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Biology

DNA-RNA combinado fluorescente Published: June 14, 2014 doi: 10.3791/51628
Automatic Translation
1, 1
1Department of Reproduction and Development, Erasmus MC - University Medical Center

Summary

Hibridização in situ fluorescente (FISH), permite a detecção de ácidos nucleicos no seu ambiente nativo dentro das células. Nós aqui descrever um protocolo para o combinado, a detecção simultânea de RNA e DNA, por meio de FISH, que pode ser usado para estudar inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias.

Abstract

Hibridização in situ fluorescente (FISH) é uma técnica molecular que permite a detecção de ácidos nucleicos em células. PEIXES DNA é frequentemente usado em citogenética e diagnóstico de câncer, e pode detectar aberrações do genoma, que muitas vezes tem importantes implicações clínicas. ARN FISH pode ser utilizado para detectar as moléculas de RNA nas células e proporcionou perspectivas importantes na regulação da expressão do gene. Combinando DNA e RNA FISH dentro da mesma célula é tecnicamente desafiador, como condições adequadas para DNA FISH pode ser muito dura para frágeis, único moléculas de ARN de cadeia. Temos aqui apresentam um protocolo facilmente aplicável, que permite que o conjunto, a detecção simultânea de Xist RNA e DNA codificado pelos cromossomas X. Este protocolo FISH DNA-RNA combinado pode provavelmente ser aplicada a outros sistemas em que tanto o ARN e ADN precisam ser detectado.

Introduction

Estudando as células e tecidos por meio de hibridação in situ fluorescente (FISH) tem, desde a sua introdução no final de 1970 um, permitiu aos pesquisadores estudar genes, organização da cromatina e expressão gênica em nível subcelular. PEIXES DNA é freqüentemente usada em citogenética, cariótipo 2, diagnósticos de câncer 3 e rastreamento genético pré-implantação 4, e tem um papel importante na investigação molecular 5-6, uma vez que permite a detecção de ácidos nucleicos em seu ambiente nativo. Análise de expressão de célula única de RNA FISH pode detectar transcrições primárias nativas e RNAs não-codificantes sendo transcrita de cromossomos, e oferece vantagens a outras técnicas que avaliam a expressão de genes em nível populacional, incluindo, por exemplo, RT-PCR quantitativo, o genoma análise de expressão larga ou Northern blotting . Ao visualizar transcrições de RNA originários diretamente de seus locais de origem, tem sido, por exemplo,notado que a expressão do gene é estocástico 7, e às vezes pode ser alelo específico 8. Melhorias na técnica têm ainda permitiu a detecção e quantificação de moléculas de mRNA de células individuais dentro de 9-11.

O princípio básico de FISH consiste de hibridização de ácidos nucleicos no interior da célula a uma sonda de ácido nucleico, por meio de altamente específica de Watson e Crick emparelhamento de bases. A sonda pode estar directa ou indirectamente detectado, resultando num sinal que pode ser visualizado microscopicamente. As tentativas iniciais consistiam de sondas radioativamente marcados, que tiveram inconvenientes com base em questões de segurança, limitada resolução espacial ea capacidade de detectar um único alvo de cada vez 12-14. O subsequente desenvolvimento de marcadores não radioactivos, incluindo fluorocromos, haptenos e enzimas, permitiu o uso generalizado de FISH como uma técnica de biologia molecular de rotina. A sonda de FISH pode ser diretamente rotulados com fluorochromes por ligação química de moléculas fluorescentes para sequências de ácido nucleico e 15 a integração de nucleótidos marcados com fluorescência 16-19, ou a sonda pode ser indirectamente visualizadas após integração de haptenos (incluindo biotina e digoxigenina) e detecção imunológica de haptenos por anticorpos específicos de hapteno conjugado com repórter fluorescente moléculas 20-21. A última abordagem permite a amplificação do sinal, utilizando várias camadas de anticorpos marcados com fluorescência que são usados ​​para melhorar o sinal original, e permite a detecção de espécies de ARN que são expressos em níveis baixos. Através da combinação de técnicas de rotulagem diretos e indiretos e vários haptenos, vários alvos podem ser visualizadas simultaneamente na mesma célula.

