Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombinerad DNA-RNA Fluorescent Published: June 14, 2014 doi: 10.3791/51628
Automatic Translation
1, 1
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Summary

Fluorescent in situ-hybridisering (FISH) tillåter detektion av nukleinsyror i deras nativa omgivning inom celler. Vi beskriver här ett protokoll för det kombinerade, samtidig upptäckt av RNA och DNA med hjälp av FISH, som kan användas för att studera X-kromosom inaktivering i mus embryonala stamceller.

Abstract

Fluorescent in situ-hybridisering (FISH) är en molekylär teknik som gör att detektionen av nukleinsyror i celler. DNA FISH används ofta i cytogenetik och cancerdiagnostik och kan detektera avvikelser av genomet, som ofta har viktiga kliniska implikationer. RNA FISH kan användas för att detektera RNA-molekyler i celler och har gett viktiga insikter i reglering av genuttryck. Kombinera DNA och RNA FISH inom samma cell är tekniskt utmanande, eftersom förhållandena är lämpliga för DNA FISH kan vara för hårda för ömtåliga, enkelsträngade RNA-molekyler. Presenterar vi här en lätt tillämplig protokollet som gör att den kombinerade, samtidig detektion av Xist RNA och DNA kodas av X-kromosomer. Denna kombinerade DNA-RNA-FISH protokoll kan sannolikt tillämpas på andra system, där både RNA och DNA måste detekteras.

Introduction

Att studera celler och vävnader med hjälp av fluorescent in situ hybridisering (FISH) har, sedan den introducerades i slutet av 1970-talet 1, får forskare att studera gener, kromatin organisation och genuttryck på subcellulär nivå. DNA FISH används ofta i cytogenetik, karyotypning 2, cancerdiagnostik 3 och preimplantatorisk genetisk screening 4, och har en viktig roll i molekylär forskning 5-6 eftersom den tillåter detektion av nukleinsyror i sin nativa miljö. Single cellexpressionsanalys av RNA FISH kan upptäcka inhemska primära avskrifter och icke-kodande RNA som transkriberas från kromosomer, och erbjuder fördelar till andra tekniker som bedömer genuttryck på populationsnivå, inklusive exempelvis kvantitativ RT-PCR, genom breda uttrycksanalys eller Northern blotting . Genom att visualisera RNA-transkript med ursprung direkt från sina webbplatser ursprungs har det till exempel varitmärkt att genuttryck är stokastisk 7, och kan ibland vara allelspecifik 8. Förbättringar av tekniken har även gjort det möjligt för detektion och kvantifiering av enskilda mRNA-molekyler i celler 9-11.

Den grundläggande principen för FISH består av hybridisering av nukleinsyror i cellen till en nukleinsyrasond med hjälp av starkt specifika Watson och Crick basparning. Sonden kan vara antingen direkt eller indirekt upptäckts, vilket resulterar i en signal som kan mikroskopiskt visualiseras. Inledande försök bestod av radioaktivt märkta prober, som hade nackdelar baserat på säkerhetsfrågor, begränsad rumslig upplösning och förmågan att upptäcka bara ett mål i taget 12-14. Den efterföljande utvecklingen av icke-radioaktiva etiketter, inklusive fluorokromer, haptener och enzymer, har gjort utbredd användning av fisk som en rutin molekylärbiologi teknik. FISH sonden kan antingen direkt märkt med fluorochromes genom kemisk koppling av fluorescerande molekyler till nukleinsyrasekvenser 15 och integrering av fluorescensmärkta nukleotider 16 till 19, eller sonden kan indirekt visualiseras efter integration av haptener (inklusive biotin och digoxigenin) och immunologisk detektion av haptener av hapten-specifika antikroppar konjugerade till fluorescerande reportermolekyler 20-21. Den senare metoden ger signalförstärkning genom att använda flera lager av fluorescensmärkta antikroppar, som används för att förbättra den ursprungliga signalen, och möjliggör detektion av RNA-typ som uttrycks vid låga nivåer. Genom att kombinera direkta och indirekta märkningstekniker och olika haptener kan flera mål samtidigt visualiseras inom samma cell.

