DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em> באתרו</em> הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Summary

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

Abstract

ניאון הכלאה באתרו (FISH) הוא טכניקה מולקולרית המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בתאים. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה ואבחון הסרטן, ויכול לזהות סטיות של הגנום, שלעתים קרובות יש השלכות קליניות חשובות. RNA FISH ניתן להשתמש בם כדי לזהות מולקולות RNA בתאים וספק תובנות חשובות בויסות של ביטוי גנים. שילוב של ה-DNA ודגי RNA בתוך אותו התא הוא מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לDNA FISH עלולים להיות קשים מדי עבור מולקולות שבירות, חד גדילי רנ"א. אנחנו כאן להציג את הפרוטוקול ישים בקלות המאפשר זיהוי המשולב, בו זמני של Xist RNA ו-DNA מקודד על ידי כרומוזומי ה-X. פרוטוקול FISH זה בשילוב ה-DNA-RNA סביר יכול להיות מיושם על מערכות אחרות שבו שניהם RNA ו-DNA צריכים להיות מזוהים.

Introduction

לומדים תאים ורקמות באמצעות ניאון הכלאה באתרו (FISH) יש, מאז השקתו בסוף 1970s ^1, אפשר לחוקרים ללמוד הגנים, ארגון הכרומטין וביטוי גנים ברמת subcellular. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה, karyotyping ^2, אבחון הסרטן ³ וסינון גנטי טרום השרשה ^4, ויש לו תפקיד חשוב במחקר מולקולרי ^5-6 שכן היא מאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בסביבה המקומית שלהם. ניתוח ביטוי תא בודד על ידי RNA FISH יכול לזהות תעתיקים עיקריים יליד וRNAs noncoding להיות עיבד מכרומוזומים, ומציע יתרונות לטכניקות אחרות שלהעריך ביטוי גנים ברמת אוכלוסייה, כולל למשל כמותית RT-PCR, ניתוח הגנום רחב ביטוי או סופג צפון . על ידי הדמיה תעתיקי רנ"א שמקורם ישירות מהאתרים שלהם ממוצא, זה למשל היהשם לב שביטוי גנים הוא סטוכסטיים ^7, ולפעמים יכול להיות אלל מסוים ^8. שיפורים בטכניקה שאפילו הרשו לאיתור וכימות של מולקולות ה-mRNA יחיד בתוך התאים ^9-11.

העיקרון הבסיסי של דגים מורכב מהכלאה של חומצות גרעין בתוך התא לבדיקת חומצות גרעין באמצעות בסיס זיווג ווטסון וקריק מאוד ספציפי. הבדיקה יכולה להיות במישרין או בעקיפין מזוהה, וכתוצאה מכך אות שניתן דמיינו מיקרוסקופי. ניסיונות ראשוניים היו מורכבים מבדיקות שכותרתו רדיואקטיבית, שחסרונות המבוססים על נושאי בטיחות, ברזולוציה מרחבית מוגבלת והיכולת לזהות רק אחד יעד בכל פעם ^12-14. הפיתוח הבא של תוויות nonradioactive, כוללים fluorochromes, haptens, ואנזימים, אפשר שימוש התפשטות הרחב של דגים כטכניקת ביולוגיה מולקולרית שבשגרה. הבדיקה FISH גם יכולה להיות מתויגת באופן ישיר עם fluorochשל רומא על ידי קישור כימי של מולקולות ניאון לחומצות גרעין רצפי ¹⁵ ואינטגרציה של נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently ^16-19, או הבדיקה ניתן דמיינו בעקיפין לאחר אינטגרציה של haptens (כולל ביוטין וdigoxigenin) וזיהוי חיסוני של haptens ידי נוגדנים ספציפיים hapten מצומדת ל כתב ניאון מולקולות ^20-21. הגישה השנייה מאפשרת הגברה אות על ידי שימוש במספר שכבות של נוגדנים שכותרתו fluorescently אשר נמצא בשימוש כדי לשפר את האות המקורי, ומאפשרת זיהוי של מיני RNA אשר באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. על ידי שילוב של טכניקות תיוג ישירות ועקיפות וhaptens השונים, כמה מטרות יכולות להיות דמיינו בו זמנית באותו התא.

אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקולי דגים הוא ההכלאה של החללית ליעד שלו. למרות שבתאוריה, בדיקה תהיה ספציפית להיקשר רק ליעד שלה, הלכה למעשה, הייחוד הזהלא תמיד מושגת, כמו בדיקות עלולות להיקשר לאזורים הומולוגיים, ותנאי הכלאה לא תמיד יהיו אידיאליים למיני אזור DNA או RNA מסוימים. שוטף פוסט הכלאה לכן הם בעלי חשיבות מיוחדת, שכן הם יכולים להגדיל את ההחמרה של הליך הדגים, ויכולים למנוע ספציפי מחייב של בדיקות FISH, אשר יביאו ברמה גבוהה של רעשי רקע. כמולקולות RNA הן חד גדילים הם יכולים בקלות להיות הכלאה לבדיקת FISH. לעומת זאת, מולקולת DNA גדילים הכפולה צריכה ראשונה צעד denaturation, לאחר שבדיקה יכולה להכליא. זו מושגת בדרך כלל על ידי חימום של הדגימה, שתוצאתה denaturation של ה-DNA. עם זאת, בתנאים קשים אלה, מולקולות שבירות, חד גדילי רנ"א עלולות ללכת לאיבוד. לפיכך, ה-DNA-RNA בשילוב הדגים דורש אופטימיזציה משמעותית של התנאים, ויותר מאתגר מבחינה טכנית בהשוואה לזיהוי הנפרד של RNA בלבד או ה-DNA.

כאן אנו presenפרוטוקול מפורט של ת"א בשילוב דגי DNA-RNA, בו זמנית אשר אפשרו לנו ללמוד איון כרומוזום X (xci) בתאי גזע עוברי בעכבר נקבת ^22-24. Xci הוא מנגנון חיוני להתפתחות עוברית אפיגנטיים נשית ^25, ותוצאות בheterochromatinization ומכאן השתקה של אחד משני כרומוזומי X ביחידים נקבת ^26-27. חיוני לתהליך זה הוא RNA Xist noncoding ^28-30, אשר מוסדר על ידי RNF12 ^22-23 וREX1 ²⁴ החלבונים. ביטוי Xist הופך שהוגברו על כרומוזום העתיד לא פעיל X (Xi) במהלך התפתחות עוברית או על התמיינות תאי גזע עובריים במבחנה , ויכול להתפשט לאורך כרומוזום X ובכך למשוך אנזימי הכרומטין שיפוץ אשר תוצאת כיבוי תעתיק של כרומוזום X ^{ביום 31.} זו הפצת Xist RNA ניתן דמיינו ידי RNA FISH כמו ציפוי של כרומו Xמסוים, המכונה גם ענן Xist. מאחר ותאי גזע עובריים נקבה יכולים לאבד את אחד מכרומוזומי X שלהם בשל חוסר יציבות גנומית, אנו ואחרים מועסקים בשילוב ה-DNA-RNA FISH ללמוד xci, כדי לוודא שתאים רק יציבים karyotypically מוערכים בניתוח של תהליך חשוב זה ^{22,32 -34.} כמו עם כל טכניקה מולקולרית ביולוגיה, כמה פרוטוקולים מעולים שונים כבר פורסמו ^35-38. כאן אנו מציגים השיטה שלנו, החל מהגיוס של התמיינות בתאי עכבר גזע עובריים, קיבעון של תאים, תיוג של בדיקות FISH על ידי ניק-תרגום, שלפני טיפול בתאים קבועים כדי לאפשר permeabilization וספיגת בדיקה שלאחר מכן, הכלאה של החללית כדי יעד, ולבסוף זיהוי של הבדיקה על ידי נוגדנים שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול במסמך שהוצג מאפשר גילוי נאמן של Xist RNA וכרומוזום X בתוך תקופה של יומיים, ואת היסודות של טכניקה זו יכול ככל הנראה להיות מותאם לotמערכותיה ותחומי המחקר.