Um dos passos mais importantes protocolos de peixe é a hibridização da sonda ao seu alvo. Embora, em teoria, uma sonda vai ligar especificamente apenas com o seu alvo, na prática, esta especificidadenão é sempre conseguido, como sondas podem ligar-se a regiões homólogas, e as condições de hibridização não será sempre ideal para uma determinada espécie de região de DNA ou de RNA. As lavagens pós-hibridação são, portanto, de particular importância, uma vez que podem aumentar o rigor do procedimento FISH, e pode impedir a ligação não específica de sondas FISH, o que resultaria num elevado nível de ruído de fundo. Como moléculas de ARN são de cadeia simples que pode ser facilmente hibridado com uma sonda de FISH. Em contraste, a molécula de ADN de cadeia dupla deve em primeiro lugar um passo de desnaturação, após o que uma sonda pode hibridizar. Isto é geralmente conseguido por meio de aquecimento da amostra, o que resulta em desnaturação do ADN. No entanto, sob essas condições adversas, frágeis, único moléculas de ARN de cadeia pode ser perdida. Portanto, o ADN-ARN combinados FISH requer optimização significativo das condições, e é tecnicamente mais difícil em comparação com a detecção separada de apenas RNA ou DNA.

Aqui nós apresenta protocolo detalhado do combinado, simultânea FISH DNA-RNA, que nos permitiu estudar inativação do cromossomo X (ICX) na diferenciação de rato fêmea células-tronco embrionárias 22-24. XCI é um mecanismo epigenético crucial para o desenvolvimento embrionário fêmea 25, e os resultados em heterochromatinization e, portanto, o silenciamento de um dos dois cromossomas X em indivíduos do sexo feminino 26-27. Essencial para esse processo é a não-codificante RNA Xist 28-30, que é regulada pelos 24 proteínas RNF12 22-23 e Rex1. Expressão Xist torna-se regulada no futuro cromossomo X inativo (Xi) durante o desenvolvimento embrionário ou a diferenciação de células ES in vitro , e pode se espalhar ao longo do cromossomo X e, assim, atrair cromatina remodelação enzimas que resultam na paralisação da transcrição do cromossomo X 31. Esta propagação de Xist ARN pode ser visualizado por FISH ARN como revestimento de cromo Xalguns, que também é referida como uma nuvem Xist. Como as células ES femininos pode perder um de seus cromossomos X, devido à instabilidade genômica, nós e outros têm utilizado combinado DNA-RNA FISH para estudar XCI, para certificar-se de que as células só cariótipo estáveis ​​são avaliados na análise deste importante processo 22,32 -34. Tal como acontece com todas as técnicas de biologia molecular, vários protocolos diferentes excelentes foram publicados 35-38. Aqui apresenta-se a método, a partir da indução de diferenciação em células ES de ratinho, a fixação das células, a rotulagem de sondas FISH por Nick-translation, pré-tratamento de células fixas para permitir a permeabilização e subsequente absorção de sonda, a hibridação da sonda com o alvo, e, finalmente, a detecção da sonda por meio de anticorpos marcados com fluorescência. O protocolo aqui apresentado permite a detecção fiel de Xist RNA eo cromossomo X, no prazo de dois dias, e os princípios básicos desta técnica pode provavelmente ser adaptado para otseus sistemas e áreas de pesquisa.

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Protocol

1. Indução de Diferenciação no feminino as células estaminais embrionárias para induzir inativação do cromossomo X

NOTA: células-tronco embrionárias de mulher (disponíveis mediante solicitação) são cultivadas em condições normais de células ES em placas de cultura gelatinizadas revestidas com fibroblastos de rato embrionárias (MEFs). Nós aqui assumimos que o leitor está familiarizado com as técnicas de cultura de células normais 39-41. Para induzir a diferenciação de células ES cultivadas em pratos T25 será separada das MEFs, e vai ser plaqueadas em meio de diferenciação.