En av de viktigaste stegen i fisk protokoll är hybridisering av sonden till sitt mål. Även i teorin, kommer en sond specifikt binder endast till sitt mål, i praktiken, detta specificitetär inte alltid uppnås, som sönder kan binda till homologa regioner, och hybridiseringsbetingelser kommer inte alltid att vara idealisk för en viss DNA-region-eller RNA-arter. Post-hybridisering tvättar är därför av särskild betydelse, eftersom de kan öka stringensen för FISH förfarandet och kan förhindra ospecifik bindning av FISH-prober, vilket skulle resultera i en hög nivå av bakgrundsbrus. Som RNA-molekyler är enkelsträngat de lätt kan hybridiseras till en FISH sond. Däremot den dubbelsträngade DNA-molekylen behöver först ett denatureringssteg, varefter en sond kan hybridisera. Detta uppnås vanligen genom upphettning av provet, vilket resulterar i denaturering av DNA. Men under dessa svåra förhållanden, bräckligt, enkelsträngade RNA-molekyler kan förloras. Därför kräver kombinerad DNA-RNA-FISH signifikant optimering av förhållandena, och är mer tekniskt utmanande jämfört med den separata detektionen av endast RNA eller DNA.

Här pre viTA detaljerat protokoll av kombinerad, samtidig DNA-RNA-FISK som har gett oss möjlighet att studera X-kromosom inaktivering (XCI) att skilja kvinnliga mus embryonala stamceller 22-24. XCI är en avgörande epigenetisk mekanism för kvinnliga foster-utveckling 25, och resulterar i heterochromatinization och därmed tysta av en av de två X-kromosomer i kvinnliga individer 26-27. Väsentligt för denna process är den icke-kodande RNA Xist 28-30, vilket regleras av RNF12 22-23 och REX1 24 proteiner. Xist uttryck blir uppregleras på framtiden inaktiva X-kromosomen (Xi) under fosterutvecklingen eller på ES-celldifferentiering in vitro , och kan spridas längs X-kromosomen och därmed locka kromatin remodeling enzymer som leder till transkription avstängning av X-kromosomen 31. Denna spridning av Xist RNA kan visualiseras genom RNA FISH såsom en beläggning av X chromonågra, som även hänvisas till som en Xist moln. Eftersom kvinnliga ES-celler kan förlora en av sina X-kromosomer på grund av genomisk instabilitet, har vi och andra anställda kombinerade DNA-RNA FISH att studera XCI, för att se till att endast karyotypiskt stabila celler bedöms i analysen av denna viktiga process 22,32 -34. Som med varje molekylärbiologi teknik har flera olika utmärkta protokoll publicerats 35-38. Här presenterar vi vår metod, från induktion av differentiering i mus ES-celler, fixering av celler, märkning av fisk sonder av Nick-translation, förbehandling av fasta celler för att möjliggöra permeabilisering och efterföljande sond upptag, hybridisering av sonden till mål, och slutligen detektering av sonden genom fluorescensmärkta antikroppar. Den häri presenterade protokollet tillåter de troende upptäcka Xist RNA och X-kromosomen inom en period på två dagar, och grunderna i denna teknik kan sannolikt anpassas till othennes system och forskningsområden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Induktion av differentiering i Kvinna embryonala stamceller att inducera X kromosom inaktivering

OBS: Kvinnor musen embryonala stamceller (på begäran) odlas under standardiserade ES-cellförhållanden på gelatiniserade odlingsplattor belagda med mus embryonala fibroblaster (MEFs). Vi här förutsätter att läsaren är bekant med standardcellodlingstekniker 39-41. För att inducera differentiering, kommer ES-celler som odlas i T25 rätter separeras från MEF, och kommer att på platta i differentieringsmedium.