Protocol

1. אינדוקציה של התמיינות בתאי גזע עוברי נקבה כדי לגרום איון כרומוזום X הערה: תאי גזע עובריים בעכבר נקבה (על פי בקשה) גדלים בתנאים בתאי גזע עובריים רגילים על תרבות מנות gelatinized המצופה fibroblasts העכבר העוברי (MEFs). אנחנו כאן להניח שהקורא מכיר…

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול הנ"ל לשילוב דגי DNA-RNA, היינו מסוגל לדמיין איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים ממין נקבה. איור 1 מציג דוגמא מייצגת של ניסוי FISH DNA-RNA, שבו זיהינו את שני Xist (שהוא גלוי כXist RNA ענן שנקרא על כרומוזום X פעיל ולהצביע שעתוק בסיסי על כרומוזום X הפעי…

Discussion

שילוב ה-DNA-RNA FISH יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לדנ"א דגים יכולים להיות קשים מדי עבור מולקולות RNA פחות יציבה. כמה גישות יושמו ללמוד שני DNA ו-RNA באותו התא, לעקוף את הצורך בדגירה בו זמנית עם בדיקות לזיהוי שני DNA ו-RNA. לדוגמא, בגישת חפיפה, דגי RNA הראשונים מתב…

Materials

female mouse embryonic stem cells			will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts			can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore
ES cell culture medium			DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks.
LIF	Chemicon	ESG1107
DMEM	Invitrogen	11960085
Fetal Calf Serum	Invitrogen	10099141
Penicillin–streptomycin (100×)	Invitrogen	15140-122
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140-050
ß-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522
ES cell differentiation medium			IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax	Invitrogen	31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml)	Sigma-Aldrich	A4403
monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
T25 cell culture dishes	Greiner Bio-one	690160
6-well cell culture dishes	Greiner Bio-one	662160
cell culture grade PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS	Gibco	25200-056
falcon tubes	Falcon	352196
24×24 mm coverslips	Menzle	780882
gelatin	Sigma-Aldrich	G1890-100G	prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC
absolute 100%  ethanol	Sigma-Aldrich	32221-2.5L	use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water	Baxter	TKF7114
sterile filter tips	Rainin Bio Clean	GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)	Roche	11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)	Roche	11745824910
Sephadex G50	Sigma-Aldrich	G5080
2 ml syringe	BD Plastipak	300013
sterilized cotton
eppendorf tubes	Eppendorf	30120086
yeast tRNA 10 mg/ml	Invitrogen	15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen	15632-011
mouse cot-1 DNA  1 mg/ml	Invitrogen	18440-016
eppendorf bench top microcentrifuge	Eppendorf	Model 5417R
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	Model 5810R
2M NaAc, pH 5.6	Sigma-Aldrich	S7670
50+ hybridization solution			50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide	Acros organics	3272350000
dextran sulfate	Fluka	31403
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887	prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml
HCL, 37% solution	Fluka	84422
object glasses	Starfrost	8037/1
20x SSC	Invitrogen	AM9763	dilute to 2x SSC in RNAse free water
10 mM Phosphate buffer, pH 7			add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer			70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
2M Tris pH 7.5 solution
Tris-Saline-Tween washing solution (TST)			100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter
10x Saline solution			dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave
Tris-Saline-BSA (TSBSA)			500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x	New England Biolabs	B9001S
sheep-anti-dig antibody	Roche diagnostics		use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody	Roche diagnostics		use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine	Jackson labs		use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-Saline washing solution (TS)			10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
nail-varnish
fluorescent miscroscope