Summary
Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten im Detail in vivo Überwachung ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FHA) in einem in vivo-T-Zell-Assay,> 250 Parameter beurteilt gleichzeitig mittels Durchflusszytometrie.
Abstract
Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten in vivo zu überwachen, ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort und die Gestaltung der Immuntherapie. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FTA)-Technologie, die Vitalfarbstoffe wie Carboxyfluoreszein Succinimidylester (CFSE), violetten Laser erregbar Farbstoffe (CellTrace Violett: CTV) nutzt und rote Laser erregbar Farbstoffe (Dye Cell Proliferation eFluor 670: CPD ) Etiketten Maus Lymphozyten in> 250 erkennbar fluoreszierenden Zellhaufen kombinato. Zellhaufen innerhalb dieser Freihandelsabkommen mit Haupthistokompatibilitäts (MHC)-Klasse-I und MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden und dienen als Zielzellen für CD8 + und CD4 + T-Zellen, die jeweils damit. Diese FTA Zellen lebensfähig bleiben und voll funktionsfähig und kann daher in Mäuse verabreicht werden, um Beurteilung der CD8 + T-Zell-vermittelte Abtötung von Zielzellen und FTA CD4 + T-Zell-meditierten hel ermöglichenp von freien Zielzellen B-Zellen in Echtzeit in vivo durch Durchflusszytometrie. Da> 250 Zielzellen auf einmal geprüft werden, ermöglicht die Technik der Überwachung der T-Zell-Antworten gegen verschiedene Antigen-Epitope in verschiedenen Konzentrationen und in mehreren Wiederholungen. Als solche kann die Technik T-Zell-Antworten sowohl auf quantitative (zB der kumulativen Größe der Antwort) und eine qualitative (z. B.. Funktionelle Avidität und Epitop-Kreuzreaktivität der Antwort-) Pegel zu messen. Hier beschreiben wir, wie diese Freihandelsabkommen sind konstruiert und geben ein Beispiel, wie sie angewendet werden, um T-Zell-Antworten durch einen rekombinanten Pockenvirus-Impfstoff induziert beurteilen.
Introduction
T-Zellen spielen eine zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort und werden oft für die Manipulation in der Immuntherapie richtet. CD4 + Effektor-T-Zellen reagieren auf fremde Antigen durch Sekretion von Zytokinen, die viele Aspekte der Immunität regulieren und kann auch direkt helfen, B-Zellen, Antikörper zu produzieren. CD8 + zytotoxischer T-Zellen (CTLs) können auch Fremdantigen reagieren durch Sekretion von Zytokinen und spielt eine zentrale Rolle bei der Abtötung von Zellen direkt ein fremdes Antigen exprimiert. Die grundlegende Interaktion, die diese T-Zell-Effektorfunktionen initiiert beinhaltet die Interaktion des T-Zell-Rezeptor (TCR) mit fremden Peptiden auf MHC-Molekülen auf der Oberfläche von Zellen angezeigt. CD4 + T-Zellen erkennen Peptide an MHC-Klasse-II-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen und CD8 + T-Zellen erkennen das Peptiden auf MHC-Klasse-I-Moleküle, die typischerweise auf Mikrobe infizierten Zellen angezeigt werden, angezeigt.
Umdie Rolle T-Zellen in einer Immunantwort spielen zu beurteilen, ist es wichtig, dass ihre Effektor-Funktionen werden durch zuverlässige und empfindliche Methoden gemessen. Gemeinsame Methoden für die T-Zellantwort Bewertung einzubeziehen; MHC-Tetramer class-I/II/peptide Reaktivität; Zytokin-Produktion durch ELISPOT und intrazellulären Zytokin-Färbung; und Tötungskapazität von 51 Cr-Release-Assays. Diese Tests sind jedoch in der Regel ex vivo durchgeführt in vitro Stimulation oder einen begrenzten Einblick in die T-Zellfunktion. Idealerweise bei der Messung von T-Zellantworten wäre es vorteilhaft, diese in situ zu beurteilen, in vivo, wie sie auftreten, ohne Manipulation von T-Zellen, so dass Änderungen der funktionellen Parameter, die durch in vitro-Stimulation auftreten können, zu vermeiden. Einige der am häufigsten in vivo T-Zell-Funktionsassays verwendet werden zur Messung CTL-vermittelte Abtötung von Zielzellen, die mit MHC-Klasse I-bindenden Peptiden gepulst, die in vivo aufgezählt werden basierendüber deren Nachweis durch Fluoreszenzmarkierung mit Vitalfarbstoffe wie CFSE. Während diese Arten von Tests können CTL-vermittelte Abtötung von Zielen zu überwachen, wenn sie in vivo vorkommen, sie vorher eine relativ begrenzte Kapazität zur Tötung von mehreren Zielen präsentiert verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen Typen von Peptid-Epitopen, die erforderlich ist, qualitative Parameter, damit beurteilt hatten als funktionelle Avidität und Epitop Variante Kreuzreaktivität bewertet werden. Diese Tests auch nicht bieten keine Informationen über CD4 + T-Zell-vermittelte Reaktionen.
Zu überwinden viele der Beschränkungen verwendet werden, um T-Zellreaktionen zu bewerten gegenwärtigen Verfahren, haben wir vor kurzem ein Multiplex-Assay auf Basis von fluoreszierenden Zielarrays (FHA), die die Kontrolle der T-Zell-Antworten gegen> 250 Zielzellen gleichzeitig in einem tierischen ermöglicht entwickelten Durchflusszytometrie 1, 2. Freihandelsabkommen sind von Lymphozyten mit meh beschriftet umfasstBundes Konzentrationen und Kombinationen von Vitalfarbstoffe wie CFSE, CTV und CPD erlaubt> 250 Zellhaufen von einzigartigen Fluoreszenz erzeugt werden. Da diese Zellen lebensfähig und funktionsfähig bleiben, können sie in Tiere injiziert werden, um die Überwachung ihrer Wechselwirkung mit Effektor-T-Zellen in vivo 3 zu ermöglichen. Zum Beispiel kann die FTA Zellcluster mit MHC-Klasse-I-bindende Peptide gepulst werden, um Beurteilung der Antigen-spezifischen CTL-vermittelte Abtötung von Zielzellen 1 zu ermöglichen. Darüber hinaus können die FTA Zellcluster auch mit MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden, das eine Bewertung von Antigen-spezifischen T-Helferzellen (T H)-Aktivität durch Bestimmung der Aktivierung (durch Bewertung des Aktivierungsmarker, wie CD69, CD44 und / oder CD62L) von B-Zellen in der FTA Lager verwandten Peptid 2. Seit mehr als 250 Ziele können gleichzeitig erfasst werden, ist es möglich, CTL und T H-Antworten gegen viele Zielzellcluster mit n gepulst messenahlreiche Peptide bei verschiedenen Konzentrationen und die Aufnahme der vielen Wiederholungen. Die FTA-Test ist daher ein beispielloses Niveau von T-Zell-Antwort-Effektor Beurteilung in vivo.
