) Upprepas 6 gånger för att generera 252 urskiljbara cell kluster. Inom varje upprepning, en cellklump inte pulsade med någon epitop (noll), är inkluderad som en kontroll. Det är till hjälp för frihandelsområden att ha en CD45 allotyp skillnad från värddjur för att tillåta deras diskriminering från mottagarceller genom märkning antikropp vid tiden för analysen. Annars frihandels kan märkas med andra färgämnen såsom PKH-26 för detta ändamål (beskrivet i steg 2.6). Typiskt FTA förberedelse förfarande som genomförts från början till slut under ett sammanträde.
- Label 42, bottnad 10 ml koniskt plaströr 1-42 (som i tabell 1 för exempel).
- Framställning av celler
- Isolera mjälte och / eller lymphnodes från möss. Förbered enda cellsuspension från vävnader genom att mosa genom en 70 um pored sikt med en 5 ml spruta kolv och räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
- Resuspendera lymfocyter vid upp till 200 x 10 6 celler / ml i 11,5 ml av Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI eller motsvarande), som innehöll 5% fetalt kalvserum (FCS). OBS: Det är viktigt att använda en buffert med hög aminhalt för att minimera färgämne toxicitet för celler 3.
- CTV märkning
Obs: Celler initialt märkta med 6 koncentrationer av CTV.- Grundligt resuspendera cellerna genom att vända röret flera gånger. Lägg till 1,9 ml cellsuspension till 6 av de 10 ml rör märkta 37-42, noga med att inte blöta den övre halvan av rören.
- Att märka cellerna med CTV, ta bort röret locket och lägg upp röret horisontellt.
- Addera 83 pl av PBS till den icke vätta delen vid toppen av röret och för att detta tillägg 17 | il lager CTV (se Table 2 för vilka stamlösning tilldelas vilken rör). Anmärkning: En icke vätta röret är viktigt att förhindra att cellsuspensionen rörelse och för tidig blandning av cellösningen med färgämneslösningen.
- Förslut röret och blanda cellsuspensionen med färgämnet snabbt och grundligt genom att vortexa.
- Upprepa steg 2.3.2-2.3.4 för stamlösningar av CTV i de utsedda rör som beskrivs i tabell 2.
- Inkubera cellerna under minst 5 min vid rumstemperatur (20 ° C).
- CFSE märkning
- Efter CTV märkning, 5 ml RPMI innehållande 5% FCS till varje rör och grundligt resuspendera cellerna genom att vortexa.
- Från röret 37 överföra 1 ml cellsuspension till rören 31, 25, 19, 13, 7, och 1.
- Från röret 38 överföring 1 ml av cellsuspension till rören 32, 26, 20, 14, 8 och 2.
- Från röret 39 överföra 1 ml cellsuspension till rören 33, 27, 21, 15, 9, och 3.
- Från röret 40 överföra 1 ml cellsuspension till rör 34, 28, 22, 16, 10, och 4.
- Från röret 41 överföring 1 ml av cellsuspension till rören 35, 29, 23, 17, 11 och 5.
- Från röret 42 överföra 1 ml cellsuspension till rör 36, 30, 24, 18, 12 och 6
OBS: Se till att inte blöta den övre halvan av rören under stegen 2.4.1.1-2.4.1.6.
- Att märka cellerna med CFSE, ta bort röret locket och lägg upp röret horisontellt.
- Addera 103 ml PBS i den icke vätta delen vid toppen av röret och till denna tillsätts 7 ml stam CFSE (se tabell 3 för vilka stamlösning tilldelas till vilken röret).
- Förslut röret och blanda cellsuspensionen med färgämnet snabbt och grundligt genom att vortexa.
- Gör steg 2.4.2-2.4.4 för stamlösningar av CFSE på anvisade rör som beskrivs i tabell 3.
- Inkubera cellerna under minst 5 min vid rumstemperatur (20 ° C).