  1. Ta ES medium från ES cellodling, och tvätta två gånger med cellodling PBS.
  2. Tillsätt 1,5 ml trypsin-EDTA (förvärmd till 37 ° C), och inkubera cellerna vid 37 ° C under 7 min. Efter 3,5 min, skaka skålen försiktigt för att bryta upp kolonierna.
  3. Inaktivera trypsin-EDTA genom tillsats av 3,5 ml av differentieringsmedium till cellerna. Pipettera cellerna upp och ned för att erhålla en enskild cell-lösning, och samlai ett 15 ml rör. Centrifugering under 5 minuter vid 200 xg, och samla in celler i 10 ml av differentieringsmedium.
  4. Lägg cellsuspension till en icke-gelatinerad odlingsskål, och inkubera under 1 h i en cellkultur inkubator. OBSERVERA: MEFs kommer att kunna ansluta sig till icke-gelatinerad odlingsskål, medan ES-celler kommer att förbli i suspension.
  5. Under tiden till steriliserade täckglas av glas (24 x 24 mm) till 6-brunnars plattor, tillsätt 0,2% gelatin, och inkubera i minimal 5 min vid rumstemperatur.
  6. Efter 1 timme, samla in supernatanten av pre-plated ES-cellkultur, som huvudsakligen kommer att bestå av icke-vidhäftande ES-celler. Tallrik ES-celler till 6-brunnars plattor innehållande täckglas. NOTERA: Använd ⅙ th av en konfluent T25 skålen för sex brunnar i en 6-brunnsplatta. Detta kommer att möjliggöra en sammanflytande differentiering väl efter 3 dagar av differentiering. Ändra medium på en daglig basis. För längre differentiering tidsförlopp, plåt pre-pläterade ES-celler i differentieringsmedium i bakteriella rätter och incubåt på en cell shaker integreras i cellkultur inkubator. Detta kommer att tillåta cellerna att bilda embryoidkroppar, vilka kan vara pläterade på täckglasen 1-2 dagar före fixering.

2. Fixering av differentierad ES-celler för senare DNA-RNA-FISH analys

  1. Ta differentiering medium från differentiering kulturer, och tvätta två gånger med cellodling PBS. OBS: Lägg PBS försiktigt för att förhindra att cellerna spolas bort.
  2. Avlägsna cellodling PBS och fixera cellerna genom tillsats av 4% paraformaldehyd (PFA) / PBS och inkubera under 10 min vid rumstemperatur. VARNING: PFA är giftigt och kan orsaka betydande hälsorisk när de andas in eller vid kontakt med hud eller ögon. Vidare är PFA karcinogena.
  3. Ta bort 4% PFA / PBS, och tvätta täck 3x med 70% etanol. OBS: Korrekt tvättning är viktig, eftersom varje spår av PFA kommer störa efterföljande FISK steg. Täckglas kan förvaras i 70% etanol vid -20 ° C under flera månader före FISH-analys.

3. Märkning av DNA-prober för FISH Experiment

OBS: Skaffa ett DNA-fragment av genen av intresse (minimal längd> 2 kb för RNA-FISH, eller> 20 kb för DNA FISH), eller en BAC som täcker genen av intresse. För RNA-detektion, kan en mindre sond vara tillräcklig i förhållande till DNA-detektion, eftersom troligen transkriptionen kommer att resultera i multipla transkript, som kan detekteras samtidigt. För en stark signal på den enda kopian DNA-strängen, är en längre sond krävs, för att kunna upptäcka ett tillräckligt antal inbyggda haptener. Företrädesvis används en icke-transkriberad genomregion som valts för konstruktionen av DNA-prob. Dessutom när man använder en mindre sond för att detektera RNA, det kommer att förhindras att den genomiska loci från vilken RNA transkriberas har detekterats i den kombinerade DNA-RNA-FISH tillvägagångssätt, även om detta inte helt kan uteslutas. För att upptäcka musen Xist, var en 5,5 kb cDNA-sond som används. För DETektion av X-kromosomen kan flera BAC-prober användas. Goda resultat har erhållits med en blandning av BAC RP23-100E1 och BAC CT7-474E4, som ligger i omedelbar närhet till den Xist lokuset. Beroende på gen-eller kromosom av intresse, kan ett flertal olika sönder krävas för att erhålla optimala resultat. När du arbetar med material som kommer att användas för RNA-FISH, använd sterila filterspetsar, RNas fritt H2O, och arbeta i en ren miljö.