Hier beschreiben wir im Detail die Konstruktion einer FTA und zeigen, wie sie zur Bestimmung der T-Zellantworten in vivo angewendet werden. Das Verfahren beschreibt die Konstruktion eines FTA 252 erkennbaren Zellcluster durch die Verwendung von drei Vitalfarbstoffen, 6 Wiederholungen der 42 Zellcluster mit MHC-Klasse-I und-II-bindenden Peptiden gepulst aufweist, aufweisend. Die Markierung von Zellclustern 42 erfolgt in 10 ml-Röhrchen mit konischem Boden und es ist hilfreich, um diese in einem Reagenzglasgestell lag wie in Tabelle 1 dargestellt. Dieses Verfahren kann für eine kleinere Anzahl von erkennbaren Cluster eingestellt, wie durch die Verringerung der Menge der Markierung erforderlich jeder Farbstoff 1 durchgeführt.
Wir zeigen den Nutzen des Tests zeigen, wie es Respons messenes durch rekombinante Pocken-Virus-Impfung gegen mehrere Epitope in einer kleinen Kohorte von Mäusen erzeugt. Dies zeigt, wie das Freihandelsabkommen Test kann verwendet werden, um kumulative Antworten und funktionelle Avidität durch zu messen, bzw. die Verwendung von Fläche unter der Kurve (AUC) Untersuchungen bzw. die Messung der effektiven erforderlich, um die Hälfte der maximalen Antworten (EG 50) erzeugen Peptidkonzentration werden.
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Protocol
Hinweis: Die Mäuse aus diesem Protokoll wurden gemäß den Richtlinien der Australian National University Tierversuche Ethikkommission und Mäuse behandelt wurden durch Genickbruch getötet.
1. Dye-und Peptid Vorbereitung
- Dye Vorbereitung
Hinweis: Die Farbstoffe werden in unterschiedlichen Konzentrationen vorverdünnt die Kennzeichnung von Zellen an diskreten Fluoreszenzintensitäten ermöglichen. CFSE ist sieben Konzentrationen über 3,5-fach serielle Verdünnungen verwendet und CTV und CPD sind an sechs verschiedenen Konzentrationen über 3,7-fache serielle Verdünnungen verwendet (siehe Tabellen 2-4). Die Aktien Konzentrationen in den Tabellen 2-4 aufgeführten Farbstoffe verwendet werden, um Zielzellen bei den in den Tabellen 2-4 aufgeführt endgültige Farbstoffkonzentrationen zu markieren. Farbstoffe reagieren bei Einwirkung von wässriger Lösung. Es ist daher wichtig, daß Fläschchen auf RT vor dem Öffnen, um die Exposition von Farbstoffen, um eine Kondensation zu minimieren äquilibriert werden.- CFSE
Hinweis: CFSE als Carboxyfluoresceindiacetat succinimidylester (CFDA, SE; MW 557,47) gekauft, in der Regel bei 25 mg / Fläschchen.- Resuspendieren 25 mg in 4,48 ml CFSE DMSO, um eine 10 mM Stammlösung zu erhalten.
- Serienmäßig verdünnen CFSE: Fügen Sie 35 ul 10 mM CFSE Lager in 87,5 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 3 zu geben.
- CTV
Hinweis: CTV wird typischerweise in Packungen 9 Ampullen, die jeweils mit 10 &mgr; l DMSO aufgelöst werden, um eine 10 mM Lösung des Farbstoffs zu erzeugen gekauft.- Rekonstituieren und Pool Alle 9 Fläschchen CTV mit 90 ul DMSO, um eine 10 mM Lösung.
- Serienmäßig verdünnen CTV: Fügen Sie 11 ul 10 mM CTV Lager in 29,7 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 2 zu geben.
- CPD
Hinweis: CPD (MW 792,6) ist typischly gekauft als 0,5 mg / Fläschchen.- Resuspendieren 0,5 mg CPD in 63 ml DMSO, um eine 10 mM Lösung zu erhalten.
- Serienmäßig verdünnen CPD: Fügen Sie 11 ul 10 mM CPD Lager in 29,7 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 4 geben.
Hinweis: Dye Aktien können bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden und kann mehrmals aufgetaut und wieder eingefroren werden, ohne signifikanten Verlust in der Funktion.
- CFSE
- Peptid-Vorbereitung
Hinweis: MHC-Klasse-I-bindende Peptide sind in der Regel verwendet, um Zielzellen bei 6 verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung von Impuls 10fache Verdünnungen von einer Startkonzentration von 1 &mgr; M (Tabelle 5). MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden werden im Allgemeinen verwendet, um Zielzellen bei 6 verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung von Impuls 3 fachen Verdünnungen von einer Ausgangskonzentration von 400 &mgr; M (Tabelle 5). Jedes Peptid wird mit 2x Endkonzentration in PBS wie that jedes Peptidkonzentration hat eine Mindestmenge von 250 ul. Peptid-Aktien können vor der FTA Konstruktion hergestellt und bei -20 ° C ohne wesentliche Funktionsverlust gelagert werden.- Vorbereiten Lager MHC-Klasse-I-bindenden Peptiden
- Bereiten Sie die höchste Konzentration von jedem Peptid-Epitop zu 2 uM Stammlösungen (2x 1 uM)
- Serienmäßig verdünnen MHC-Klasse-I-bindende Peptide: add 44,4 ul 2 uM Peptid-Stammlösung in 400 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit verdünnter Stammlösung, um jede Peptidkonzentration in der Tabelle 5 zu geben.