  1. Remova o meio ES a partir da cultura de células ES, e lavar duas vezes com PBS de cultura de células.
  2. Adicionar 1,5 ml de tripsina-EDTA (pré-aquecido a 37 ° C), e incuba-se as células a 37 ° C durante 7 min. Depois de 3,5 min, agitar o prato delicadamente para quebrar as colônias.
  3. Inactivar a tripsina-EDTA, adicionando 3,5 ml de meio de diferenciação das células. Células de pipeta cima e para baixo para obter uma solução única célula, e recolherem um tubo de 15 ml. Centrifugação durante 5 minutos a 200 xg, e recolher as células em 10 ml de meio de diferenciação.
  4. Adicionar a suspensão de células para um prato de cultura não gelatinizado, e incubar durante 1 hora numa incubadora de cultura de células. NOTA: MEFs serão capazes de aderir à placa de cultura não gelatinizado, enquanto que as células ES irão permanecer em suspensão.
  5. No entanto, adicionar lamelas de vidro esterilizado (24 x 24 mm) em placas de 6 poços, adicionar 0,2% de gelatina, e incubar durante um mínimo de 5 min à temperatura ambiente.
  6. Depois de 1 hora, recolher o sobrenadante da cultura de células ES de pré-banhado, que consistem principalmente de não-aderentes células-tronco embrionárias. Placa células-tronco embrionárias para placas de 6 poços contendo lamínulas. NOTA: Use ⅙ º de um prato confluente T25 por 6 poços de uma placa de 6 poços. Isto irá permitir uma diferenciação bem confluentes depois de 3 dias de diferenciação. Mudança de meio, numa base diária. Para cursos mais longos de tempo diferenciação, placa pré-banhado células-tronco embrionárias em meio de diferenciação em pratos bacterianas e incubcomi num agitador célula integrada na incubadora de cultura de células. Isto irá permitir que as células de modo a formar corpos embrióides, que podem ser plaqueadas a lamelas 1-2 dias antes da fixação.

2. Fixação de células diferenciadas ES para posterior análise FISH DNA-RNA

  1. Remova o meio de diferenciação de culturas de diferenciação, e lavar duas vezes com cultura de células PBS. NOTA: Adicionar PBS com cuidado para evitar que as células serem lavados.
  2. Retirar cultura celular PBS e fixar as células pela adição de 4% de paraformaldeído (PFA) / PBS, e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. CUIDADO: PFA é tóxico e pode causar risco significativo para a saúde ao ser inalado ou em contato com a pele ou olhos. Além disso, PFA é cancerígeno.
  3. Retirar 4% PFA / PBS, e lavar 3x lamelas com etanol a 70%. NOTA: lavagem correta é importante, pois qualquer traço de PFA irá interferir com passos PEIXES subseqüentes. As lamelas podem ser armazenados em etanol a 70% a -20 ° C durante vários meses antes de FAnálise ISH.

3. Rotulagem de DNA Sondas para Experimentos PEIXES

NOTA: obter um fragmento de DNA do gene de interesse (comprimento mínimo> 2 kb de RNA FISH, ou> 20 kb de DNA FISH) ou a BAC cobrindo o gene de interesse. Para a detecção de ARN, uma sonda de menor pode ser suficiente em comparação com a detecção de ADN, uma vez que a transcrição provavelmente irá resultar em múltiplos transcritos, que podem ser detectadas simultaneamente. Para um sinal forte na única cadeia de ADN exemplar, uma sonda não é necessário, para ser capaz de detectar um número suficiente de haptenos incorporadas. De preferência, uma região genómica não transcrita é escolhido para a concepção da sonda de ADN. Além disso, quando se usa uma sonda para detectar o mais pequeno ARN, que vai ser impedido que o locus genómico a partir do qual o ARN é transcrito está a ser detectado na abordagem PEIXES DNA-RNA, combinados, apesar de este não pode ser totalmente excluído. Para detectar rato Xist, foi utilizada uma sonda de cDNA de 5,5 kb. Para detexão do cromossoma X, várias sondas BAC pode ser usado. Bons resultados têm sido obtidos com uma mistura de BAC RP23-100E1 e BAC CT7-474E4, que estão localizados em estreita proximidade com o locus Xist. Dependendo do gene ou cromossomo de interesse, várias sondas diferentes podem ser necessários para obter os melhores resultados. Sempre que trabalhar com materiais que serão utilizados para o RNA-FISH, utilize pontas estéreis filtro, RNAse livre H 2 O, e trabalhar em um ambiente limpo.