- Tvätta celler: Späd cellsuspensionen med 9 ml 20 ° CRPMI innehållande 5% FCS, sedimentet genom centrifugering vid 300 x g under 10 min vid 20 ° C och avlägsna supernatanterna genom aspiration med en överföringspipett.
- Efter CTV märkning, 5 ml RPMI innehållande 5% FCS till varje rör och grundligt resuspendera cellerna genom att vortexa.
- Peptid pulsning och celltvättan
OBS: Efter att cellerna har märkts med CTV och CFSE, de pulsade med MHC klass-I-och / eller MHC klass-II-bindande peptider (beredd i 1.2). En av de cellpopulationer får inte heller pulsades med peptid (t. ex. Nil i Tabell 1) och användes som en negativ kontroll för beräkning av T-cellssvar.- Peptid pulsning
- Återsuspendera cellerna i en total volym av 250 | il RPMI innehållande 5% FCS. Not: Normalt 50 pl av cellsuspensionen står efter aspirering av supernatanten vid slutet av steg 2.4.7, därför tillsätt 200 | il medium till cellpelleten.
- Addera 250 pl av pre beredda peptidlager (som i tabell 5) för att på lämpligt sätt betecknad rör (som i tabell 1) och vara sure för att inkludera ett kontrollrör PBS sättas ensamma utan peptid som en Nil kontroll.
- Blanda cellsuspensioner med en virvel. OBS: Det är viktigt att varje peptidepitop och varje peptidkoncentration tilldelas ett enda rör och detta registreras tydligt utifrån den förväntade fluorescens av cellerna i detta rör, eftersom fluorescens tecknandet av detta kluster kommer att definiera denna peptid (som i tabell 1 till exempel).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 1 timme.
- Cell tvättning
- Tillsätt 5 ml iskall (4 ° C) RPMI innehållande 5% FCS till cellsuspensionen och återsuspendera cellerna genom att vända röret. Låg bakom försiktigt cellsuspensionen med 3 ml iskall (4 ° C) FCS.
- Sediment cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 10 min vid 4 ° C. Använd långsam acceleration och bromsning för att säkerställa att gränsytan av FCS och cellsuspensionen lösningen bibehålls.
- Försiktigt aspirera bort RPMI och sedanFCS med en pipett, lämnar de tvättade cellpellet ostört. Obs: Användningen av en FCS underlag för att tvätta celler bidrar till att säkerställa så mycket peptidlösning avlägsnas från cellerna som möjligt och därmed begränsa exponering av cellpopulationer till flera fria peptider när celler slås samman.
- Tvätta cellerna en gång: Resuspendera cellpelletar i 10 ml 4 ° C RPMI innehållande 5% FCS. Sediment cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 10 min vid 4 ° C. Häll av överstående.
- Pool alla cellpopulationer samman till ett enda rör med en pipett med hjälp av 6 ml 4 ° C RPMI innehållande 5% FCS. Sediment poolade celler genom centrifugering vid 300 x g under 10 min vid 4 ° C. Sug bort supernatanten med en överföringspipett.
- Peptid pulsning
- CPD Cell märkning
Observera: På denna punkt kan genereras sex inom analys replikat genom märkning peptid pulsade celler med 6 olika koncentrationer av CPD.- Lägg till 11.4 ml 20 ° CRPMI innehållande 5% FCS till den poolade cellpelleten och resuspendera noggrant med en pipett.
- Lägg till 1,9 ml cellsuspension till 6, 10 ml rör märkta AF, se till att inte blöta den övre halvan av rören.
- Att märka cellerna med CPD, ta bort röret locket och lägg upp röret horisontellt.
- Addera 92 pl av PBS till den icke vätta delen vid toppen av röret och till denna tillfoga lager CPD (se tabell 4 för den kvantitet av förrådslösningen tilldelad till varje rör).
- Förslut röret och blanda cellsuspensionen med färgämnet snabbt och grundligt genom att vortexa.