- Vorbereiten Lager MHC-Klasse-II-bindenden Peptide
- Bereiten Sie die höchste Konzentration von jedem Peptid-Epitop bis 800 um Stammlösungen (2x 400 uM).
- Serienmäßig verdünnen MHC-Klasse-II-bindenden Peptide: add 150 ul 800 uM Peptid-Lösung in 300 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit verdünnter Stammlösung, um jede Peptidkonzentration in Tabelle 5 geben
2. FTA Vorbereitung
Hinweis: Das folgende Verfahren beschreibt die Konstruktion eines FTA von Zellen mit 7 verschiedenen Peptid-Epitopen gepulst bei 6 unterschiedlichen Konzentrationen (dh 42 Zellcluster.) 6 mal wiederholt, um 252 erkennbaren Zellcluster zu erzeugen besteht. In jeder Wiederholung ein Zellcluster mit keinem Epitop (null) gepulst wird, wird als Kontrolle eingeschlossen. Es ist hilfreich für Freihandelsabkommen, eine CD45 Allotyp Unterschied Wirtstiere müssen ihre Diskriminierung von Empfängerzellen durch Antikörpermarkierung zum Zeitpunkt der Analyse zu ermöglichen. Ansonsten Freihandelsabkommen mit anderen Farbstoffen wie PKH-26 für diesen Zweck (in Schritt 2.6 beschrieben) gekennzeichnet werden. Typischerweise wird die FTA Vorbereitung Verfahren von Anfang durchgeführt, um während einer Sitzung zu beenden.
- Etikett 42, 10 ml Kunststoffröhrchen mit konischem Boden 1-42 (wie in Tabelle 1 zum Beispiel).
- Vorbereitung der Zellen
- Isolieren Milz und / oder lymphnodes von Mäusen. Bereiten Einzelzellsuspension von Gewebe durch Maischen durch eine 70 um brütete Sieb mit einer 5 ml Spritzenkolben und zählen Zellen mit einer Zählkammer.
- Resuspendieren Lymphozyten bei bis zu 200 x 10 6 Zellen / ml in 11,5 ml Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI, oder Äquivalent), das 5% fötales Kälberserum (FCS). Hinweis: Es ist wichtig, einen Puffer mit hohem Amingehalt zu verwenden, um die Toxizität für Zellen Farbstoff 3 zu minimieren.
- CTV Kennzeichnung
Hinweis: Die Zellen werden zunächst mit sechs Konzentrationen von CTV markiert.- Die Zellen gründlich resuspendieren durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Fügen Sie 1,9 ml der Zellsuspension in 6 der 10-ml-Röhrchen beschriftet 37-42, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhren zu benetzen.
- Um Zellen mit CTV beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal.
- In 83 ul PBS zu dem nicht benetzten Teil am oberen Ende des Rohres, und dieses Add 17 ul Lager CTV (siehe Tab.le 2, für die Stammlösung wird auf die Tube) zugeordnet. Hinweis: Ein nicht benetzt Rohr ist wichtig, um die Zellsuspension Bewegung und vorzeitiges Mischen der Zelllösung mit der Farbstofflösung zu verhindern.
- Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2-2.3.4 für die Stammlösungen von CTV in den in Tabelle 2 beschrieben bezeichnet Röhren.
- Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C).
- CFSE Kennzeichnung
- Nach CTV Kennzeichnung, 5 ml RPMI mit 5% FCS in jedes Röhrchen und gründlich resuspendieren durch Vortexen.
- Von Rohr 37 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 31, 25, 19, 13, 7 und 1.
- Von Rohr 38 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 32, 26, 20, 14, 8 und 2.
- Von Rohr 39 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 33, 27, 21, 15, 9 und 3.
- Von Rohr 40 1 ml der ZellSuspension Rohre 34, 28, 22, 16, 10 und 4.
- Von Rohr 41 je 1 ml der Zellsuspension in Rohren 35, 29, 23, 17, 11 und 5.
- Von Rohr 42 je 1 ml der Zellsuspension auf Rohre 36, 30, 24, 18, 12 und 6
Hinweis: Achten Sie darauf, die obere Hälfte der Rohre während der Schritte 2.4.1.1-2.4.1.6 benetzen.
- Um Zellen mit CFSE beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal.
- In 103 ml PBS auf die nicht benetzt Abschnitt an der Oberseite der Röhre, und diese 7 ml Stamm CFSE hinzufügen (siehe Tabelle 3, für die Stammlösung wird auf die Röhre zugeordnet).
- Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen.
- Haben Schritte 2.4.2-2.4.4 für die Stammlösungen von CFSE in den in Tabelle 3 beschrieben bezeichnet Röhren.
- Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C).
- Waschen der Zellen: Zellsuspension verdünnt mit 9 ml 20 ° CRPMI mit 5% FCS, Sediment durch Zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C und entfernt Überstände durch Absaugen mit einer Transferpipette.
- Nach CTV Kennzeichnung, 5 ml RPMI mit 5% FCS in jedes Röhrchen und gründlich resuspendieren durch Vortexen.
- Peptid-Pulsen und Zellwasch
Hinweis: Nach der Zellen mit CTV und CFSE markiert worden sind, werden sie mit MHC-Klasse-I-und / oder MHC-Klasse-II-bindenden Peptide (in 1.2 hergestellten) gepulst. Eine der Zellpopulationen sind ebenfalls nicht mit Peptid (zB. Nil in Tabelle 1) gepulst werden und als negative Kontrolle für die Berechnung der T-Zell-Reaktionen verwendet.- Peptid-Pulsen
- Die Zellen in einem Gesamtvolumen von 250 ul RPMI mit 5% FCS. Anmerkung: In der Regel 50 ul Zellsuspension verbleibt nach dem Absaugen des Überstands am Ende von Schritt 2.4.7 daher mit 200 ul Medium, um Pellets Zelle.