  1. Ta ett ig DNA och utspädd i H2O i en total volym av 16 | il. Lägg 4 pl av digoxigenin eller biotin märkning lösningen (se reagenser), blanda genom att vortexa och inkubera vid 16 ° C under 90 min. ANMÄRKNING: biotin eller digoxigeninmärkta nukleotider kommer nu att inkorporeras genom nick-translation.
  2. Under tiden förbereder G50 kolonner för att avlägsna icke-integrerade nukleotider. Ta en 2 ml spruta, ta bort stamper, och lägga steriliserad bomull i sprutan. Lägg G50 bollar i lösning to fylla sprutan, placera sprutan i ett 15 ml rör och centrifugera vid 642 xg under 1 minut. OBS: Cirka 80% av sprutan ska nu fyllas med G50. Upprepa när mindre G50 är närvarande.
  3. Efter 90 min, tillsätt 40 | il av H2O till det nick-translationsreaktionsblandningen och tillsätt reaktion på G50-kolonn. Lägg till ett tomt rör i kolumnen, och centrifugera vid 642 xg under 2 minuter. Samla flödet genom i ett reaktionsrör.
  4. Mät volymen av flödet genom med en pipett och tillsätt H2O för att nå en total volym av 200 | il. Fällning genomflödet genom att tillsätta 13,3 pl laxspermie-DNA (10 mg / ml), 13,3 | il jäst-tRNA (10 mg / ml), 26,7 | il mus Cot-1-DNA (1 mg / ml) och 28 ^ il 2 M NaAc, pH 5,6. Blanda genom att vortexa och lägga 533 l iskall 100% etanol. Skaka röret och centrifugera vid 16.200 xg under 30 minuter vid 4 ° C.
  5. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten två gånger med 70% etanol. Centrifugera vid 16.200 xg under 5 minuter vid4 ° C, och lufttorka pelleten. Addera 50 pl av 50 + hybridiseringslösning, och inkubera vid 37 ° C under 30 min för att underlätta upplösningen. OBSERVERA: märkt prob kan lagras i flera år vid -20 ° C. VARNING: 50 + hybridisering lösning innehåller formamid, som är giftigt, kan irritera hud, ögon och andningsvägar, och är också en teratogen.

4. Permeabilization, Förbehandling och hybridisering av fasta celler för kombinerad DNA-RNA FISH

  1. Rehydrera fixerade celler på täckglas, genom att ta bort 70% etanol och tillsats av cellodling PBS till 6-brunnars plattor. Inkubera i 5 min. Upprepa totalt tre gånger.
  2. Avlägsna cellodling PBS, och tillsätt 0,2% pepsin till 6-brunnsplattor, för att permeabilisera cellerna. Inkubera 6-brunnars plattor i ett vattenbad vid 37 ° C under 4 min. Ta pepsin, och inaktivera med RNas fritt H2O
  3. Post-fix-celler genom inkubering med 4% PFA / PBS under 5 min vid rumstemperatur. Efter fixatividare, tvätta två gånger med cellodling PBS under 5 min.
  4. Dehydrera celler genom inkubering med 70% etanol under 3 min, 90% etanol under 3 min och 100% etanol under 3 min. Överföring täckglas av 6-brunnsplattor, och lufttorka täckglas i flera minuter.
  5. Age-celler genom att inkubera täckglas vid 65 ° C under 1 timme på en värmeplatta.
  6. Pre-hybridisera FISH sond med mus Cot-1-DNA genom addition för varje täckglas, som skall analyseras, 25 pl av 50 + hybridiseringslösning, 0,5 | il mus Cot-1-DNA, 1 ^ il av biotinmärkt Xist sond och ett pl av digoxigenin märkta BAC sond upptäcka X-kromosomen. Blanda genom virvling och denaturera vid 99 ° C under 5 min. Inkubera omedelbart vid 37 ° C under 45 min, för att tillåta Cot-1-DNA för att hybridisera till upprepningssekvenser är närvarande i sondema.
  7. Efter åldring, spot 50 | il av denatureringsbuffert (som består av 70% formamide/2x SSC/10 mM fosfatbuffert) på ett objektglas, och satte täckglas på toppen med celler som vetter towards denatureringsbufferten. Inkubera vid 65 ° C under 2 min.
  8. Lägg täck tillbaka till 6-brunnsplattor, och post-fix-celler genom att inkubera i iskall 70% etanol under 5 min.
  9. Dehydrera celler genom efterföljande inkubering i 70% etanol under 3 min, 90% etanol under 3 min och 100% etanol under 3 min. Avlägsna täckglasen från 6-brunnars plattor och låt lufttorka under flera minuter.
  10. Spot förväg hybridiserad sond på ett objektglas och inkubera täckglas ovanpå. Placera objektglasen i en fuktsatt kammare fylld med 50 ml 50% formamide/2x SSC och inkubera över natten vid 37 ° C.

