생체 내에서 상세히 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 발전을 위해 중요하다. 여기에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 동시에> 250 매개 변수를 평가하는 생체 내 T 세포의 분석에서 형광 타겟 어레이 (FTA 체결)의 사용을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
생체 내에서 T 세포 반응을 모니터링 할 수있는 능력은 면역 반응에 대한 이해의 개발 및 면역 요법의 설계에 중요하다. 과 적색 레이저 흥분 염료 (셀 확산 염료 eFluor 670 : 여기 우리는 카르복시 숙신 에스테르 (CFSE), 바이올렛 레이저 흥분 염료 (CTV CellTrace 바이올렛)과 같은 중요한 염료를 활용 형광 대상 배열 (FTA) 기술의 사용을 설명 CPD )> 250 뚜렷한 형광 세포 클러스터로 레이블 마우스 림프구 된 조합입니다. 이러한 자유 무역 협정 내에서 세포 클러스터는 주요 조직 적합성 (MHC) 클래스-I과 MHC 클래스 II 바인딩 펩타이드와 펄스함으로써 각각 CD8 +와 CD4 + T 세포에 대한 표적 세포의 역할을 할 수있다. 이러한 FTA 세포는 실행 가능하고 완전한 기능을 유지하며, 따라서 FTA 대상 세포와 CD4 + T 세포 묵상 헬의 CD8 + T 세포 - 매개 살인의 평가를 할 수 있도록 마우스로 관리 할 수 있습니다유동 세포 계측법에 의해 생체 내에서 실시간으로 FTA B 세포 표적 세포의 P. > 250 표적 세포가 동시에 평가 될 수 있기 때문에, 기술은 여러 가지 농도의 복수 복제물 여러 항원 에피토프 대한 T 세포 반응의 모니터링을 허용한다. 이와 같이, 기술은 정량적 (반응의 예 누적 크기) 및 정 성적 (예. 기능적 결합력 및 응답의 에피토프 - 교차 반응성) 수준 모두에서 T 세포 반응을 측정 할 수있다. 여기서, 우리는 이들의 FTA가 생성 그들은 재조합 수두 바이러스 백신에 의해 유도 된 T 세포 반응을 평가하기 위해 적용 할 수있는 방법의 예를 제공하는 방법을 설명한다.
서론
T 세포는 적응성 면역 반응에서 중심적인 역할을하고 종종 면역 요법의 조작 대상이된다. CD4 + 이펙터 T 세포는 면역의 여러 측면을 조절하고 직접 항체를 생산하는 B 세포를 도울 수 사이토 카인을 분비하여 외부 항원에 반응한다. CD8 + 세포 독성 T 세포 (CTL을)도 사이토 카인을 분비뿐만 아니라 직접 외국 항원을 발현하는 세포를 죽이는의 중심 역할을하여 외부 항원에 응답 할 수 있습니다. 이러한 T 세포의 효과기 기능을 개시 기본적인 상호 작용은 세포의 표면에서 MHC 분자에 표시 외래 펩티드와 T 세포 수용체 (TCR)의 상호 작용을 수반한다. CD4 + T 세포는 일반적으로 미생물에 감염된 세포에 표시되는 MHC 클래스-I 분자에 표시된 펩티드를 인식하는 항원 제시 세포 및 CD8 + T 세포의 MHC 클래스 II 분자에 표시된 펩티드를 인식한다.
순서대로T 세포는 면역 반응에서 재생 역할을 평가하기 위해, 그들의 이펙터 기능은 신뢰성과 민감한 기술에 의해 측정하는 것이 필수적이다. T 세포 반응 평가를위한 일반적인 방법은 다음과 같습니다; MHC class-I/II/peptide 사량의 반응; ELISPOT 및 세포 내 사이토 카인 염색에 의한 ....
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프로토콜
참고 :이 프로토콜에서 사용하는 마우스는 호주 국립 대학교 동물 실험 윤리위원회의 지침과 마우스에 따라 처리 하였다는 자궁 전위에 의해 안락사했다.