- Add 250 ul Peptid pre bereit Bestände (wie in Tabelle 5), die Rohre (wie in Tabelle 1) entsprechend bezeichnet und sein surallein e, ein Steuerrohr des PBS aufgenommen sind ohne Peptid als Nil Kontrolle.
- Mischen Zellsuspensionen mit einem Wirbel. Hinweis: Es ist wichtig, dass jedes Peptid-Epitop und jede Peptidkonzentration an einem einzelnen Rohr zugeordnet und diese eindeutig auf der Grundlage der erwarteten Fluoreszenz der Zellen in diesem Rohr erfaßt wird, weil die Fluoreszenz-Signatur des Clusters wird dieses Peptid zu definieren (wie in Tabelle 1 zum Beispiel).
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Zellwasch
- 5 ml eiskaltem (4 º C) RPMI mit 5% FCS zu der Zellsuspension und resuspendieren Zellen durch Umdrehen des Röhrchens. Sorgfältig Unterlage der Zellsuspension mit 3 ml eiskaltem (4 ° C) FCS.
- Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C Verwenden langsame Beschleunigung und Bremsen, um die Schnittstelle des FCS zu gewährleisten und die Zellsuspension Lösung aufrechterhalten wird.
- Vorsichtig absaugen und dann das RPMIdie FCS mit einer Transferpipette, so dass die gewaschenen Zellpellets ungestört. Anmerkung: Die Verwendung einer Unterlage FCS zu Zellen zu waschen hilft sicherzustellen soviel Peptidlösung aus den Zellen wie möglich entfernt und dadurch Belichtung der Zellpopulation, um mehrere freie Peptide Begrenzung, wenn die Zellen gepoolt.
- Waschen der Zellen wieder: Resuspendieren der Zellpellets in 10 ml 4 º C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C Gießen Sie die Überstände.
- Pool alle Zellpopulationen in einem einzigen Rohr mit einer Pipette unter Verwendung von 6 ml 4 ° C RPMI mit 5% FCS. Sediment gesammelt Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette.
- Peptid-Pulsen
- CPD Zellmarkierung
Anmerkung: An diesem Punkt sechs Intra-Assay Wiederholungen können durch Markierung Peptid gepulste Zellen mit 6 verschiedenen Konzentrationen der CPD erzeugt werden.- In 11,4 ml 20 ° CRPMI mit 5% FCS zu der gepoolten Zellpellet resuspendieren sorgfältig mit einer Pipette.
- Fügen Sie 1,9 ml der Zellsuspension in 6, 10-ml-Röhrchen beschriftet AF, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhren zu benetzen.
- Um Zellen mit CPD beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal.
- In 92 ul PBS zu dem nicht benetzten Teil am oberen Ende des Rohres, und dieses Add Lager CPD (siehe Tabelle 4 für die Menge der Stammlösung in jedes Röhrchen zugeordnet).
- Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen.
- . 2.6.3-2.6.5 Sie Schritte für die Stammlösungen der CPD in den in Tabelle 4 beschrieben bezeichnet Rohre Hinweis: Im Gegensatz CFSE und CTV, ist die CPD Kennzeichnung Konzentration nicht exakt linear zu der resultierenden Fluoreszenzintensität der markierten Zellen verwandt und so die Kennzeichnung Konzentration verwendet werden, um gleich weit Fluoreszenzspitzen von mehreren markierten Populationen zu erhalten, wurdeempirisch ermittelt (siehe Tabelle 4).
- Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C).
- Waschen der Zellen zweimal: Die Zellen auf 10 ml mit 20 ° C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette. Wiederholen.
- Pool alle Zellen in einer einzigen Röhre mit 8 ml 4 ° C RPMI mit 5% FCS mit einer Pipette. Sediment gesammelt Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und absaugen des Überstandes mit einer Transferpipette.
- (Optional) PKH-26 Zellmarkierung
Hinweis: Wenn Freihandelsabkommen kann nicht mit Zellen eine CD45 exprimieren allotypische Unterschied um Mäuse Gastgeber konstruiert werden, können sie mit PKH-26 markiert werden, um ihre Diskriminierung von Empfängerzellen zu ermöglichen.- Hinzufügen von 2,9 ml 20 ° C PBS gepoolten Zellpellet zu resuspendieren und sorgfältig mit einer Pipette.
- In Zellsuspension auf eine nichtn benetzt 10-ml-Tube, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhre zu benetzen.
- Entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal.
- In 58 ul Verdünnungsmittel C (im PKH-26-Farbstoff-Kit) auf die nicht benetzt Abschnitt an der Oberseite der Röhre, und diese 42 ul 1 mM Stamm PKH-26 hinzufügen.
- Das Röhrchen und mischen Zelllösung mit dem Farbstoff gründlich durch Rühren.
- Zellen, Inkubation für mindestens 10 min bei RT (20 ° C).
- Waschen der Zellen zweimal: Die Zellen auf 10 ml mit 20 ° C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette. Wiederholen.
- Injizieren Freihandelsabkommen in Wirtstiere
Hinweis: Um die T-Zellreaktionen in vivo zu messen, werden FHA in Tieren, die eine aktive Immunantwort haben und in situ belassen bis zu 24 Std. Es ist entscheidend, dass die FHA werden ebenfalls in einem naiven Tier als negative Kontrolle injiziert.- Die Zellen zählen und bei 2,5 x 10 8 Zellen pro ml in PBS. Injizieren Sie 200 ul von Zellen intravenös in Mäuse-Host, einschließlich einer naiven Tier als Kontrolle.
3. Durchflusszytometrie
- 18-24 Stunden nach der Injektion FTA Ernte Blut oder Milz (oder anderen Geweben von Interesse) von Host-Mäusen.
- Bereiten Einzelzellsuspension von Gewebe durch Maischen durch eine 70 um brütete Sieb mit einer 5 ml Spritzenkolben.
- Die Zellen mit bis zu 65 x 10 6 Zellen / ml in PBS, enthaltend 0,1% BSA.