- . Ta steg 2.6.3-2.6.5 för stamlösningar av CPD inom de utsedda rör som beskrivs i tabell 4 OBS: Till skillnad CFSE och CTV, inte koncentrationen CPD märkning exakt linjärt relaterad till den resulterande fluorescensintensiteten av märkta celler, och så koncentrationen märkning används för att få samma avstånd fluorescerande toppar flera märkta populationer har varitbestämmas empiriskt (se tabell 4).
- Inkubera cellerna under minst 5 min vid rumstemperatur (20 ° C).
- Tvätta cellerna två gånger: Resuspendera cellerna till 10 ml med 20 ° C RPMI innehållande 5% FCS. Sediment cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 10 min vid 20 ° C. Sug bort supernatanten med en överföringspipett. Upprepa.
- Pool alla celler ihop till ett enda rör med hjälp av 8 ml 4 ° C RPMI innehållande 5% FCS med en pipett. Sediment poolade celler genom centrifugering vid 300 x g under 10 min vid 4 ° C och aspirera bort supernatanten med en överföringspipett.
- (Tillval) PKH-26 Cell märkning
Obs: Om frihandels inte kan konstrueras med celler som uttrycker en CD45-allotypiska skillnaden att vara värd möss, kan de märkas med PKH-26 för att medge deras diskriminering från mottagarceller.- Lägg till 2,9 ml 20 ° C PBS till den poolade cellpelleten och slamma noggrant med en pipett.
- Lägg cellsuspension till ett nejn fuktade 10 ml tub, noga med att inte blöta den övre halvan av röret.
- Ta bort röret locket och lägg upp röret horisontellt.
- Lägg 58 ul av utspädningsmedel K (i PKH-26 färgämnesskit) till den icke vätta delen vid toppen av röret och för att detta tillägg 42 | il av 1 mM lager PKH-26.
- Förslut röret och blanda cellösningen med färgämnet noga genom virvling.
- Inkubera cellerna under minst 10 minuter vid rumstemperatur (20 ° C).
- Tvätta cellerna två gånger: Resuspendera cellerna till 10 ml med 20 ° C RPMI innehållande 5% FCS. Sediment cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 10 min vid 20 ° C. Sug bort supernatanten med en överföringspipett. Upprepa.
- Injektion frihandels i värddjur
Notera: För att mäta T-cellsvar in vivo, är frihandels injiceras i djur som har ett aktivt immunsvar och lämnas kvar på platsen i upp till 24 timmar. Det är kritiskt att de frihandels också injiceras i ett naivt djur som en negativ kontroll.- Räkna och resuspendera cellerna vid 2,5 x 10 8 celler per ml i PBS. Injicera 200 | il av celler intravenöst i värdmöss, inklusive ett naivt djur som en kontroll.
3. Flödescytometri
- 18-24 timmar efter FTA injektion skörd blod eller mjälte (eller andra vävnader av intresse) från värdmöss.
- Förbered enda cellsuspension från vävnader genom att mosa genom en 70 um pored sikt med en 5 ml spruta kolv.
- Resuspendera cellerna i upp till 65 x 10 6 celler / ml i PBS innehållande 0,1% BSA.
- Dispensera 100 | il alikvoter av cellsuspensionen i brunnarna på en mikrotiterplatta för antikroppsmärkning.
- Etikett celler med fluorokromkonjugerade märkta antikroppar och fluorescerande livskraft sonder med spektralt kompatibla fluorescens till CFSE, CTV och CPD. OBS: Antikroppar till B cellmarkörer såsom B220 och aktiveringsmarkörer såsom CD69 är viktigt att mäta B-cellsaktivering, om du använder FTA för att mäta T H-cellsvar 2. Ta med en antikropp till CD45.1 och / eller CD45.2 om frihandelsavtal och värdmöss har en CD45 allotypiska skillnad.
