Bruk av Fluorescent måloppstill for Vurdering av Cell Responses T<em> In vivo</em
Summary
Evnen til å overvåke T-celle-responser i detalj in vivo er viktig for utviklingen av forståelsen av immunresponsen. Her beskriver vi bruk av fluorescerende måloppstill (frihandelsavtaler) i en in vivo T celle analyse som vurderer> 250 parametere samtidig ved flowcytometri.
Abstract
Evnen til å overvåke T-celle responser in vivo er viktig for utviklingen av forståelsen av immunresponsen, og utformingen av immunterapier. Her beskriver vi bruk av fluorescerende target array (FTA) teknologi, som benytter vitale fargestoffer som karboksyfluorescens succinimidyl ester (CFSE), fiolett laser eksiterbare fargestoffer (CellTrace Violet: CTV) og rød laser eksiterbare fargestoffer (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD ) til combinatorially label muse lymfocytter i> 250 merkes fluorescerende celle klynger. Celle klynger innenfor disse FTAs kan pulseres med store histocompatibility (MHC) klasse I og MHC klasse II-bindende peptider og derved fungere som målceller for CD8 + og CD4 +-T-celler, respektivt. Disse FTA celler forblir levedyktig og fullt funksjonell, og kan derfor gis i mus for å tillate vurdering av CD8 + T celle-mediert dreping av FTA målcellene og CD4 + T-celle-mediterte help FTA B cell målceller i sanntid in vivo ved strømningscytometri. Siden> 250 målceller kan bli vurdert på en gang, gjør teknikken overvåking av T-celle respons mot flere antigen-epitoper ved flere konsentrasjoner, og i flere replikater. Som sådan kan den teknikk å måle T-celle responser på både en kvantitativ (for eksempel den kumulative omfanget av reaksjon), og en kvalitativ (f.eks. Funksjonelle aviditet og epitop-kryssreaktivitet av responsen) nivå. Heri beskrives hvordan disse FTAs er konstruert og gi et eksempel på hvordan de kan bli anvendt for å vurdere T celle responser indusert ved en rekombinant pox-virus-vaksine.
Introduction
T-celler spiller en sentral rolle i den adaptive immunrespons og er ofte målrettet for manipulasjon i immunterapi. CD4 + effektor T-celler svare på fremmed antigen ved å skille cytokiner som regulerer mange aspekter av immunitet og kan også direkte bidra til B-celler til å produsere antistoffer. CD8 + cytotoksiske T-celler (CTLs) kan også svare på fremmed antigen ved å skille cytokiner samt spille en sentral rolle i direkte drepe celler som uttrykker et fremmed antigen. Den grunnleggende interaksjon som initierer disse T-celle-effektor-funksjoner involverer interaksjon av T-cellereseptoren (TCR) med fremmede peptider som vises på MHC-molekyler på overflaten av cellene. CD4 + T-celler gjenkjenner peptider som vises på MHC klasse II-molekyler på antigenpresenterende celler og CD8 + T-celler gjenkjenner peptider som vises på MHC klasse-I-molekyler som er typisk vist på mikrobe infiserte celler.
Forfor å vurdere rollen T-celler spiller i en immunrespons, er det nødvendig at deres effektorfunksjoner blir målt ved pålitelige og følsomme teknikker. Vanlige metoder for T celle respons vurdering inkluderer; MHC class-I/II/peptide tetramer reaktivitet; cytokin produksjon av ELISPOT og intracellulær cytokin flekker; og drepe kapasiteten med 51 Cr-release analyser. Disse assays, men er vanligvis utføres ex vivo-og in vitro-stimulering, eller gir begrenset innsikt i T-celle funksjonen. Ideelt sett, ved måling av T-celle-responser ville det være gunstig å vurdere dem in situ, in vivo når de oppstår, uten manipulering av T-celler, slik som for å unngå endringer i funksjonelle parametre som kan oppstå ved in vitro stimulering. Noen av de mest brukte i vivo T celle funksjonelle analyser er basert på måling av CTL mediert dreping av målceller pulserende med MHC klasse I-bindende peptider, som er oppregnet i vivovia deres deteksjon ved fluorescerende merking med vitale fargestoffer som CFSE. Selv om disse typer av assay kan overvåke CTL-mediert dreping av mål når de skjer in vivo, har de tidligere hatt en forholdsvis begrenset kapasitet for å vurdere avliving av flere mål som representerer forskjellige konsentrasjoner og forskjellige typer av peptid-epitoper, som er nødvendig for å tillate kvalitativ parametre som som funksjonell grådighet og epitope variant kryss-reaktivitet skal vurderes. Disse analysene heller ikke gi noen informasjon om CD4 + T-celle mediert respons.