- Verteilen von 100 &mgr; l Aliquots der Zellsuspension in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Antikörpermarkierung.
- Label-Zellen mit Fluorochrom markierten Antikörper und fluoreszierende Sonden Lebensfähigkeit mit spektral kompatibel Fluoreszenz CFSE, CTV und CPD. Hinweis: Antikörper gegen Zellmarker wie B220 und Aktivierungsmarkern wie CD69 B sind für die B-Zell-Aktivierung zu messen, wenn mit Hilfe der FTA bis H T-Zellreaktionen zu messen 2. Fügen Sie einen Antikörper gegen CD45.1 und / oder wenn die Freihandelsabkommen CD45.2-und Host-Mäuse haben eine CD45 allotypische Unterschied.
- 100 l 2x Stammlösung von Antikörper / Lebensfähigkeit Farbstoffe (in PBS mit 0,1% BSA) bis 100 ul Aliquots von Zellen, gut mischen und Inkubation auf Eis (4 ° C) für 30 min.
- Waschen der Zellen: Sediment Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C Überstand zu entfernen. Die Zellen in 200 &mgr; l PBS, enthaltend 0,1% BSA, Sediment Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C Überstand zu entfernen.
- Die Zellen in einem Gesamtvolumen von 400 &mgr; l PBS, enthaltend 0,1% BSA, Filterzellen durch einen 70 &mgr; m-Mesh und durch Durchflusszytometrie analysiert Strömungs im Durchflußzytometer der Lage, die entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen und Konjugate. Sammeln Sie bis zu 3 x 10 6 Lymphozyten-Ereignisse, um jede Zelle FTA-Cluster zu lösen und zu gewinnen genug Zellen für die statistischecal-Analyse. Hinweis: Stellen Sie sicher, alle typischen Steuerelemente (z. B. Einzelbunt Kontrollen) für die Durchflusszytometrie eingesetzt werden. Typischerweise erfordert CFSE Anregung aus einer blauen Laserquelle (in der Regel bei 488 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 520 nm zentriert; CTV erfordert Anregung aus einem violetten Laserquelle (in der Regel bei 405 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 450 nm zentriert; und CPD erfordert Anregung von einem roten Laserquelle (in der Regel bei 633 nm oder 640 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 670 nm zentriert.
4. Datenanalyse
- Analysieren Durchflusszytometrie Daten mit Standard-Durchflusszytometrie-Software (siehe repräsentatives Ergebnis für ein Beispiel von der Art der Gating-Strategie beschäftigt).
- Für% spezifisch Tötung ermitteln Sie die Anzahl der Zellen in jeder Zelle FTA-Cluster mit MHC-Klasse-I-bindenden Peptide und der FTA-Cluster, die nicht gepulst wurden Peptid ("Null"), gepulst und mit folgender Formel zu berechnenSpezifische% Töten.
Spezifische% Töten
Anmerkung: In der obigen Formel "grundiert" bezieht sich auf Ziele von Tieren, die gedacht sind, um eine Immunantwort gegen die Zielpeptide "naiven" bezieht sich auf Ziele von naiven Tieren, "Peptid" bezieht sich auf Ziele mit Peptiden und "nil" gepulst bezieht sich auf Ziele nicht mit Peptiden gepulst. - Für B-Zell-Aktivierung als Maß der T-H-Aktivität, die Berechnung der geometrischen mittleren Fluoreszenzintensität (GMFI) des CD69-Antikörper Fluoreszenz auf FTA B-Zellen mit MHC-Klasse-II-Bindungspeptide in "grundiert" Tiere und von diesem subtrahieren GMFI gepulst CD69 Expression auf den entsprechenden FTA-B-Zellen in "naiv" Tiere um ein Maß der T-H-Aktivität zu geben.
- Von den in den Schritten 4.2 und 4.3, die Verwendung erzeugt Statistikenmathematischen Tabellenkalkulationssoftware wie GraphPad Prism zu anderen quantitativen und qualitativen Parameter wie Fläche unter der Kurve und EC 50 (eine in der Tiefe Beschreibung, wie diese Berechnungen durchgeführt für AUC berechnen sind zu finden unter
http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, und EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).
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Representative Results
Als ein Beispiel der Verwendung des FHA-Assay wurde eine BALB / c-Maus, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus (VV), das HIV-I-Epitope (VV-HIV) und Antworten auf die HIV-I-CTL-Epitope immunisiert, Gag, Gag mut, Env und Pol, der VV CTL-Epitope F2L und F2L mut, und die HIV-I T H-Zell-Epitop, Gag Th (wie unter 2 beschrieben) wurden mit einem 252-Parameter FTA-Assay (Abbildung 1B) bewertet. Epitop-Varianten Gag (Gag mut) und F2L (F2L mut) sind nicht im VV-HIV-Vektor exprimiert und daher Reaktionen gegen diese Epitope sind reflektierende Epitop Variante Quer reaktiven T-Zell-Reaktionen. Naive Mäuse wurden auch mit dem FTA als negative Kontrolle injiziert. Das Freihandelsabkommen wurde von der Host-Zellen der Maus durch PKH-26 Kennzeichnung und FTA-B-Zellen durch Antikörperfärbung B220 über Durchflusszytometrie (1A und 1B) diskriminiert diskriminiert. Jeder der 6 intra Tier repliziert wurde basierend auf CPD Fluoreszenz (Fig. 1C gated (Abbildung 1D). % Spezifische Tötung von jeder Wiederholung wurde durch Vergleich FTA Cluster Zelltod in grundiert Tiere im Vergleich zu entsprechenden FTA-Cluster in naiven Tieren (1D) bewertet. T-H-Aktivität wurde durch Vergleich FTA B-Zell-Hochregulation von CD69 in grundiert Tiere im Vergleich zu entsprechenden FTA B-Zell-Cluster in naiven Tieren (1E) bewertet.