- Addera 100 pl av 2x förrådslösning av antikroppar / viabilitet färgämnen (i PBS innehållande 0,1% BSA) till 100 | il alikvoter av celler, blanda väl och inkubera på is (4 ° C) under 30 min.
- Tvätta celler: Sediment celler genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten. Återsuspendera cellerna i 200 | il PBS innehållande 0,1% BSA, sediment celler genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i en total volym av 400 | il av PBS innehållande 0,1% BSA, filtrera celler genom en 70 | im mesh och analysera genom flödescytometri i en flödescytometer i stånd att detektera de relevanta fluorescerande färgämnen och konjugat. Samla upp till 3 x 10 6 lymfocyter händelser för att lösa varje FTA cell kluster och få tillräckligt med celler för statistiskacal analys. OBS: Se till att alla de typiska kontroller (t.ex. enstaka färgade kontroller) för flödescytometri används. Normalt kräver CFSE excitation från en blå laserkälla (vanligtvis vid 488 nm) och detektion med bandpassfilter centrerade över 520 nm; CTV kräver excitation en violett laserkälla (vanligtvis vid 405 nm) och detektion med bandpassfilter centrerade över 450 nm; och CPD kräver excitation från en röd laserkälla (vanligtvis vid 633 nm eller 640 nm) och detektion med bandpassfilter centrerade över 670 nm.
4. Dataanalys
- Analysera flödescytometri data med hjälp av standard flödescytometri programvara (se representativa resultat för ett exempel på den typ av gating strategi anställd).
- För% specifik dödande, räkna antalet celler i varje FTA cell kluster pulsade med MHC klass-I-bindande peptider och FTA kluster som inte peptidpulsade ("Nil") och med hjälp av följande formel för att beräkna% Specifik Killing.
% Specifik avdödning
Anmärkning: I ovanstående formel "primas" avser mål från djur som tros ha ett immunsvar mot målpeptider, "naiva" avser mål från naiva djur, "peptid" avser mål pulsade med peptider och "noll" hänvisar till målen inte pulsade med några peptider. - För B-cellaktivering som ett mått på T-H-aktivitet, beräkna det geometriska medelvärdet för fluorescensintensiteten (GMFI) av CD69-antikropp fluorescens på FTA-B-celler pulserade med MHC-klass-II-bindande peptider i "primade" djur och från detta subtrahera GMFI av CD69-uttryck på motsvarande FTA B-celler i "naiva" djur för att ge ett mått på T-H-aktivitet.
- Från den statistik som genereras i steg 4.2 och 4.3, användmatematiska kalkylprogram som GraphPad Prism för att beräkna andra kvantitativa och kvalitativa parametrar som area under kurvan och EC50 (en ingående beskrivning av hur dessa beräkningar utförs för AUC finns på
http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm och för EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som ett exempel på användningen av FTA-analysen, var en BALB / c mus immuniserad med rekombinant vacciniavirus (VV) som uttrycker HIV-I-epitoper (VV-HIV) och svar till HIV-I CTL-epitoper, Gag, Gag mut, Env och Pol, VV CTL epitoper F2L och F2L mut, och HIV-I T H cellepitop, Gag Th (enligt 2) bedömdes med hjälp av en 252 parameter FTA-analys (Figur 1B). Epitop varianter av Gag (Gag mut) och F2L (F2L mut) uttrycks inte i VV-HIV-vektor och därför svar mot dessa epitoper är reflekterande av epitop variant kors reaktiva T-cellsvar. Naiva möss injicerades också med FTA som en negativ kontroll. Frihandelsavtalet blev diskriminerade från värd musceller från PKH-26 märkning och FTA B-celler diskrimineras av B220 antikroppar färgning via flödescytometri (figur 1A och 1B). Var och en av de 6 inom djurreplik var gated baserat på CPD fluorescens (Figur 1C (figur 1D). % Specifik Dödandet av varje replikat bedömdes genom att jämföra FTA kluster celldöd i primade djur i förhållande till motsvarande FTA kluster i naiva djur (figur 1D). T H-aktivitet bedömdes genom att jämföra FTA B-cell uppreglering av CD69 i primade djur i förhållande till motsvarande FTA B-cellskluster i tidigare obehandlade djur (figur 1E).
