Kombinerad DNA-RNA Fluorescent<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) för att studera X-kromosom inaktivering i Differentierade Kvinna Mouse embryonala stamceller

Summary

Fluorescent in situ-hybridisering (FISH) tillåter detektion av nukleinsyror i deras nativa omgivning inom celler. Vi beskriver här ett protokoll för det kombinerade, samtidig upptäckt av RNA och DNA med hjälp av FISH, som kan användas för att studera X-kromosom inaktivering i mus embryonala stamceller.

Abstract

Fluorescent in situ-hybridisering (FISH) är en molekylär teknik som gör att detektionen av nukleinsyror i celler. DNA FISH används ofta i cytogenetik och cancerdiagnostik och kan detektera avvikelser av genomet, som ofta har viktiga kliniska implikationer. RNA FISH kan användas för att detektera RNA-molekyler i celler och har gett viktiga insikter i reglering av genuttryck. Kombinera DNA och RNA FISH inom samma cell är tekniskt utmanande, eftersom förhållandena är lämpliga för DNA FISH kan vara för hårda för ömtåliga, enkelsträngade RNA-molekyler. Presenterar vi här en lätt tillämplig protokollet som gör att den kombinerade, samtidig detektion av Xist RNA och DNA kodas av X-kromosomer. Denna kombinerade DNA-RNA-FISH protokoll kan sannolikt tillämpas på andra system, där både RNA och DNA måste detekteras.

Introduction

Att studera celler och vävnader med hjälp av fluorescent in situ hybridisering (FISH) har, sedan den introducerades i slutet av 1970-talet ^1, får forskare att studera gener, kromatin organisation och genuttryck på subcellulär nivå. DNA FISH används ofta i cytogenetik, karyotypning ^2, cancerdiagnostik ³ och preimplantatorisk genetisk screening ^4, och har en viktig roll i molekylär forskning ^5-6 eftersom den tillåter detektion av nukleinsyror i sin nativa miljö. Single cellexpressionsanalys av RNA FISH kan upptäcka inhemska primära avskrifter och icke-kodande RNA som transkriberas från kromosomer, och erbjuder fördelar till andra tekniker som bedömer genuttryck på populationsnivå, inklusive exempelvis kvantitativ RT-PCR, genom breda uttrycksanalys eller Northern blotting . Genom att visualisera RNA-transkript med ursprung direkt från sina webbplatser ursprungs har det till exempel varitmärkt att genuttryck är stokastisk ^7, och kan ibland vara allelspecifik ^8. Förbättringar av tekniken har även gjort det möjligt för detektion och kvantifiering av enskilda mRNA-molekyler i celler ^9-11.

Den grundläggande principen för FISH består av hybridisering av nukleinsyror i cellen till en nukleinsyrasond med hjälp av starkt specifika Watson och Crick basparning. Sonden kan vara antingen direkt eller indirekt upptäckts, vilket resulterar i en signal som kan mikroskopiskt visualiseras. Inledande försök bestod av radioaktivt märkta prober, som hade nackdelar baserat på säkerhetsfrågor, begränsad rumslig upplösning och förmågan att upptäcka bara ett mål i taget ^12-14. Den efterföljande utvecklingen av icke-radioaktiva etiketter, inklusive fluorokromer, haptener och enzymer, har gjort utbredd användning av fisk som en rutin molekylärbiologi teknik. FISH sonden kan antingen direkt märkt med fluorochromes genom kemisk koppling av fluorescerande molekyler till nukleinsyrasekvenser ¹⁵ och integrering av fluorescensmärkta nukleotider ^{16 till 19,} eller sonden kan indirekt visualiseras efter integration av haptener (inklusive biotin och digoxigenin) och immunologisk detektion av haptener av hapten-specifika antikroppar konjugerade till fluorescerande reportermolekyler ^20-21. Den senare metoden ger signalförstärkning genom att använda flera lager av fluorescensmärkta antikroppar, som används för att förbättra den ursprungliga signalen, och möjliggör detektion av RNA-typ som uttrycks vid låga nivåer. Genom att kombinera direkta och indirekta märkningstekniker och olika haptener kan flera mål samtidigt visualiseras inom samma cell.

En av de viktigaste stegen i fisk protokoll är hybridisering av sonden till sitt mål. Även i teorin, kommer en sond specifikt binder endast till sitt mål, i praktiken, detta specificitetär inte alltid uppnås, som sönder kan binda till homologa regioner, och hybridiseringsbetingelser kommer inte alltid att vara idealisk för en viss DNA-region-eller RNA-arter. Post-hybridisering tvättar är därför av särskild betydelse, eftersom de kan öka stringensen för FISH förfarandet och kan förhindra ospecifik bindning av FISH-prober, vilket skulle resultera i en hög nivå av bakgrundsbrus. Som RNA-molekyler är enkelsträngat de lätt kan hybridiseras till en FISH sond. Däremot den dubbelsträngade DNA-molekylen behöver först ett denatureringssteg, varefter en sond kan hybridisera. Detta uppnås vanligen genom upphettning av provet, vilket resulterar i denaturering av DNA. Men under dessa svåra förhållanden, bräckligt, enkelsträngade RNA-molekyler kan förloras. Därför kräver kombinerad DNA-RNA-FISH signifikant optimering av förhållandena, och är mer tekniskt utmanande jämfört med den separata detektionen av endast RNA eller DNA.