Aus dieser Analyse erzeugt VV-Infektion HIV starke CTL-Antworten gegen die immundominante Epitop VV F2L, mit 100% der FTA Zielzellen mit 0,001 mm oder mehr von dem Epitop aus der Milz (2A) entfernt wird gepulst. Es gab auch eine starke Reaktion gegen die variante Form F2L, F2L mut, wobei 100% der FTA Zielzellen mit 0,01 mm oder mehr von dem Epitop aus der Milz entfernt gepulst erzeugt wird. SeitF2L mut nicht in der infizierenden Virus vorhanden ist, diese Reaktion zeigt eine Variante Epitop kreuzreaktive Antwort. Es gab auch eine relativ moderate Reaktion gegen Ziele der HIV-Gag-Epitop exprimieren, erzeugt und eine leichte kreuzreaktive Antwort gegen die Variante Form dieses Epitop, HIV-Gag-mut. Es schien vernachlässigbar Antworten auf die HIV-pol-und HIV-Env-CTL-Epitope erzeugt werden.
Zusätzlich zu CTL-Antworten, die gezeigt FTA Beispiel Assay auch T H Reaktionen durch Beurteilung Aktivierung von B-Zellen-FTA das HIV-MHC-Klasse-II-bindende Epitop von HIV-Gag-Th (2B) exprimieren, gemessen. Dies zeigte, Antigen-spezifische B-Zell-Aktivierung erfolgte in grundiert Tiere hindeutet Generation von HIV-Gag-Th-spezifischen T-Zell-H-Effektoren.
Diese Maßnahmen der T-Zellantwort kann durch Erzeugen Größenordnung Fläche unter der Kurve Werte (AUC) für jedes der Epitope (2C), die MEA zusammenfassenleistet die kumulative Größe der Antwort.
Zusätzlich zur Grße der Antigen-spezifischen Epitop Variante und kreuzreaktive Reaktionen ermöglicht die FTA-Assay funktionellen Avidität Messungen erfolgen können. Beispielsweise die wirksame Peptidkonzentrationen verwendet werden, um FTA Zielzellen erforderlich ist, um die Hälfte der maximalen Reaktion (EC 50) geben Impuls wird für die CTL-Effektoren (Fig. 2D) gezeigt ist. Dies zeigte die funktionelle Avidität an die Epitope F2L mut, HIV-und HIV-Gag Gag mut, waren etwa 10, 100 und 4000-fach niedriger waren als Antworten auf die dominante Epitop VV F2L erzeugt.
Tabelle 1. Layout einer 252 Parameter FTA. Typische Layout ein Replikat eines 252 FTA von 42 Proben / Röhrchen mit 7 verschiedenen Peptid-Epitope gepulst bei 6 differen umfasstet-Konzentrationen und mit einem gepulsten un (Nil) Probe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Rohr Anzahl | Volumen (ul) | Dye Lager (mM CTV) | Endgültige Konzentration (uM) |
| 37 | 0 | 0 | 0 |
| 38 | 17 | 0,053 | 0.451 |
| 39 | 17 | 0,197 | 1,48 |
| 40 | 17 | 0,73 | 6,21 |
| 41 | 17 | 2.7 | 23 |
| 42 | 17 | 10 | 85 |
Tabelle 2. CTV Aktien verwendet, um Zellen zu markieren. Volumen der börsennotiertenCTV Lager verwendet werden, um Zellen zu markieren in 2 ml, um die endgültige Kennzeichnung Farbstoffkonzentration zu geben.
| Rohr Anzahl | Volumen (ul) | Dye Lager (mM CFSE) | Endgültige Konzentration (uM) |
| 37-42 | 0 | 0 | 0 |
| 31-36 | 7 | 0,022 | 0.139 |
| 25-30 | 7 | 0,078 | 0,492 |
| 19-24 | 7 | 0,23 | 1,45 |
| 13-18 | 7 | 0,82 | 5,17 |
| 7-12 | 7 | 2.9 | 18,3 |
| 1-6 | 7 | 10 | 63,1 |
Tabelle 3. CFSE Aktien verwendet, um Zellen zu markieren. Volumen der börsennotierten Aktien CFSE unsed, um Zellen zu markieren in 1,11 ml, um die endgültige Kennzeichnung Farbstoffkonzentration zu geben.
| Rohr Anzahl | Volumen (ul) | Dye Lager (mM CPD) | Endgültige Konzentration (uM) |
| A | 0 | 0 | 0 |
| B | 4 | 0,053 | 0.106 |
| C | 6.3 | 0,197 | 0,62 |
| D | 7.5 | 0,73 | 2,74 |
| E | 7.3 | 2.7 | 9,86 |
| F | 7.7 | 10 | 38,5 |
Tabelle 4. CPD Aktien verwendet, um Zellen zu markieren. Volumen der börsennotierten Aktien CPD Etiketten Zellen in 2 ml verwendet werden, um das Finale zu geben Labeling Farbstoffkonzentration.
| Peptid-Konzentration (uM) | |||||||
| MHC-Klasse-I-bindenden Peptiden | 0 | 0.00002 | 0,0002 | 0,002 | 0,012 | 0,2 | 2 |
| MHC-Klasse-II-bindenden Peptide | 0 | 3.29 | 9,88 | 29,6 | 88,9 | 266 | 800 |
Tabelle 5. MHC-Klasse-I-und II-bindenden Peptid Lager-Konzentrationen. Typische Lager Konzentrationen 1 von Peptid-Epitope verwendet, um ein Freihandelsabkommen ein zu bauen. Diese Konzentrationen werden 2x die endgültigen Konzentrationen eingesetzt, um Zielzellen pulsieren.