Från denna analys alstras VV-HIV-infektion starka CTL-svar mot den immunodominanta VV epitop F2L, med 100% av FTA-målceller pulserade med 0,001 mM eller mer av den epitop som avlägsnas från mjälten (Figur 2A). Det fanns också en stark respons genereras mot den nya varianten av F2L, F2L mut, med 100% av FTA-målceller pulserade med 0,01 mM eller mer av epitopen avlägsnas från mjälten. SedanF2L mut inte är närvarande i det infekterande viruset, visar att detta svar en epitop variant korsreaktiv respons. Det fanns också en relativt måttlig respons genereras mot mål som uttrycker HIV Gag-epitop och en svag korsreaktivt svar mot variantform av denna epitop, HIV-gag-mut. Det föreföll att vara försumbara responser genereras till de HIV-pol-och HIV-env CTL-epitoper.
Förutom CTL-svar, FTA exempel assay visas mätte också T H svar genom att utvärdera aktivering av FTA B-cell som uttrycker HIV-MHC-klass-II-bindande epitopen HIV Gag Th (Figur 2B). Detta visade antigenspecifika B-cellsaktivering inträffade i primade djur tyder generation av hiv Gag Th-specifika T H cell effectors.
Dessa mått på T-cellsvar magnitud kan sammanfattas genom att generera area under curve värden (AUC) för var och en av epitopema (figur 2C) att MEAder den kumulativa storleken på svaret.
Utöver omfattningen av antigenspecifika och epitop variantkorsreaktiva svar tillåter FTA assay funktionella mätningar aviditet göras. Exempelvis är de effektiva peptidkoncentrationer som användes för att pulsera FTA målceller som krävs för att ge halv maximala svar (EG-50), visas för CTL-effektorer (figur 2D). Detta visade den funktionella aviditet till epitoper F2L mut, hiv Gag och hiv Gag mut, var ungefär 10, 100 och 4000 gånger lägre, respektive, än svar som genereras till den dominerande VV epitop F2L.
Tabell 1. Layout av en 252 parameter FTA. Typisk layout av en kopia av en 252 FTA består av 42 prover / rör pulsade med 7 olika peptidepitoper vid 6 skillt koncentrationer och inklusive en un pulsad (Nil) prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tube Antal | Volym (^ il) | Dye lager (mM CTV) | Slutlig koncentration (pM) |
| 37 | 0 | 0 | 0 |
| 38 | 17 | 0,053 | 0,451 |
| 39 | 17 | 0,197 | 1,48 |
| 40 | 17 | 0,73 | 6,21 |
| 41 | 17 | 2,7 | 23 |
| 42 | 17 | 10 | 85 |
Tabell 2. CTV lager används för att märka celler. Volym listadeCTV lager används för att märka celler i 2 ml för att ge den slutliga märkningen färgämneskoncentration.
| Tube Antal | Volym (^ il) | Dye lager (mM CFSE) | Slutlig koncentration (pM) |
| 37-42 | 0 | 0 | 0 |
| 31-36 | 7 | 0,022 | 0,139 |
| 25-30 | 7 | 0,078 | 0,492 |
| 19-24 | 7 | 0,23 | 1,45 |
| 13-18 | 7 | 0,82 | 5,17 |
| 7-12 | 7 | 2,9 | 18,3 |
| 1-6 | 7 | 10 | 63,1 |
Tabell 3. CFSE lager används för att märka celler. Volym noterade CFSE lager ossed att märka celler i 1,11 ml för att ge den slutliga märkningen färgämneskoncentrationen.