  1. Tomar 1 ug de ADN e dilua em H 2 O para um volume total de 16 ul. Adicione 4 mL de solução de etiquetagem digoxigenina ou biotina (ver reagentes), misture por vórtex e incubar a 16 ° C por 90 min. NOTA: A biotina ou nucleotídeos marcados com digoxigenina serão agora incorporadas por nick-translation.
  2. Enquanto isso, prepare colunas G50 para remover nucleotídeos não-integrados. Tomar uma seringa de 2 ml, remover o batedor, e adicionar de algodão esterilizado para dentro da seringa. Adicionar bolas G50 em solução to preenchimento da seringa, seringa colocar num tubo de 15 ml e centrifugar a 642 xg durante 1 min. NOTA: Cerca de 80% da seringa deve agora ser preenchido com G50. Repita quando menos G50 está presente.
  3. Após 90 min, adicionar 40 mL de H2O à mistura de reacção de tradução de nick-, e adicionar a reacção para a coluna G50. Adicionar um tubo vazio na coluna, e centrifugar a 642 xg durante 2 min. Recolhe-se o fluxo através de um tubo de reacção.
  4. Medir o volume do fluxo através de uma pipeta, e adicionar H 2 O para atingir um volume total de 200 ul. Precipitar o fluxo através de adição de 13,3 ul de ADN de esperma de salmão (10 mg / mL), 13,3 mL de tRNA de levedura (10 mg / ml), 26,7 ul de rato Cot-1 DNA (1 mg / ml) e 28 ul de 2 M de NaAc, pH 5.6. Misture em vortex, e adicionar 533 mL de gelo frio etanol 100%. Agitar o tubo, e centrifuga-se a 16.200 xg durante 30 min a 4 ° C.
  5. Retirar o sobrenadante, e lave o peletizado duas vezes com etanol a 70%. Centrifugar a 16.200 xg durante 5 min a4 ° C, e o ar seco do sedimento. Adicionar 50 ul de solução de hibridação de 50, e incuba-se a 37 ° C durante 30 minutos para facilitar a dissolução. NOTA: sonda marcada podem ser armazenadas durante vários anos a -20 ° C. ATENÇÃO: 50 + solução de hibridização contém formamida, que é tóxico, pode irritar a pele, os olhos eo sistema respiratório, e também é um teratogênico.