5. Efter hybridiseringsbetingelser tvättar och antikroppsmedierad Detektion av Probe

  1. Fyll 6-brunnars plattor med 2x SSC, och pre-varm till 42 ° C. Lägg täckglas efter inkubation över natten, och inkubera vid 42 ° C under 5 min.
  2. Avlägsna 2x SSC, och inkubera täckglas med 50% formamide/2x SSC under 10 min vid 42 ° C. Upprepa totalt 3 gånger (30 min tvätt helt). Ta bort 50% formamide/2x SSC och tvätta objektglas med Tris-salin-Tween (TST) för 2 x 5 min vid rumstemperatur.
  3. Spot 50 pl Tris-salin-BSA (TSBSA) per täckglas på nya objektglas och inkubera täck upp och ner för blockering under 30 minuter vid rumstemperatur i en TST-fuktad mörk kammare.
  4. Överföring täckglas tillbaka till 6-brunnars plattor och tvätta 2 x 5 min med TST.
  5. Ställe 50 ul av får-anti-DIG-antikropp (1:500 i TSBSA) per täckglas på nya objektglas och inkubera täck uppochner för första inkubationssteg under 30 min vid rumstemperatur i en TST-befuktad mörka kammaren.
  6. Överföring täckglas tillbaka till 6-brunnars plattor och tvätta 2 x 5 min med TST.
  7. Ställe 50 il av kanin-anti-får-antikropp konjugerad med FITC (1:250 i TSBSA) per täckglas på nya objektglas och inkubera täck uppochned för andra inkubationssteg under 30 min vid rumstemperatur i en TST-befuktad mörka kammaren .
  8. Tränsfer täckglas tillbaka till 6-brunnars plattor och tvätta 2 x 5 min med TST.
  9. Spot 50 pl av get-anti-kanin antikropp konjugerad med FITC (1:250 i TSBSA) per täckglas på nya objektglas och inkubera täck upp och ner för tredje inkuberingssteget under 30 minuter vid rumstemperatur i en TST-fuktad mörk kammare .
  10. Överföring täckglas tillbaka till 6-brunnars plattor och tvätta 2 x 5 min med TST.
  11. Spot 50 l av mus-anti-biotin antikropp (1:200 i TSBSA) per täckglas på nya objektglas och inkubera täck upp och ned för fjärde inkuberingssteget under 30 minuter vid rumstemperatur i en TST-fuktad mörk kammare.
  12. Överföring täckglas tillbaka till 6-brunnars plattor och tvätta 2 x 5 min med TST.
  13. Spot 50 pl åsna-anti-mus-antikroppar konjugerade med Rhodamine (1:250 i TSBSA) per täckglas på nya objektglas och inkubera täck upp och ned för femte inkuberingssteget under 30 minuter vid rumstemperatur i en TST-fuktad mörk chamber.
  14. Överföring täckglas tillbaka till 6-brunnars plattor och tvätta 2 x 5 min med TST.
  15. Spot 50 pl av get-anti-häst antikropp konjugerad med Rhodamine (1:250 i TSBSA) per täckglas på nya objektglas och inkubera täck upp och ner för sjätte inkuberingssteget under 30 minuter vid rumstemperatur i en TST-fuktad mörk kammare . OBSERVERA: get-anti-häst-antikroppen känner igen åsna-anti-mus-antikropp; när till forskarens kommer en get-anti-åsna kroppen fungerar så bra.
  16. Överföring täckglas tillbaka till 6-brunnars plattor och tvätta 2 x 5 min med TST. Tvätta ytterligare 5 min med Tris-saltlösning (TS).
  17. Dehydrera celler genom efterföljande inkubering i 70% etanol under 3 min, 90% etanol under 3 min och 100% etanol under 3 min. Avlägsna täckglasen från 6-brunnars plattor och låt lufttorka under flera minuter.
  18. Spot en droppe monteringsmedium med DAPI (se reagens) på ett objektglas och tillsätt täck uppochned ovanpå. Täta diabilder med nagellack ochbedöma FISH resultat av fluorescerande mikroskopi (Figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av ovan nämnda protokoll för kombinerad DNA-RNA-FISH har vi kunnat visualisera X-kromosom inaktivering för att skilja kvinnliga embryonala stamceller. Figur 1 visar ett representativt exempel på en DNA-RNA-FISH experiment, där vi upptäckt både Xist (vilket är synlig som en sk Xist RNA moln på den inaktiva X-kromosomen och en basal transkription peka på den aktiva X-kromosom), och en region av X-kromosomen, vilket syns som en peka signal. Observera att en av knappnålssignalerna ligger inom Xist molnet, vilket visar att Xist molnet verkligen är lokalisera tillsammans, och beläggning X-kromosomen. I mer än 99% av cellerna, upptäcka vi använder våra protokoll en korrekt DNA-signal (data ej visade). Jämfört med RNA-FISH, XIST moln visualiserades med användning av den kombinerade DNA-RNA-FISH förfarande ser ibland större, som den denaturerade DNA: t verkar uppta ett större område. Vi har obbehöll liknande resultat med användning av humana ES-celler, humana lymfocyter och diverse fibroblast-cellinjer av olika arter, och samma protokoll har tillämpats för att undersöka genuttryck av olika X-linked loci, inklusive Rnf12. Dessutom, när detta protokoll applicerades på odifferentierad kvinnliga ES-celler, basal Xist expression från både X-kromosomer kunde detekteras, vilket visar att användning av detta protokoll också gener som uttrycks vid låga nivåer kan visualiseras (data visas ej).