| Tube Antal | Volym (^ il) | Dye lager (mM CPD) | Slutlig koncentration (pM) |
| ETT | 0 | 0 | 0 |
| B | 4 | 0,053 | 0,106 |
| C | 6,3 | 0,197 | 0,62 |
| D | 7,5 | 0,73 | 2,74 |
| E | 7,3 | 2,7 | 9,86 |
| F | 7,7 | 10 | 38,5 |
Tabell 4. CPD lager användas för att märka celler. Volym listad CPD materiel som används för att märka celler i 2 ml för att ge den slutliga labeling färgämne koncentration.
| Peptidkoncentration (pM) | |||||||
| MHC klass I-bindande peptider | 0 | 0,00002 | 0,0002 | 0,002 | 0,012 | 0,2 | 2 |
| MHC klass II-bindande peptider | 0 | 3,29 | 9,88 | 29,6 | 88,9 | 266 | 800 |
Tabell 5. MHC-klass I och II-bindande peptidlagerkoncentrationer. Typiska lagerkoncentrationer 1 av peptidepitoper används för att konstruera en FTA 1. Dessa koncentrationer är 2x de slutliga koncentrationerna som användes för att pulsera målcellerna.
Figur 1. Typiska flödescytometrianalys av frihandels. Splenocyter från BALB / c-möss användes för att konstruera en 252 parameter FTA såsom beskrivits i texten. FTA kluster pulsades med sex koncentrationer (såsom anges i tabell 5) av 7 olika virala epitoper, inklusive MHC klass-I-bindande epitoper F2L (SPYAAGYDL, en L d-restricted vacciniavirus (VV)-epitop); F2L mut (SP G AAGYDL, en variant av F2L), Gag (AMQMLKETI, en Kd-begränsade hiv Gag epitop 4), Gag mut (AMQMLK D TI, en variant av hiv Gag 5), Pol (VGPTPVNII, en D-d begränsade HIV pol epitop 6), Env (RGPGRAFVTI, en D-d-begränsade HIV env epitop 7); och MHC-klass-II-bindande peptid Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, en H-2 '^-begränsade HIV Gag-epitop 4). Frihandels injicerades iv. i en BALB / c-mus som hade smittats intranasalt (i.) 6 dagar tidigare med recombinant VV uttrycker HIV-epitoper (VV-HIV, primas djur). FTA injicerades även in i naiva möss som kontroll. Efter 18 timmar in vivo, var FTA celler som finns i splenocyt suspensioner från värdmöss analyseras med flödescytometri. A) Typisk progressiv gating strategi för att identifiera FTA celler visar grindar för lymfocyter, under och PKH-26 + FTA celler (det är också bra att lösa levande celler med användning av en viabilitet färgämne som Hoechst 33258, ej visad). B) 3D-diagram som visar alla FTA kluster från naiva värdmusen. C) Histogram diagram som visar FTA CPD fluorescens märkning var och en av sex intra djur replikerar. D) 2D-diagram som visar en av de 6 inom djur FTA B-cell replikerar att presentera de olika typer och koncentrationer av epitoper från naiva och primade djur. Detta visar avsaknaden av FTA celler i primade djur i förhållande till den naiva djur, avslöjar "döda händelser"av CTL som ligger till grund för frihandelsavtalet döda analys 1. e) Histogram analys av FTA B-cell uttryck av aktiveringsmarkören CD69 på primade djur i förhållande till naiva djur, som utgör grunden för frihandelsavtalet T-hjälpar-analys 2. klicka här Vänligen för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Frihandels möjliggöra mätningen av storleken och aviditet av T-cellsvar in vivo. En 252 parameter FTA användes för att bedöma T-cellssvar i möss som infekterats med VV-HIV såsom beskrivs i figur 1. A)% Specifik avdödning beräknades för alla CTL-epitoper och resultat från var och en av sex replicates visas (vänster fält) och medel-och standardfelet för organet (höger panel) visas. B) T H svar utvärderades genom att mäta aktivering av FTA B-cell presenterande HIV Gag Th epitop för vardera av de sex intra djur replikat ( vänster panel) och medel-och standardfelet för organet (höger panel) beräknas. C) AUC-mätningar för% specifik avdödning (a) och T-hjälpar-svar (b) beräknades såsom ett mått på kumulativ magnitud. D) EC 50 mätningar beräknades för% Särskilda dödande uppgifter (a) som ett mått på funktionell aviditet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelen med FTA-baserade analyser är att de tillåter diskriminering av> 250 viabla och fullt funktionell mål cellpopulationer från en enda värddjur genom flödescytometri. Detta ger en nivå av komplexitet till in vivo-flödescytometri baserade analyser, som inte har varit möjligt tidigare. Detta markeras i de två djurexperiment som visas ovan, där svaren på 7 olika virala epitoper vid 6 koncentrationer skulle kunna övervakas i replikat om 6 samtidigt i ett enda djur som tillåter parametrar såsom AUC och EC50 som skall fastställas för T-cellsvar in vivo .