For å overvinne mange av begrensningene med dagens metoder som brukes for å vurdere T celle responser, vi har nylig utviklet en multiplex analyse basert på fluorescerende måloppstill (frihandelsavtaler), som tillater overvåking av T celle responser mot> 250 målceller samtidig i ett dyr av flowcytometri 1, 2. FTAs består av lymfocytter som er merket med sevtater konsentrasjoner og kombinasjoner av vitale fargestoffer som CFSE, CTV og CPD slik> 250 celle klynger av unik fluorescens som skal genereres. Siden disse cellene forblir levedyktig og funksjonell, kan de injiseres i dyr for å tillate overvåkning av deres interaksjon med effektor-T-celler in vivo 3.. For eksempel kan de fta celleklynger bli pulset med MHC klasse-I-bindende peptider for å tillate vurdering av antigen-spesifikke CTL-mediert dreping av målceller en. I tillegg kan de fta celleklynger også bli pulset med MHC klasse II-bindende peptider, slik at evaluering av antigen-spesifikke T-hjelpercelle (T H) aktivitet ved å vurdere aktivering (ved vurdering av aktiveringsmarkører slik som CD69, CD44 og / eller CD62L) av B-celler innenfor FTA peiling beslektet peptid to. Siden mer enn 250 mål kan detekteres samtidig, er det mulig å måle CTL og T H respons mot mange target celleklynger pulsert med numerous peptider på ulike konsentrasjoner og inkludering av mange gjentak. FTA analysen gir derfor et enestående nivå av T-celle effektor respons vurdering in vivo.
Her beskriver vi i detalj konstruksjonen av et FTA og viser hvordan de kan brukes til å vurdere T-celle responser in vivo. Fremgangsmåten beskriver konstruksjonen av et FTA som består av 252 discernable celleklynger ved bruk av tre vitale fargestoffer, som består av seks ganger i 42 celleklynger pulsert med MHC klasse I-og II-bindende peptider. Merkingen av 42 celleklynger forekommer i 10 ml konisk rør og bunn er det nyttig å legge disse ut i et rør Stativ som angitt i tabell 1. Denne metoden kan bli justert for mindre antall av skillbare klaser som er nødvendig ved å redusere mengden av merking av hver farge utført en.
Vi trekker verktøyet til analysen ved å vise hvordan den kan måle responses generert av rekombinant pox-virus vaksinasjon mot flere epitoper i en liten kohort av mus. Dette viser hvordan FTA Målingen kan brukes til å måle kumulativ respons og funksjonelle aviditet gjennom henholdsvis bruk av arealet under kurven (AUC) vurderinger og måling av effektive peptid-konsentrasjon som kreves for å generere ett halv maksimal respons (EC 50).
Protocol
Representative Results
Discussion
Fordelen med FTA-baserte analyser er at de tillater diskriminering av> 250 levedyktig og funksjonell target cellepopulasjoner fra en enkelt vertsdyr ved strømningscytometri. Dette gir et nivå av kompleksitet til in vivo flowcytometri baserte analyser som ikke har vært mulig før. Dette er fremhevet i de to dyreforsøk vist ovenfor, hvor responser til 7 forskjellige virale epitoper i 6 konsentrasjoner kan bli overvåket i replikater på 6 samtidig i ett enkelt dyr slik parametre som for eksempel AUC og EC …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av prosjekttilskudd # 1010395 (BQ og CP) og # 525431 (CR), og et program Grant # 455395 (CP) fra National Health and Medical Research Council of Australia, en Australian Centre for hepatitt og HIV Virology EOI 2012 stipend (CR og RJJ) og et stipend fra Gordon og Grete Bootes Foundation (BQ og CR). Vi ønsker å takke Harpreet Vohra og Michael Devoy for deres utmerkede vedlikehold av JCSMR FACS laboratorium, den australske Cancer Research Foundation Biomolekylære Resource Facility, JCSMR, ANU, for peptidsynteser, og Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australia for å gi foreldre HIV vaksineaksjer.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