1. Typische Durchflusszytometrie Analyse FHA. Splenozyten von BALB / c-Mäuse wurden verwendet, um einen Parameter FTA 252 zu konstruieren, wie im Text beschrieben. FTA Cluster wurden mit 6 verschiedenen Konzentrationen von 7 virale Epitope, einschließlich der MHC-Klasse-I-bindende Epitope, F2L (SPYAAGYDL ein L d-eingeschränkten Vacciniavirus (VV)-Epitop) gepulst (wie in Tabelle 5 aufgeführt); F2L mut (SP G AAGYDL eine Variante F2L), Gag (AMQMLKETI ein K d-beschränkte HIV-Gag-Epitop 4), Gag-mut (AMQMLK D TI, eine Variante des HIV-Gag-5), Pol (VGPTPVNII ein D d eingeschränkten HIV-pol-Epitop 6), Umwelt (RGPGRAFVTI ein D d-beschränkt HIV-env-Epitop 7); und der MHC-Klasse-II-Bindungspeptid Gag T H (PVGEIYKRWIILGLN, ein H-2 d-beschränkt HIV Gag-Epitop 4). Freihandelsabkommen wurden iv injiziert. in eine BALB / c-Maus, die intranasal (in). 6 Tage früher mit rec infiziert worden waren,ombinant VV, das HIV-Epitope (VV-HIV, grundiert Tier). Das Freihandelsabkommen wurde auch in naive Mäuse als Kontrolle injiziert. Nach 18 h in vivo wurden FTA in Splenocytsuspensionen vom Host Mäuse vorhandenen Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. A) Typische progressive Gating-Strategie, um FTA Zellen, die Tore für die Lymphozyten, Slips und PKH-26 FTA + Zellen zu identifizieren (es ist auch hilfreich, um lösen lebenden Zellen mit einem Farbstoff Lebensfähigkeit wie Hoechst 33258, nicht gezeigt). B) 3D-Plot zeigt alle FTA-Clustern aus naiv-Host Maus. C) Histogramm-Diagramme, die FTA CPD Fluoreszenzmarkierung jedes der sechs innerTier repliziert. D) 2D-Diagramme zeigen einer der sechs innerTier FTA B-Zell-Replikation sind die einzelnen Arten und Konzentrationen von Epitopen aus der naiven und grundierten Tier. Dies zeigt die Abwesenheit von FTA-Zellen in die grundierte Tier relativ zur naiven Tier und enthüllt "Tötung Ereignisse"von CTL, die die Grundlage des Freihandelsabkommens zu töten Assay ein. E) Histogramm-Analyse der B-Zell-FTA Ausdruck der Aktivierungsmarker CD69 in grundiert Tiere relativ zur naiven Tieren, die die Grundlagen des Freihandelsabkommens T-Helfer-2-Test bildet. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. FHA ermöglichen die Messung der Größe und Avidität der T-Zellantworten in vivo. Ein Parameter FTA 252 wurde verwendet, um T-Zell-Antworten in Mäusen, die mit VV-HIV infiziert zu beurteilen, wie in Fig. 1 beschrieben. A)% spezifische Abtötung wurde berechnet für alle CTL-Epitopen und die Ergebnisse von jedem der 6 wiederDuplikate dargestellt (links) sowie Mittel-und Standardfehler der Mittel (rechts) gezeigt. B) T H Reaktion wurde durch Messung der Aktivierung von B-Zell-FTA präsentiert die HIV-Gag-Th-Epitop für jede der sechs innerTier Wiederholungen (bewertet links) und Mittelwerte und Standardfehler der Einrichtung (rechts) berechnet. C)% AUC-Werte für spezifische Abtötung (a) und T-Helfer-Antworten (b) wurde als Maß der kumulativen Größe. D berechnet) EC 50-Messungen wurden berechnet für% Spezifische Tötung Daten (a) als Maß für die funktionelle Avidität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der Vorteil der FTA-basierten Assays ist, dass sie die Unterscheidung von> 250 lebensfähigen und funktionsZielZellPopulationen aus einer Wirtstier durch Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Dies bietet ein Maß an Komplexität in vivo Durchflusszytometrie basierenden Assays, die bisher nicht möglich war vor. Dies wird in den 2 oben gezeigt Tierversuchen, in Reaktion auf 7 verschiedene virale Epitope bei 6 Konzentrationen könnten in Replikaten von 6 gleichzeitig in einem einzigen Tier erlaubt Parameter wie AUC und EC 50 für T-Zellantworten in vivo bestimmt werden, überwacht werden hervorgehoben .
Zusätzlich zur Messung der T-Zell-Antworten in vivo, können die FTA-basierte Assays modifiziert werden, um Antworten in vitro 1 zu messen. Dies beinhaltet im Wesentlichen das Hinzufügen Freihandelsabkommen an T-Zellen in der Kultur, um Antworten über mehrere Stunden in vitro zu messen. Eine potentielle Beschränkung der in vitro-basierten Assays unter Verwendung von FHA ter die Tendenz für die markierten Zellen innerhalb der Freihandelszone, die Kennzeichnung Farbstoff umgebenden Zellen 1, 3 zu übertragen. Dies kann zu einer verringerten Auflösung von FTA Zellhaufen führen, wie ihre Fluoreszenz wird weniger deutlich zwischen den einzelnen Bevölkerungs. Dies ist deutlicher in in vitro-Assays im Vergleich zu in vivo-Assays, da die Zellen in der Nähe der längere Zeit in in vitro-Assays. Dieser Verlust in der Auflösung von freien Zellpopulationen in in vitro-Assays durch Verringerung der Kultivierungszeit von FHA mit Effektor-T-Zellen und unter Verwendung von FHA, die eine weniger Zielzellpopulationen, die eine größere Menge an "Fluoreszenz Raum" zwischen ihnen minimiert werden, dass Farbstoffübertragung hat weniger Wirkung.
Wir haben auch festgestellt, Auflösungsverlust von FTA-Zell-Populationen, wenn Freihandelsabkommen wurden in vivo für 48 Stunden 1 gelegt. Dies schien das Ergebnis der Ziel B-Zellen innerhalb der FTA Prolife seinBewertung und damit Farbstoff Fluoreszenzintensität verringert. Dies ist wahrscheinlich ein Ergebnis von B-Zellen präsentiert verwandten Antigen auf Antigen-spezifische Effektor-CD4 + T-Zellen, B-Zell-Stimulierung resultiert. Es wird daher empfohlen, daß der Test beschränkt auf ~ 24 h oder weniger, wenn B-Zellen Ziele werden überwacht werden.