Förutom att mäta T-cellsvar in vivo, kan de FTA-baserade analyser modifieras för att mäta svaren in vitro 1. Detta innebär i huvudsak att lägga till frihandelsavtal till T-celler i kultur för att mäta svaren under flera timmar in vitro. En potentiell begränsning av in vitro-baserade analyser som använder frihandels är than tendens till de märkta celler i frihandelsavtalet att överlåta märkningen färgämnet till omgivande celler 1, 3. Detta kan resultera i minskad upplösning av FTA-cellkluster som deras fluorescens blir mindre tydlig mellan varje population. Detta är mer uppenbar i in vitro-analyser jämfört med in vivo-analyser, eftersom cellerna är i nära anslutning till de längre tidsperioder i in vitro-analyser. Denna förlust i upplösning på FTA-cellpopulationer kan minimeras i in vitro-analyser genom att minska odlingstiden av frihandels med effektor-T-celler och genom att använda frihandelsområden som har en mindre mål-cellpopulationer som har en större mängd "fluorescerande utrymme" mellan dem så att färgöverföring har mindre påverkan.
Vi har också noterat förlust i upplösning på FTA cellpopulationer när frihandelsavtal placerades in vivo under 48 timmar 1. Detta verkade vara resultatet av mål-B-celler i den FTA prolifegradering och därigenom minska färgämnesfluorescensintensitet. Detta är sannolikt en följd av B-celler som uppvisar besläktade antigen till antigenspecifik effektor CD4 + T-celler som resulterade i B-cellsstimulering. Det rekommenderas därför att analysen begränsas till ~ 24 h eller mindre när B-cells mål övervakas.
Förmågan att märka multipla (> 96) unika cellkluster fluorescent har rapporterats tidigare med hjälp av fasta icke-viabla celler 8. Färgningen av levande celler, har emellertid varit mer problematiskt med tillgängligheten av kompatibla vitala färgämnen och endast 8-12 viabla celler kluster har uppnåtts tidigare 9. Förmågan att generera> 250 unika fluorescerande livskraftiga och fungerande celler som redovisas här, är beroende av egenskaperna hos CFSE-liknande vitala färgämnen. Flera av dessa färgämnen, såsom CTV och CPD, har först nyligen blivit tillgängliga. Dessa färgämnen har karaktär av att vara i stånd attmärkning av celler med hög fluorescensintensitet, som är långlivade och låg varians 3. Dessa egenskaper i kombination med det faktum att det finns ett linjärt samband (i synnerhet i fallet med CFSE och CTV) mellan koncentrationen av det färgämne som används för märkning och fluorescensintensiteten hos de märkta cellerna, gör att celler kan märkas med flera (upp till 7 visas här) intensiteterna av varje färgämne som lätt kan särskiljas genom flödescytometri. Eftersom fluorescensemissionen av CFSE, CPD och CTV ha minimal spektral överlappning, kan de användas i kombination för att märka celler, vilket möjliggör upp till> 250 fluorescerande cellsignaturer som skall detekteras genom flödescytometri. Det bör noteras att för att åstadkomma märkning av celler med detta antal urskiljbara fluorescerande signaturer, är det viktigt att cellmärkning är snabbt utförd 10, 11 (för att alstra låg fluorescens varians) och i en lämplig buffert innehållandefria aminer 3 (till buffert färgämne toxicitet som annars kan uppstå med dessa färgämnen vid höga koncentrationer). Det är också