4. Permeabilização, pré-tratamento e de hibridação de células fixas para Combined DNA-RNA FISH

  1. Rehidratar células fixadas em lamelas, por remoção de etanol a 70% e a adição da cultura de células de PBS para as placas de 6 poços. Incubar durante 5 min. Repita no total de três vezes.
  2. Retirar a cultura de células de PBS, e adicionar 0,2% de pepsina para as placas de 6 poços, para permeabilizar as células. Incubar as placas de 6 poços em um banho de água a 37 ° C durante 4 min. Remover pepsina, e inativar com RNAse livre H 2 O.
  3. Células pós-fixas por incubação com PFA a 4% / PBS durante 5 min à temperatura ambiente. Após FIXAÇÃOem, lavar duas vezes com PBS de cultura de células durante 5 min.
  4. Desidratar as células por incubação com etanol a 70% durante 3 min, 90% de etanol durante 3 minutos e etanol a 100% durante 3 min. Transferência de lamelas de placas de 6 poços e lamelas secos ar por vários minutos.
  5. Idade células por incubação de lamelas a 65 ° C durante 1 hora numa placa de calor.
  6. Pré-sonda hibridizar FISH com rato Cot-1 DNA pela adição de cada lamela para ser analisado, 25 ul de solução de hibridação de 50, 0,5 mL rato Cot-1 DNA, 1 ul de sonda marcada com biotina Xist e 1 ul de digoxigenina sonda BAC rotulado detectar o cromossomo X. Misturar em vortex, e desnaturadas a 99 ° C durante 5 min. Incubar imediatamente a 37 ° C durante 45 minutos, para permitir que Cot-1 DNA que hibridizam para repetir sequências presentes nas sondas.
  7. Após o envelhecimento, manchar 50 ul de tampão de desnaturação (consistindo de 70% tampão fosfato formamide/2x SSC/10 mM) numa lâmina de vidro, e colocar na parte superior com lamelas de células virada towards o tampão de desnaturação. Incubar a 65 ° C durante 2 min.
  8. Adicionar lamelas de volta para placas de 6 poços e as células pós-fix, incubando em gelo frio etanol 70% por 5 min.
  9. Desidratar as células por incubação subsequente em etanol a 70% durante 3 min, 90% de etanol durante 3 minutos e etanol a 100% durante 3 min. Remover lamelas de placas de 6 poços, e deixe secar por alguns minutos.
  10. Manchar sonda pré-hibridizados em uma lâmina de vidro, e incubar lamela por cima. Colocar as lâminas em uma câmara humidificada cheio com 50 ml de 50% formamide/2x SSC, e incubar durante a noite a 37 ° C.

5. Lavagens pós-hibridação e o anticorpo de detecção da sonda mediada

  1. Preencha placas de 6 poços com 2x SSC, e pré-quente até 42 ° C. Adicionar lamelas após incubação durante a noite, e incuba-se a 42 ° C durante 5 min.
  2. Retirar 2x SSC, e incubar lamelas com 50% formamide/2x SSC durante 10 min a 42 ° C. Repetir um total de 3 vezes (30 min de lavagem completamente). Retirar 50% formamide/2x SSC, e lavagem das lâminas com Tris-salino-Tween (TST) em 2 x 5 min à temperatura ambiente.
  3. Mancha 50 ul de Tris-salino-BSA (TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificado.
  4. Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST.
  5. Mancha 50 ul de anticorpo de ovelha anti-DIG (1:500 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o primeiro passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificado.
  6. Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST.
  7. Mancha 50 ul de anticorpo de coelho anti-ovelha conjugado com FITC (1:250 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o segundo passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificada .
  8. Transfer lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST.
  9. Mancha 50 ul de anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com FITC (1:250 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o terceiro passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificada .
  10. Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST.
  11. Mancha 50 ul de rato-anti-biotina anticorpo (1:200 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o quarto passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificado.
  12. Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST.
  13. Mancha 50 ul de anticorpo de burro anti-ratinho conjugado com rodamina (1:250 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o quinto passo de incubação durante 30 min à temperatura ambiente em um chamb escuro TST-humidificadoer.
  14. Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST.
  15. Ponto 50 ul de anticorpo de cabra anti-cavalo conjugado com rodamina (1:250 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o sexto passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente em câmara escura TST-umidificado . NOTA: o anticorpo de cabra anti-cavalo vai reconhecer o anticorpo anti-burro-rato; quando disponível para o pesquisador, um anticorpo de cabra anti-burro vai funcionar tão bem.
  16. Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST. Lavar mais 5 min com Tris-salino (TS).
  17. Desidratar as células por incubação subsequente em etanol a 70% durante 3 min, 90% de etanol durante 3 minutos e etanol a 100% durante 3 min. Remover lamelas de placas de 6 poços, e deixe secar por alguns minutos.
  18. Manchar uma gota de meio de montagem com DAPI (ver reagentes) em uma lâmina de vidro, e adicionar lamela de cabeça para baixo em cima. Selar os slides com esmalte de unha eavaliar os resultados de FISH por microscopia fluorescente (Figura 1).