1. 염료 및 펩타이드 준비
- 염료 준비
참고 : 염료가 분리 된 형광 강도의 세포의 라벨링을 할 수 있도록 서로 다른 농도에서 prediluted됩니다. CFSE 3.5 배 연속 희석을 통해 만든 일곱 농도로 사용하고, CTV와 CPD는 (2-4 표 참조) 3.7 배 시리얼 희석을 통해 만든 여섯 가지 농도로 사용된다. 표 2-4에 나열된 염료 스톡 농도를 표 2-4에 나열된 최종 염료 농도에서 표적 세포에 라벨을 사용한다. 염료는 수성 용액에 노출시 반응. 그것은 병이 이전에 응축에 염료의 노출을 최소화하기 위해 열을 RT 평형을 할 수 있다는 것이 중요하다.- CFSE
참고 : CFSE는 카르복시 디 아세테이트 숙신 이미 딜 에스테르 (CFDA, SE, MW 557.47)로 구매되는 일반적으로 25 ㎎ / 유리 병에.- 10 mM의 주식 솔루션을 얻기 위해 4.48 ㎖의 DMSO에 CFSE의 25 밀리그램을 Resuspend. ....
- CFSE
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결과
FTA 분석의 사용 예를 들어, BALB / C 마우스는 HIV-I CTL의 항원 결정기에 HIV-I 항원 결정기 (VV-HIV)과 응답을 표현하는 재조합 우두 바이러스 (VV)와 예방 접종을하고, 발언 금지, 발언 금지 MUT, 봉투와 폴, VV CTL 에피토프 F2L과 F2L의 MUT 및 HIV-I T H 세포 에피토프, 개그 목은 (2에 설명 된대로) 252 매개 변수 FTA 분석 (그림 1B)를 사용하여 평가 하였다. 개그 (개그 MUT) 및 F2L (F2L의 MUT)의 에피토프 변종은 VV-HIV 벡터로 표현하기 때문에 이러한 항원에 대한 반응은 항원의 변형 교차 반응성 T 세포 반응의 반사되어 있지 않습니다. 순진 마우스는 음의 컨트롤과 FTA 주사했다. FTA는 유동 세포 계측법 (그림 1A 및 1B)를 통해 B220 항체 염색으로 차별 PKH-26 라벨 및 FTA B 세포에 의해 .......
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토론
FTA 기반 분석의 장점은 유동 세포 계측법에 의해 하나의 호스트 동물에서> (250) 실행 가능하고 완전한 기능을 대상 세포 집단의 차별을 허용하는 것입니다. 이는 이전에 불가능했습니다 생체 유동 세포 계측법 기반 분석의 복잡성의 수준을 제공합니다. 이 6 농도에서 7 별개의 바이러스 항원에 대한 반응 등 AUC와 EC 50과 같은 매개 변수가 생체 내에서 T 세포 반응에 대해 결정 할 수 있도록 하나의 동물에서 동시에 6 복제물 모니터링 할 수있는 위의 2 동물 실험에서 강조 .
생체 내에서 T 세포 반응을 측정하는 이외에, FTA 기반 분석법은 시험관 내에서 하나의 응답을 측정하기 위해 수정 될 수있다. 이것은 본질적으로 체외에서 몇 시간에 걸쳐 반응을 측정하기 위해 문화에서 T 세포에 자유 무역 협정을 추가하는 작업이 포함됩니다. 자유 무역 협정.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 프로젝트 보조금 # 1010395 (BQ와 CP) 및 # 525431 (CR), 호주, 간염 및 HIV 바이러스학 EOI를 위해 호주 센터의 국립 보건 의학 연구위원회에서 프로그램 부여 # 455395 (CP)에 의해 지원되었다 2012 그랜트 (CR 및 RJJ)와 고든과 그레텔 목동 재단 (BQ와 CR)에서 부여. 우리는 JCSMR FACS 실험실의 그들의 우수한 유지 보수를 위해 Harpreet VOHRA 마이클 Devoy을 감사드립니다, 펩타이드 합성 호주 암 연구 재단 생명 자원 시설, JCSMR, ANU, 박사 데이비드 보일, CSIRO 동물 건강 연구소, 질롱, 호주 부모 HIV 백신의 주식을 제공.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| 태아 송아지 혈청 | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| 원심분리기 | Eppendorf | ||
| 유세포 분석기 (Fortessa 또는 파란색, 빨간색 및 보라색 레이저 소스와 동급)BD | Bioscience |
참고문헌
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R.
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재인쇄 및 허가