Figur 1
Figur 1. Kombinerad DNA-RNA-FISH i differentierade kvinnliga ES-celler. Representativa resultat som erhållits efter den här beskrivna protokollet för kombinerad DNA-RNA FISH. X-kromosomen (X chr.) Detekteras med användning av en digoxigenin-inmärkt BAC sond, som visualiseras med användning av antikroppar konjugerade med FITC (grön skyltal). I nästan varje cell, är två X-kromosomer upptäckts. Xist RNA detekteras med hjälp av en biotin märkt cDNA-sond, som visualiseras med hjälp av antikroppar konjugerade till rodamin (röd signal). Både stora Xist ansamlingar på den inaktiva X-kromosomen (Xist moln) och basal Xist uttryck från den aktiva X-kromosom (Xist prickar) detekteras (notera: vid differentiering denna basala Xist uttryck upphörde framtiden aktiv X-kromosom, och därför inte upptäcks i varje kärna). Kärnor motfärgas med DAPI (blå). Skala stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kombinerad DNA-RNA FISH kan vara tekniskt utmanande, eftersom förhållandena är lämpliga för DNA FISH kan vara för hård för mindre stabila RNA-molekyler. Flera tillvägagångssätt har använts för att studera både DNA och RNA i samma cell, kringgår behovet av samtidig inkubation med sökfragment som detekterar både DNA och RNA. Till exempel, i en överlagring tillvägagångssätt först RNA FISH utfördes och cellerna avbildas, och koordinaterna tas. Därefter tillämpas samma slides användes för DNA-FISH, under vilken signalen av RNA FISH är förlorad. Efter DNA-FISK cellerna åter avbildas, och bilderna som erhålls från både RNA och DNA FISH lagras. Även om denna metod fungerar i nästan alla fall, som DNA av fasta celler är stabil, och påverkas inte av behandling som krävs för initial RNA FISK, är detta en mycket arbetskrävande metod som kommer att kosta minst fyra dagar. I ett annat tillvägagångssätt första RNA FISH utförs, RNA FISH signalen fastställs genom tillsats of fixeringsmedel, varefter DNA FISH tillämpas. Även om också denna metod kan fungera, kan en del av den fluorescerande signalen som härrör från RNA FISH gå förlorad vid fixering. Detta kan i synnerhet hindra detektering av transkript som endast uttrycks vid en låg nivå. Den häri beskrivna arbetssätt är optimerad för samtidig detektion av både ett RNA-mål och ett DNA-mål i en enda FISH experiment och har den fördelen att båda resultat kan erhållas i ett enda experiment inom två dagar, med pålitliga resultat.