Die Fähigkeit, mehrere (> 96) einzigartige Zellcluster kennfluoreszenz zuvor mit festen, nicht-lebensfähigen Zellen 8 angegeben. Die Färbung von lebenden Zellen wurde jedoch problematischer mit der Versorgung mit Vitalfarbstoffen gewesen und nur 8-12 lebensfähigen Zellen Cluster zuvor 9 erreicht. Die Fähigkeit,> 250 eindeutig fluoreszierend markierten Zellen lebensfähig und funktions hier berichtet erzeugen, beruht auf den Eigenschaften von CFSE artigen Vitalfarbstoffen. Einige dieser Farbstoffe, wie CTV und CPD, sind erst seit kurzem zur Verfügung stehen. Diese Farbstoffe haben die Eigenschaften der in der Lage istMarkierung von Zellen mit einer hohen Fluoreszenzintensität wird so lange gelebt hat und der geringe Varianz 3. Diese Eigenschaften verbunden mit der Tatsache, dass es eine lineare Beziehung (insbesondere im Fall von CFSE und CTV) zwischen der Konzentration des Farbstoffs für die Markierung und der Fluoreszenzintensität der markierten Zellen verwendet wird, bedeutet, dass Zellen mit mehreren (bis beschriftbar bis 7 hier) Intensitäten jedes Farbstoffs, die leicht mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden können, angezeigt. Da der Fluoreszenzemission des CFSE, CPD und CTV minimale spektrale Überlappung, können sie in Kombination verwendet werden, um Zellen zu markieren, so dass bis zu> 250 fluoreszierenden Zellen Signaturen durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Es sei darauf hingewiesen, dass zur Markierung von Zellen mit dieser Reihe von erkennbaren Fluoreszenz Unterschriften zu erzielen, ist es wichtig, dass die Zellmarkierung wird schnell durchgeführt werden, 10, 11 (zu geringe Fluoreszenz Varianz erzeugen) und in einem geeigneten Puffer enthält,freien Amine 3 (nach Farbstoff Toxizität, die sonst in dieser Farbstoffe auftreten können, bei hohen Konzentrationen puffern). Es ist auch wichtig, dass bei der Aufnahme von Freihandelsabkommen durch Durchflusszytometrie, dass fehlerhafte Schwankungen Event Fluoreszenz (durch Messung CFSE, CTV und / oder CPD Fluoreszenzintensität über die Zeit zum Beispiel) überwacht. Dies ist wichtig, da solche Schwankungen Event Fluoreszenz, die durch Maschinen sind eingeführt Fehler können zu Fehlinterpretationen der richtigen Zielzelle Cluster-Positionierung, die wiederum kann zu Fehlern in den letzten Maßnahmen der Effektor-T-Zell-Funktion führen führen. Wie Durchflusszytometer eingeführten Fehler kann durch Sicherstellung einer hohen Qualität Proben hergestellt (insbesondere die Aufmerksamkeit auf Filterzellen durch einen 70 &mgr; m-Mesh-Okklusion von Fluidleitungen in dem Durchflußcytometer durch große Zellaggregate zu minimieren), und dass das Durchflusszytometer aufrechterhalten begrenzt ein hoher Standard.
Messung der T-Zellantworten in vivoSeit vielen Jahren mit Vitalfarbstoffen wie CFSE Zielzellen in vivo Tod 12 überwachen geführt. Typischerweise sind diese Tests haben jedoch nur in der Lage, die Überwachung von bis zu 7-8 verschiedenen Zielzellen auf einmal 13 und so eine begrenzte Kapazität zur Tötung von Zielen zum Ausdruck mehrere Konzentrationen mehrerer Epitope, die normalerweise erforderlich sind, um eine detaillierte Bewertung der Erzeugung zu beurteilen gewesen Parameter wie die funktionelle Avidität der T-Zellantworten. In dieser Hinsicht kann Tetramerdissoziation Assays verwendet werden, um ein Maß der T-Zell-Avidität von frisch isolierten T-Effektorzellen 14-16 bereitzustellen. Diese Technik ist jedoch, misst MHC / TCR Bindungsavidität, und so ist keine vollständige Reflexion der funktionellen Avidität, die auch auf Veränderungen in der Struktur der immunologischen Synapse und den Stand der T-Zell-Signalkomponenten 17 verlassen können. Deshalb würde idealerweise funktionelle Avidität erfordert Dosis-Wirkungs-Experimente durchgeführt werden. Dieszuvor mit in-vitro-Techniken, wie der 51 Cr-Freisetzungs-Assay, der die intrazelluläre Cytokin-Färbungsanalyse 18, 19 oder ELISPOT-Assay 20, 21 erreicht worden ist. Diese Techniken sind jedoch häufig erforderlich, Effektor-T-Zellen in vitro stimuliert werden, was die Gesamtfunktions Avidität der Bevölkerung 22 verändern kann. Die FTA-Tests bietet daher eine Verbesserung gegenüber bestehenden Techniken, Mess CD4 + T-Zellen und CD8 + T-Zell-Antworten Dosis in situ und in Echtzeit gegen mehrere Epitope gleichzeitig, und so eine wertvolle Ergänzung zu bestehenden Techniken, um T-Zellen zu messen Effektor-Funktion. Wir erwarten, dass die Verwendung von FTA-Technologie wertvolle Screening Immuntherapie Strategien entwickelt, um qualitativ hochwertige T-Zellreaktionen, wie Impfstoffe gegen HIV-1 und Hepatitis C zu erzeugen gerichtet werden
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Project Grants # 1010395 (BQ und CP) und # 525431 (CR), und einem Programm Zuschuss # 455395 (CP) aus dem National Health and Medical Research Council of Australia, einem australischen Zentrum für Hepatitis-und HIV-Virologie EOI unterstützt 2012 Stipendium (CR und RJJ) und einem Zuschuss von der Gordon und Gretel Bootes Foundation (BQ und CR). Wir möchten Harpreet Vohra und Michael Devoy für ihre hervorragende Pflege des JCSMR FACS Labor danken, die australische Cancer Research Foundation Biomolekulare Ressourcenfazilität, JCSMR, ANU, für die Peptidsynthese, und Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australien für die Bereitstellung der Mutter HIV-Impfstoff-Aktien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
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