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Representative Results

Usando o protocolo acima mencionado para combinado ADN-ARN FISH, temos sido capazes de visualizar X inactivação do cromossoma na diferenciação de células estaminais embrionárias fêmeas. Figura 1 mostra um exemplo representativo de uma experiência FISH de ADN-ARN, em que foram detectados tanto Xist (que é visível como uma chamada Xist RNA nuvem no cromossomo X inativo e um pontinho de transcrição basal no cromossomo X ativo), e uma região do cromossomo X, que é visível como um sinal de precisão. Note-se que um dos sinais puntiformes está localizado dentro do Xist nuvem, mostrando, assim, que o Xist nuvem é, de facto, juntamente localizar, e revestindo o cromossoma X. Em mais de 99% das células, que detectam através do nosso protocolo de sinal de ADN correcta (dados não mostrados). Em comparação com o ARN-FISH, XIST nuvens visualizada usando o procedimento FISH DNA-RNA combinado olhar às vezes maior, como o DNA desnaturado parece ocupar uma área maior. Temos obmantido resultados similares utilizando células embrionárias humanas, os linfócitos humanos e várias linhas de células de fibroblasto de diferentes espécies, e o mesmo protocolo foi aplicado para estudar a expressão de genes de vários loci ligada ao cromossoma X, incluindo Rnf12. Além disso, quando o protocolo foi aplicado a mulheres indiferenciado de células ES, a expressão Xist basais de ambos os cromossomas X pode ser detectado, o que mostra que, usando este protocolo também genes expressos em níveis baixos podem ser visualizadas (dados não mostrados).

Figura 1
Figura 1. Combinada ADN-ARN FISH em células ES fêmeas diferenciadas. Resultados representativos obtidos após o protocolo aqui descrito para combinado ADN-ARN FISH. O cromossomo X (X chr.) É detectada através de uma sonda marcada com digoxigenina BAC, que é visualizada utilizando anticorpos conjugados com FITC (sinal verdeai). Em quase todas as células, dois cromossomas X são detectados. Xist RNA é detectado utilizando uma sonda de ADNc marcado biotina, que é visualizada utilizando anticorpos conjugados com rodamina (sinal vermelho). Ambos são detectadas grandes acumulações XIST no cromossomo X inativo (XIST nuvens) e expressão Xist basal do cromossomo X ativo (pontinhos XIST) (nota: na diferenciação esta expressão Xist basal é deixado sobre o futuro cromossomo X ativo e, portanto, não foi detectado em cada núcleo). Os núcleos são contrastado com DAPI (azul). Barra de escala representa 10 mM. Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Discussion

Combinado DNA-RNA FISH pode ser tecnicamente desafiadora, como condições adequadas para DNA FISH pode ser muito dura para moléculas de RNA menos estáveis. Várias abordagens têm sido aplicadas para estudar ambos o ADN e ARN na mesma célula, evitando a necessidade de incubação simultânea com as sondas de detecção, tanto o ADN e ARN. Por exemplo, numa abordagem de sobreposição, primeiro RNA FISH é realizada, e as células são gravadas, e as coordenadas sejam tomadas. Subsequentemente, os mesmos são utilizados para lâminas de ADN FISH, durante o qual o sinal de RNA FISH é perdida. Depois de ADN FISH, as células são novamente fotografadas e as imagens obtidas a partir de RNA e DNA PEIXES são sobrepostos. Embora esta abordagem irá funcionar em quase todos os casos, como o DNA das células fixas é estável, e não é afetada pelo tratamento necessário para FISH RNA inicial, esta é uma abordagem muito trabalhoso, que vai custar pelo menos quatro dias. Numa outra abordagem, o primeiro RNA FISH é realizada, o sinal de FISH ARN é fixado por adição of fixadores, depois que FISH DNA é aplicado. Embora esta abordagem também pode funcionar, uma parte do sinal fluorescente a partir do ARN derivado de peixe pode ser perdida após a fixação. Isto pode dificultar particularmente a detecção de transcritos, que são apenas expressas num nível baixo. A abordagem aqui apresentada é optimizado para a detecção simultânea de um ARN alvo e um alvo de ADN de uma única experiência FISH, e tem a vantagem de que ambos os resultados podem ser obtidos num único ensaio dentro de dois dias, com resultados fiáveis.

Várias etapas do protocolo de FISH são cruciais para a obtenção de melhores resultados. Em primeiro lugar, sempre que lidar com moléculas de RNA, deve-se ter cuidado para não introduzir RNAse em qualquer tampão ou solução utilizada. Assim, um ambiente de trabalho limpo deve ser estabelecido, e pontas com filtro deve ser usado quando os reagentes pipetagem sendo usado para FISH. Cuidados devem ser tomados ao usar RNAse compostos livres (por exemplo RNAse livre água, cultura de células grau PBS, absolutosly etanol puro etc.) Quando estas regras simples são seguidos, geralmente não é necessário o uso de inibidores de RNAse adicionais suplementados aos reagentes usados. Em segundo lugar, o processo de permeabilização usando pepsina é um equilíbrio delicado entre muito pouco, ou muito permeabilização. Dependendo do tipo de células particular utilizada, pode ser necessário para optimizar o tempo permitido para permeabilização, ou as concentrações de pepsina. O último também depende do seu lote particular de pepsina, enquanto a actividade pode variar. Como uma alternativa, a permeabilização usando 0,1% durante 5 min Triton-X100/PBS resulta em bons resultados sob certas condições, e tem a vantagem de que FISH utilizando este método de permeabilização pode ser combinada com a imunocoloração para detectar proteínas nucleares ou citoplasmáticas. Como terceiro aspecto importante da FISH, as temperaturas de envelhecimento, de desnaturação, hibridização e lavagem deve ser mantida constante. Mesmo pequenos desvios da temperatura alvo pode resultar em menos efficient desnaturação, hibridação, ou lavagens menos rigorosas, o que resultará na coloração de fundo mais. Como uma alternativa ao passo de envelhecimento de 1 hora a 65 ° C, seguido de desnaturação a 65 ° C durante 2 min, também uma desnaturação inicial a 80 ° C durante 5 minutos, sem envelhecimento, pode dar bons resultados. Nós preferimos o processo de envelhecimento, como, em geral, esse procedimento dá sinais de FISH DNA mais confiáveis. Por fim, certas sondas de DNA será tão específico, que não requerem três camadas de anticorpos para a detecção suficiente. Isso deve ser testado empiricamente para cada sonda recém-gerado.

Embora o protocolo de corrente funciona de forma robusta no estudo de inactivação do cromossoma X e de detecção de Xist, detecção combinada de ARN e ADN pode ser mais complicado em outras configurações. Isto pode ser especialmente o caso quando as espécies de ARN, que é destinado a ser detectado é apenas expresso em níveis muito baixos, é cheia de sequências de repetição ou é um período relativamente curtotranscrição. Nestas situações, pode ser bastante difícil de projetar uma sonda ideal, o que permitirá que a hibridização eficiente a um número limitado montante disponível, não ideal de alvo. Em tais situações, pode valer a pena otimizar primeiras condições para a RNA FISH. Várias sondas alternativas poderiam ser julgados, eo tempo de rotulagem sonda por Nick-tradução poderia ser titulada, para otimizar a quantidade de haptenos incorporadas. Mais importante, deve-se verificar que o RNA que visa é expresso nas células a ser investigado, por exemplo para verificar a expressão por RT-PCR. Além disso, quando a análise de um tipo diferente de células, é essencial incluir as células em que a expressão tenha sido previamente detectados como controlos positivos, uma vez que pode permitir que a distinção entre um, FISH relacionada problema técnico, ou a simples ausência de expressão no tipo novo de células analisadas. Quando, apesar da expressão verificada, o uso de várias sondas e otimização das condições de rotulagem, RNA FISH faz not em resultado de um sinal claro, pode valer a pena a mudança das condições de hibridação, por variação da quantidade de formamida utilizada, ou a duração e a temperatura de hibridação da sonda. Alternativamente, as sondas oligonucleotídicas marcadas directamente pode ser usado 9-10. Os mesmos passos de optimização pode posteriormente ser aplicado para melhorar a FISH de ADN, e a detecção simultânea de DNA e RNA.

Usando o protocolo de FISH de DNA-RNA combinado, que foram capazes de estudar a inactivação do cromossoma X na diferenciação de células ES do sexo feminino. Resultados semelhantes foram obtidos em nossos estudos usando diferentes tipos de células e embriões, e atualmente estamos otimizando ainda mais as condições para aplicar combinado FISH DNA-RNA em cortes de tecido. Como o papel importante de RNAs não-codificantes em muitos processos biológicos torna-se mais e mais apreciada, prevemos que o mesmo protocolo pode provavelmente ser utilizada para estudar outras RNAs não-codificantes, no contexto da sua cromatina específico.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
female mouse embryonic stem cells will be made available upon request
mouse embryonic fibroblasts can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g. Millipore
ES cell culture medium DMEM, 15% fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM γ-mercaptoethanol, and 1,000 U/ml LIF. Filter sterilize and store at 4 °C for maximum of 2 weeks.
LIF Chemicon ESG1107
DMEM Invitrogen 11960085
Fetal Calf Serum Invitrogen 10099141
Penicillin–streptomycin (100x) Invitrogen 15140-122
Non-essential aminoacids Invitrogen 11140-050
γ-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M7522
ES cell differentiation medium IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated fetal calf serum, 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/L monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid
IMDM-Glutamax Invitrogen 31980-030
Ascorbic acid (50 mg/ml) Sigma-Aldrich A4403
monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145
T25 cell culture dishes Greiner Bio-one 690160
6-well cell culture dishes Greiner Bio-one 662160
cell culture grade PBS Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS Gibco 25200-056
Falcon tubes Falcon 352196
24 x 24 mm coverslips Menzle 780882
gelatin Sigma-Aldrich G1890-100G prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave
Pepsin Sigma-Aldrich P7000 Dilute to 0.2% in 0.01 M HCl (pH 2.0)
absolute 100% ethanol Sigma-Aldrich 32221-2.5L use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions
RNAse free water Baxter TKF7114
sterile filter tips Rainin Bio Clean GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) Roche 11745816910
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) Roche 11745824910
Sephadex G50 Sigma-Aldrich G5080
2 ml syringe BD Plastipak 300013
sterilized cotton
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086
yeast tRNA 10 mg/ml Invitrogen 15401-029
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml Invitrogen 15632-011
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml Invitrogen 18440-016
Eppendorf bench top microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Eppendorf refrigerated centrifuge Eppendorf Model 5810R
2 M NaAc, pH 5.6 Sigma-Aldrich S7670
50+ hybridization solution 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7
formamide Acros organics 3272350000
dextran sulfate Fluka 31403
10 mM phosphate buffer, pH 7 add 57.7 ml of 1 M Na2HPO4 and 42.3 ml 1 M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave
denaturation buffer 70% formamide/2x SSC/10 mM phosphate buffer pH 7
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287
2 M Tris pH 7.5 solution
Tris-saline-Tween washing solution (TST) 100 ml 10x saline, 50 ml 2M Tris, 500 μl Tween-20, add RNAse free water till 1 L
10x saline solution dissolve 85 g NaCl in 1 L RNAse free H2O, and autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA) 500 μl 10x saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3.25 ml RNAse free H2O
BSA, purified, 100x New England Biolabs B9001S
sheep-anti-dig antibody Roche diagnostics use 1:500 diluted in TSBSA
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
mouse-anti-biotin antibody Roche diagnostics use 1:200 diluted in TSBSA
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine Jackson labs use 1:250 diluted in TSBSA
Tris-saline washing solution (TS) 10 ml 10x saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O
Vectashield mounting medium with DAPI Vectorlabs H-1200
nail varnish
fluorescent miscroscope

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References

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Bioquímica Edição 88 Fluorescente DNA-RNA combinado FISH célula ES citogenética a análise de uma única célula inativação do cromossomo X (ICX), DNA-sonda,
DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias
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Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined … More

Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (88), e51628, doi:10.3791/51628 (2014).

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