viktigt att vid förvärv av frihandelsavtal med flödescytometri att felaktiga svängningar i händelse fluorescens övervakas (till exempel genom att mäta CFSE, CTV och / eller CPD fluorescensintensiteten över tiden). Detta är viktigt eftersom sådana variationer i händelse fluorescens som beror på maskin infört fel kan leda till feltolkningar av rätt målcellen kluster positionering som i sin tur kan leda till fel i de slutliga åtgärderna för T-cell effektorfunktionen. Sådan flödescytometer införda fel kan begränsas genom att säkerställa hög kvalitet prover bereds (särskilt uppmärksamma filtrera celler genom en 70 ìm mesh för att minimera ocklusion av fluid linjer i flödescytometern av stora cellaggregat) och att flödescytometern upprätthålls till en hög standard.
Mätning av T-cellssvar in vivohar utförts under många år med hjälp av vitala färgämnen såsom CFSE att övervaka målceller död in vivo 12. Typiskt för dessa analyser har dock varit endast kan övervaka upp till 7-8 olika målceller på en gång 13, och så ger en begränsad förmåga att bedöma dödandet av mål som uttrycker flera koncentrationer av flera epitoper som normalt krävs för att generera en detaljerad bedömning av parametrar såsom den funktionella aviditeten av T-cellssvar. I detta avseende kan tetramer dissociation analyser användas för att ge ett mått på T-cell aviditet från nyligen isolerade T-celler från 14 till 16. Denna teknik är dock mäter MHC / TCR bindningsförmågan, och så är inte en komplett bild av funktionell affinitet, vilket också kan bero på förändringar i strukturen av den immunologiska synapsen och tillståndet i T-cell signalering komponenter 17. Därför idealt kräver funktionell aviditet dos-responsexperiment som skall utföras. Dettahar åstadkommits tidigare med användning av in vitro-metoder, till exempel 51 ^ Cr-frisättningsanalys, intracellulär cytokin färgning assay 18, 19 eller ELISPOT-analysen 20, 21. Dessa tekniker är emellertid ofta kräver de effektor-T-celler stimuleras in vitro, som kan förändra den övergripande funktionell aviditet av befolkningen 22. FTA-analyser, därför erbjuder en förbättring jämfört med befintliga metoder, mätning av CD4 + T-celler och CD8 + T-cell dos-respons på plats, i realtid mot flera epitoper samtidigt, och så ger ett värdefullt tillskott till befintliga tekniker för att mäta T-cell effektorfunktion. Vi räknar med att användningen av FTA-teknik kan bli värdefulla i screening immunterapi strategier för att skapa högkvalitativa T-cellsvar, såsom vacciner mot HIV-1 och hepatit C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av projektbidrag # 1010395 (BQ och CP) och # 525.431 (CR), och en program Grant # 455395 (CP) från det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien, en australiska Centrum för hepatit och HIV Virology EOI 2012 bidrag (CR och RJJ) och ett bidrag från Gordon och Greta Bootes Foundation (BQ och CR). Vi vill tacka Harpreet Vohra och Michael Devoy för deras utmärkta underhåll av JCSMR FACS laboratoriet, Australian Cancer Research Foundation Biomolecular Resource Facility, JCSMR, ANU, för peptidsyntes, och Dr David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australien för att ge moder HIV vaccinlager.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