Här pre viTA detaljerat protokoll av kombinerad, samtidig DNA-RNA-FISK som har gett oss möjlighet att studera X-kromosom inaktivering (XCI) att skilja kvinnliga mus embryonala stamceller ^22-24. XCI är en avgörande epigenetisk mekanism för kvinnliga foster-utveckling ^25, och resulterar i heterochromatinization och därmed tysta av en av de två X-kromosomer i kvinnliga individer ^26-27. Väsentligt för denna process är den icke-kodande RNA Xist ^28-30, vilket regleras av RNF12 ^22-23 och REX1 ²⁴ proteiner. Xist uttryck blir uppregleras på framtiden inaktiva X-kromosomen (Xi) under fosterutvecklingen eller på ES-celldifferentiering in vitro , och kan spridas längs X-kromosomen och därmed locka kromatin remodeling enzymer som leder till transkription avstängning av X-kromosomen ^31. Denna spridning av Xist RNA kan visualiseras genom RNA FISH såsom en beläggning av X chromonågra, som även hänvisas till som en Xist moln. Eftersom kvinnliga ES-celler kan förlora en av sina X-kromosomer på grund av genomisk instabilitet, har vi och andra anställda kombinerade DNA-RNA FISH att studera XCI, för att se till att endast karyotypiskt stabila celler bedöms i analysen av denna viktiga process ^{22,32 -34.} Som med varje molekylärbiologi teknik har flera olika utmärkta protokoll publicerats ^35-38. Här presenterar vi vår metod, från induktion av differentiering i mus ES-celler, fixering av celler, märkning av fisk sonder av Nick-translation, förbehandling av fasta celler för att möjliggöra permeabilisering och efterföljande sond upptag, hybridisering av sonden till mål, och slutligen detektering av sonden genom fluorescensmärkta antikroppar. Den häri presenterade protokollet tillåter de troende upptäcka Xist RNA och X-kromosomen inom en period på två dagar, och grunderna i denna teknik kan sannolikt anpassas till othennes system och forskningsområden.

Protocol

1. Induktion av differentiering i Kvinna embryonala stamceller att inducera X kromosom inaktivering OBS: Kvinnor musen embryonala stamceller (på begäran) odlas under standardiserade ES-cellförhållanden på gelatiniserade odlingsplattor belagda med mus embryonala fibroblaster (MEFs). Vi här förutsätter att läsaren är bekant med standardcellodlingstekniker 39-41. För att inducera differentiering, kommer ES-celler som odlas i T25 rätter separeras från MEF, och kommer att p?…

Representative Results

Med hjälp av ovan nämnda protokoll för kombinerad DNA-RNA-FISH har vi kunnat visualisera X-kromosom inaktivering för att skilja kvinnliga embryonala stamceller. Figur 1 visar ett representativt exempel på en DNA-RNA-FISH experiment, där vi upptäckt både Xist (vilket är synlig som en sk Xist RNA moln på den inaktiva X-kromosomen och en basal transkription peka på den aktiva X-kromosom), och en region av X-kromosomen, vilket syns som en peka signal. Observera att en av knappn?…

Discussion

Kombinerad DNA-RNA FISH kan vara tekniskt utmanande, eftersom förhållandena är lämpliga för DNA FISH kan vara för hård för mindre stabila RNA-molekyler. Flera tillvägagångssätt har använts för att studera både DNA och RNA i samma cell, kringgår behovet av samtidig inkubation med sökfragment som detekterar både DNA och RNA. Till exempel, i en överlagring tillvägagångssätt först RNA FISH utfördes och cellerna avbildas, och koordinaterna tas. Därefter tillämpas samma slides användes för DNA-FISH,…

Materials

female mouse embryonic stem cells			will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts			can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore
ES cell culture medium			DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks.
LIF	Chemicon	ESG1107
DMEM	Invitrogen	11960085
Fetal Calf Serum	Invitrogen	10099141
Penicillin–streptomycin (100×)	Invitrogen	15140-122
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140-050
ß-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
ES cell differentiation medium			IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax	Invitrogen	31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml)	Sigma-Aldrich	A4403
monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
T25 cell culture dishes	Greiner Bio-one	690160
6-well cell culture dishes	Greiner Bio-one	662160
cell culture grade PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS	Gibco	25200-056
falcon tubes	Falcon	352196
24×24 mm coverslips	Menzle	780882
gelatin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC
absolute 100%  ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L	use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water	Baxter	TKF7114
sterile filter tips	Rainin Bio Clean	GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)	Roche	11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)	Roche	11745824910
Sephadex G50	Sigma-Aldrich	G5080
2 ml syringe	BD Plastipak	300013
sterilized cotton
eppendorf tubes	Eppendorf	30120086
yeast tRNA 10 mg/ml	Invitrogen	15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen	15632-011
mouse cot-1 DNA  1 mg/ml	Invitrogen	18440-016
eppendorf bench top microcentrifuge	Eppendorf	Model 5417R
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
2M NaAc, pH 5.6	Sigma-Aldrich	S7670
50+ hybridization solution			50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide	Acros organics	3272350000
dextran sulfate	Fluka	31403
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887	prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml
HCL, 37% solution	Fluka	84422
object glasses	Starfrost	8037/1
20x SSC	Invitrogen	AM9763	dilute to 2x SSC in RNAse free water
10 mM Phosphate buffer, pH 7			add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer			70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
2M Tris pH 7.5 solution
Tris-Saline-Tween washing solution (TST)			100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter
10x Saline solution			dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave
Tris-Saline-BSA (TSBSA)			500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x	New England Biolabs	B9001S
sheep-anti-dig antibody	Roche diagnostics		use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody	Roche diagnostics		use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-Saline washing solution (TS)			10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
nail-varnish
fluorescent miscroscope