Flera steg i FISH protokollet är avgörande för att uppnå optimalt resultat. Först när behandlar RNA-molekyler, bör man vara noga med att inte införa RNAse i någon buffert eller lösning används. Därför bör en ren arbetsmiljö etableras, och filterspetsar bör användas när pipetter reagenser som används för FISH. Försiktighet bör vidtas för att använda RNas-fritt föreningar (t ex RNas-fritt vatten, cellodlingsgrad PBS, absolutaly ren etanol etc). När dessa enkla regler följs, är det i allmänhet inte nödvändigt att använda ytterligare RNAs hämmare kompletteras med reagenser som används. För det andra är det permeabilization proceduren med pepsin en mild balans mellan för lite eller för mycket permeabilization. Beroende på den särskilda celltypen som används, kan det krävas att optimera den tillåtna tiden för permeabilization, eller pepsin koncentrationerna. Det senare beror också på just din sats av pepsin, som aktiviteten kan variera. Som ett alternativ, permeabilization använder 0,1% Triton-X100/PBS för 5 min blir bra resultat på vissa villkor, och har fördelen att FISH använder denna metod för permeabilisering kan kombineras med immunfärgning för att detektera nukleära eller cytoplasmaproteiner. Som en tredje viktig aspekt av FISH bör åldrande, denaturering, hybridisering och tvättemperaturer hållas konstant. Även små avvikelser från målet temperatur kan resultera i mindre efficient denaturering, hybridisering eller mindre stringenta tvättar, vilket resulterar i mer bakgrundsfärgning. Som ett alternativ till den 1 hr åldringssteg vid 65 ° C följt av denaturering vid 65 ° C under 2 min, också en initial denaturering vid 80 ° C under 5 minuter, utan att åldras, kan ge goda resultat. Vi föredrar den åldrande förfarande, som i allmänhet detta förfarande ger mer tillförlitliga DNA FISH signaler. Avslutningsvis kommer vissa DNA-prober vara så specifika, att de inte kommer att kräva tre skikt av antikroppar för tillräcklig detektering. Detta bör empiriskt för varje nyligen genererade sond.

Även om det nuvarande protokollet fungerar robust i studien av X-kromosom inaktivering och påvisande av Xist kombinerat påvisande av RNA och DNA kan vara mer komplicerat i andra inställningar. Detta kan särskilt vara fallet när de RNA-slag, som är riktade för att detekteras endast uttrycks vid mycket låga nivåer, är full av upprepade sekvenser eller är en relativt kortavskrift. I dessa situationer kan det vara ganska svårt att utforma en optimal sond, vilket gör att den effektivt hybridisering till en begränsad, inte optimalt tillgängliga mängden mål. I sådana situationer kan det vara värt att optimera första villkoren för RNA FISH. Flera alternativa sonder kunde försökt, och varaktigheten av sondmärkning av Nick-translation kan titreras, för att optimera mängden ingår haptener. Huvudsakligen bör det kontrolleras att den syftar RNA uttrycks i cellerna som ska undersökas, till exempel genom att verifiera uttryck med RT-PCR. Också när man analyserar en annan typ av celler, är det viktigt att inkludera celler i vilka uttryck har upptäckts som positiva kontroller, eftersom det kan göra det möjligt att skilja mellan en teknisk, FISH relaterade problem, eller den enkla avsaknaden av uttryck i den nya typen av celler analyserades. När trots verified uttryck, användningen av olika prober och optimering av märkningsvillkor, RNA FISH gör not resulterar i en tydlig signal, kan det vara värt att ändra de hybridiseringsbetingelser, genom att variera mängden formamid som används, eller varaktigheten och temperaturen för sond-hybridisering. Alternativt kan direkt märkta oligonukleotidprober användas 9-10. Samma optimeringssteg kan därefter tillämpas för att förbättra DNA-FISH och samtidig detektion av DNA och RNA.

Med hjälp av den kombinerade DNA-RNA-FISH-protokollet, har vi kunnat studera X-kromosom inaktivering för att skilja kvinnliga ES-celler. Liknande resultat har erhållits i våra studier med olika celltyper och embryon, och vi för närvarande ytterligare optimera förutsättningar att tillämpa kombinerade DNA-RNA-FISH på vävnadssnitt. Eftersom den viktiga roll som icke-kodande RNA i många biologiska processer blir mer och mer uppskattad, ser vi att samma protokoll sannolikt kan användas för att studera andra icke-kodande RNA inom ramen för deras specifika kromatin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
  2. Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
  3. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
  4. Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
  5. Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
  6. Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
  7. Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
  8. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  9. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
  10. Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
  11. Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  12. Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
  13. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
  14. John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
  15. Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
  16. Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
  17. Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
  18. Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
  19. Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
  20. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
  21. Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
  22. Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
  23. Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
  25. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
  26. Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
  27. Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
  28. Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
  29. Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
  30. Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
  31. Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
  32. Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  33. Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
  34. Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
  35. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  36. Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
  37. Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
  38. Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  39. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
  40. Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
  41. Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).

Tags

Biokemi Lysrör kombinerad DNA-RNA FISK ES-cell cytogenetik enda cell analys X-kromosom inaktivering (XCI), Bakteriell artificiell kromosom (BAC) DNA-sond,
Kombinerad DNA-RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) för att studera X-kromosom inaktivering i Differentierade Kvinna Mouse embryonala stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined … More

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter