فلوري التهجين الموضع (FISH) في يسمح للكشف عن الأحماض النووية في بيئتها الأصلية داخل الخلايا. نحن هنا وصف بروتوكول لمجتمعة، كشف في وقت واحد من الحمض النووي الريبي والحمض النووي عن طريق FISH، والتي يمكن استخدامها لدراسة الكروموزوم (اكس) في تعطيل الماوس الخلايا الجذعية الجنينية.
فلوري التهجين الموضع (FISH) في هي تقنية الجزيئية التي تمكن الكشف عن الأحماض النووية في خلايا. وكثيرا ما يستخدم الحمض النووي FISH في علم الوراثة الخلوية وتشخيص السرطان، ويمكن الكشف عن الانحرافات من الجينوم، والذي لديه كثير من الأحيان آثار طبية هامة. RNA FISH يمكن استخدامها للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا، وقدمت معلومات هامة في تنظيم التعبير الجيني. الجمع بين DNA و RNA FISH ضمن نفس الخلية يمثل تحديا تقنيا، والظروف المناسبة لالحمض النووي FISH قد تكون قاسية جدا بالنسبة الهشة، واحد الذين تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي. ونحن هنا نقدم بروتوكول يسهل تطبيقها والتي تمكن المشترك، وكشف في وقت واحد من الحمض النووي الريبي والحمض النووي Xist المشفرة بواسطة X الكروموسومات. يمكن المرجح أن يتم تطبيق هذا الحمض النووي RNA-FISH البروتوكول جنبا إلى جنب مع الأنظمة الأخرى التي يحتاج فيها كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ليتم الكشف.
دراسة الخلايا والأنسجة عن طريق فلوري التهجين الموضع (FISH) في، منذ بدء العمل به في أواخر 1970s 1، سمح الباحثون لدراسة الجينات، وتنظيم الكروماتين والتعبير الجيني على مستوى التحت خلوية. وكثيرا ما يستخدم الحمض النووي FISH في علم الوراثة الخلوية، تنميط نووي 2، 3 تشخيص السرطان وما قبل الزرع الفحص الجيني 4، ولها دور مهم في مجال الأبحاث الجزيئية 5-6 لأنه يسمح للكشف عن الأحماض النووية في بيئتها الأصلية. واحد تحليل التعبير الخلية عن طريق الحمض النووي الريبي FISH يمكن الكشف عن النصوص الأولية المحلية والرنا غير المكودة يتم نسخها من الكروموسومات، ويوفر مزايا لغيرها من التقنيات التي تقيم التعبير الجيني على مستوى السكان، بما في ذلك على سبيل المثال الكمي RT-PCR، تحليل الجينوم واسعة التعبير أو النشاف الشمالية . من خلال وضع تصور النصوص الحمض النووي الريبي التي تنشأ مباشرة من مواقعها الأصلية، فقد كان على سبيل المثاللاحظت أن التعبير الجيني هو مؤشر ستوكاستيك 7، ويمكن أن يكون في بعض الأحيان محددة أليل 8. والتحسينات في تقنية حتى يسمح الكشف النوعي والكمي لجزيئات مرنا واحد داخل الخلايا 9-11.
المبدأ الأساسي للFISH يتكون من تهجين الأحماض النووية داخل الخلية إلى التحقيق الحمض النووي عن طريق محددة للغاية واتسون وكريك قاعدة الاقتران. التحقيق يمكن أن تكون إما مباشرة أو غير مباشرة الكشف، مما أدى إلى إشارة التي يمكن تصور مجهريا. وتألفت المحاولات الأولية لتحقيقات المسمى بالإشعاع، والتي كان من العيوب على أساس قضايا السلامة، والقرار المكانية محدودة والقدرة على الكشف عن هدف واحد فقط في كل مرة 12-14. التطور اللاحق للتسميات امشع، بما في ذلك fluorochromes، (Hapten) الناشب والإنزيمات، وسمح انتشار استخدام واسعة من الأسماك كأسلوب روتين البيولوجيا الجزيئية. يمكن إما التحقيق FISH يكون المسمى مباشرة مع fluorochرميس بواسطة الربط الكيميائي للجزيئات الحمض النووي الفلورسنت لتسلسل 15 والتكامل من النيوكليوتيدات fluorescently المسمى 16-19، أو التحقيق يمكن تصور بشكل غير مباشر بعد دمج (Hapten) الناشب (بما في ذلك البيوتين وdigoxigenin) وكشف المناعية (Hapten) الناشب عن طريق الأجسام المضادة المحددة ناشبة مترافق ل مراسل الفلورسنت جزيئات 20-21. النهج الأخير يسمح إشارة التضخيم باستخدام عدة طبقات من الأجسام المضادة fluorescently المسمى والتي تستخدم لتعزيز الإشارة الأصلية، وتمكن من الكشف عن الحمض النووي الريبي الأنواع التي يتم التعبير عنها في مستويات منخفضة. من خلال الجمع بين تقنيات وضع العلامات المباشرة وغير المباشرة ومختلف (Hapten) الناشب عدة أهداف يمكن تصور في وقت واحد داخل نفس الخلية.
واحدة من أهم الخطوات في بروتوكولات FISH هو التهجين من لجنة التحقيق إلى هدفه. على الرغم من الناحية النظرية، فإن التحقيق على وجه التحديد ربط فقط إلى هدفه، في الممارسة العملية، وهذا التحديدهو لم يتحقق دائما، كما تحقيقات قد ربط مناطق متماثلة، وسوف الظروف التهجين لا يكون دائما مثاليا لبعض الأنواع المنطقة DNA أو الحمض النووي الريبي. ولأهمية خاصة يغسل بعد التهجين هي، لأنها يمكن أن تزيد من صرامة الإجراءات FISH، ويمكن أن تمنع ملزم غير محدد من تحقيقات FISH، الذي من شأنه أن يؤدي إلى ارتفاع مستوى الضوضاء في الخلفية. كما تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي واحد يمكن بسهولة أن تكون المهجنة إلى التحقيق FISH. في المقابل، فإن جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل يحتاج أولا خطوة تمسخ، وبعد ذلك يمكن اجراء تحقيق هجن. وعادة ما يتحقق هذا عن طريق تسخين العينة، والذي ينتج في تمسخ من الحمض النووي. ومع ذلك، في ظل هذه الظروف القاسية، قد يتم فقدان الهشة، واحد الذين تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي. لذلك، يتطلب الحمض النووي RNA-مجتمعة FISH الأمثل كبيرة من الظروف، وأكثر تحديا تقنيا مقارنة الكشف منفصلة من الحمض النووي الريبي فقط أو الحمض النووي.
نحن هنا حاضراتا بروتوكول مفصلة من جنبا إلى جنب، في وقت واحد FISH الحمض النووي RNA-الذي سمح لنا لدراسة الكروموزوم (اكس) تعطيل (XCI) في التفريق فئران الخلايا الجذعية الجنينية 22-24. XCI هو آلية جينية حاسمة للتنمية الجنينية الإناث 25، والنتائج في الكروماتين المغاير، وبالتالي إسكات واحد من اثنين من الكروموزومات X في الأفراد الإناث 26-27. الأساسية لهذه العملية هو الحمض النووي الريبي Xist غير المكودة 28-30، والتي يتم تنظيمها من قبل RNF12 22-23 وREX1 24 البروتينات. التعبير Xist يصبح غير نشط upregulated على الكروموزوم (اكس) في المستقبل (شي) أثناء التطور الجنيني أو على تمايز الخلايا ES في المختبر ، ويمكن أن ينتشر على طول الكروموسوم X، وبالتالي جذب لونين إعادة عرض الانزيمات التي تؤدي إلى إيقاف النسخي من الكروموزوم (اكس) 31. نشر هذا Xist RNA يمكن تصور بواسطة الحمض النووي الريبي FISH بوصفها طلاء من الصبغي Xبعض، والذي يشار إليه أيضا باسم سحابة Xist. منذ خلايا ES الإناث يمكن أن تفقد واحدا من الكروموسومات X، نظرا لعدم الاستقرار الجيني، ونحن وآخرون يعملون مجتمعة الحمض النووي RNA-FISH لدراسة XCI، للتأكد من أن يتم تقييم الخلايا فقط karyotypically مستقرة في تحليل هذه العملية الهامة 22،32 -34. كما هو الحال مع كل تقنية البيولوجيا الجزيئية، وقد نشرت عدة بروتوكولات مختلفة ممتازة 35-38. هنا نقدم أسلوبنا، بدءا من تحريض التمايز في الخلايا ES الماوس، تثبيت الخلايا، ووضع العلامات تحقيقات FISH نيك الترجمة، قبل المعاملة من خلايا ثابتة للسماح permeabilization واللاحقة امتصاص التحقيق، التهجين من لجنة التحقيق إلى الهدف، وأخيرا كشف التحقيق عن طريق الأجسام المضادة fluorescently المسمى. بروتوكول هنا قدمت يسمح للكشف المؤمنين من Xist الحمض النووي الريبي والكروموزوم (اكس) في غضون يومين، وأساسيات هذه التقنية يمكن المرجح أن تتكيف مع التمديدنظم لها ومجالات البحث.
الجمع بين الحمض النووي RNA-FISH يمكن أن يكون تحديا من الناحية التقنية، والظروف المناسبة لالحمض النووي FISH يمكن أن تكون قاسية جدا لجزيئات الحمض النووي الريبي أقل استقرارا. وقد تم تطبيق عدة نهج لدراسة كل من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في نفس الخلية، التحايل على الح…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.
female mouse embryonic stem cells | will be made available upon request | ||
mouse embryonic fibroblasts | can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore | ||
ES cell culture medium | DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks. | ||
LIF | Chemicon | ESG1107 | |
DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10099141 | |
Penicillin–streptomycin (100×) | Invitrogen | 15140-122 | |
Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140-050 | |
ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
ES cell differentiation medium | IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid | ||
IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
Ascorbic acid (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
T25 cell culture dishes | Greiner Bio-one | 690160 | |
6-well cell culture dishes | Greiner Bio-one | 662160 | |
cell culture grade PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
falcon tubes | Falcon | 352196 | |
24×24 mm coverslips | Menzle | 780882 | |
gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC |
absolute 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions |
RNAse free water | Baxter | TKF7114 | |
sterile filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) | Roche | 11745816910 | |
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) | Roche | 11745824910 | |
Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
2 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
sterilized cotton | |||
eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | |
yeast tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
eppendorf bench top microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
2M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
50+ hybridization solution | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7 | ||
formamide | Acros organics | 3272350000 | |
dextran sulfate | Fluka | 31403 | |
pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml |
HCL, 37% solution | Fluka | 84422 | |
object glasses | Starfrost | 8037/1 | |
20x SSC | Invitrogen | AM9763 | dilute to 2x SSC in RNAse free water |
10 mM Phosphate buffer, pH 7 | add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave | ||
denaturation buffer | 70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7 | ||
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
2M Tris pH 7.5 solution | |||
Tris-Saline-Tween washing solution (TST) | 100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter | ||
10x Saline solution | dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave | ||
Tris-Saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O | ||
BSA, purified, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
sheep-anti-dig antibody | Roche diagnostics | use 1:500 diluted in TSBSA | |
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
mouse-anti-biotin antibody | Roche diagnostics | use 1:200 diluted in TSBSA | |
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
Tris-Saline washing solution (TS) | 10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O | ||
Vectashield mounting medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
nail-varnish | |||
fluorescent miscroscope |