Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) muliggør påvisning af nukleinsyrer i deres native miljø i cellerne. Vi her beskrive en protokol for den kombinerede, samtidig påvisning af RNA og DNA ved hjælp af fisk, som kan bruges til at studere X-kromosom inaktivering i muse embryonale stamceller.
Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) er en molekylær teknik, som muliggør påvisning af nukleinsyrer i celler. DNA FISH anvendes ofte i cytogenetik og kræftdiagnostik og kan påvise aberrationer af genomet, som ofte har vigtige kliniske konsekvenser. RNA FISH kan anvendes til påvisning af RNA-molekyler i celler og har givet vigtig indsigt i reguleringen af genekspression. Ved at kombinere DNA og RNA fisk inden for den samme celle er teknisk udfordrende, da betingelser egnet til DNA FISH kan være for barsk for skrøbelige, enkeltstrengede RNA-molekyler. Vi her præsentere en let anvendelig protokol, som gør det muligt for kombineret, samtidig påvisning af Xist RNA og DNA kodet med X-kromosomer. Denne kombinerede DNA-RNA-FISH protokol kan sandsynligvis anvendes i andre systemer, hvor både RNA og DNA, der skal detekteres.
Studere celler og væv ved hjælp af fluorescerende in situ hybridisering (FISH) har, siden den blev indført i slutningen af 1970'erne 1, tillod forskerne at studere gener, kromatin organisation og genekspression på subcelleniveauet. DNA FISH anvendes ofte i cytogenetik, karyotyping 2, kræftdiagnostik 3 og præ-implantation genetisk screening 4, og har en vigtig rolle i molekylær forskning 5-6, da det giver mulighed for påvisning af nukleinsyrer i deres eget miljø. Single analyse celleekspression af RNA FISH kan opdage indfødte primære udskrifter og noncoding RNA bliver transskriberet fra kromosomer, og giver fordele til andre teknikker, som vurderer genekspression på populationen, herunder for eksempel kvantitativ RT-PCR, genom bred udtryk analyse eller Northern blotting . Ved at visualisere RNA afskrifter oprindelse direkte fra deres websteder oprindelseslande, har det for eksempel væretbemærket, at genekspression er stokastisk 7 og kan undertiden være allelspecifik 8. Forbedringer i teknik har endda tilladt detektion og kvantificering af enkelt mRNA molekyler i cellerne 9-11.
Det grundlæggende princip i FISH består af hybridisering af nukleinsyrer i cellen til en nukleinsyre-probe ved hjælp af meget specifik Watson og Crick baseparring. Proben kan enten være direkte eller indirekte registreret, hvilket resulterer i et signal, som kan visualiseres mikroskopisk. Indledende forsøg bestod af radioaktivt mærkede prober, som havde ulemper baseret på sikkerhedsspørgsmål, begrænset rumlig opløsning og evnen til at opdage kun ét mål ad gangen 12-14. Den senere udvikling af ikke-radioaktive mærker, herunder fluorokromer, haptener og enzymer, har gjort udbredt brug af fisk som en rutinemæssig molekylærbiologisk teknik. FISH-proben kan enten være direkte mærket med fluorochRomes ved kemisk kobling af fluorescerende molekyler nukleinsyresekvenser 15 og integration af fluorescensmærkede nukleotider 16-19 eller proben indirekte kan visualiseres efter integration af haptener (herunder biotin og digoxigenin) samt immunologisk påvisning af haptener af hapten-specifikke antistoffer konjugeret til fluorescerende reportermolekyler 20-21. Sidstnævnte fremgangsmåde giver signalforstærkning ved hjælp af flere lag af fluorescens-mærkede antistoffer, som anvendes til at forbedre det oprindelige signal, og muliggør detektering af RNA-arter, der er udtrykt ved lave niveauer. Ved at kombinere direkte og indirekte teknikker mærkningskrav og forskellige haptener, kan flere mål samtidigt visualiseres i samme celle.
Et af de vigtigste skridt i fisk protokoller er hybridisering af proben til sit mål. Selv om der i teorien vil en sonde specifikt binder kun til sit mål i praksis denne specificiteter ikke altid opnås, som prober kan binde til homologe regioner og hybridiseringsbetingelser vil ikke altid være ideel for en bestemt DNA-region eller RNA-arter. Post-hybridisering vasker er derfor af særlig betydning, da de kan øge stringensen i FISH proceduren, og kan forhindre uspecifik binding af fisk sonder, hvilket ville resultere i et højt niveau af baggrundsstøj. Da RNA molekyler enkelt er strandet de let kan hybridiseret til en FISH sonde. I modsætning hertil dobbeltstrenget DNA-molekyle skal først et denatureringstrin, hvorefter en probe kan hybridisere. Dette opnås sædvanligvis ved opvarmning af prøven, hvilket resulterer i denaturering af DNA'et. Men under disse hårde betingelser, skrøbelige, enkeltstrengede RNA-molekyler kan gå tabt. Derfor kombineret DNA-RNA FISH kræver betydelige optimering af betingelserne, og er mere teknisk udfordrende i forhold til den separate påvisning af kun RNA eller DNA.
Her præsentation vita detaljeret protokol af kombineret, samtidig DNA-RNA fisk, som har givet os mulighed for at studere X-kromosom inaktivering (XCI) differentiere hunmus embryonale stamceller 22-24. XCI er en afgørende epigenetisk mekanisme for kvindelige fosterudvikling 25 og resulterer i heterochromatinization og dermed undertrykkelse af en af de to X-kromosomer i kvindelige individer 26-27. Afgørende for denne proces er noncoding RNA Xist 28-30, som er reguleret af RNF12 22-23 og REX1 24 proteiner. Xist udtryk bliver opreguleret den fremtidige inaktive X-kromosom (Xi) under fosterudviklingen eller på ES-celle differentiering in vitro og kan spredes langs X-kromosom og dermed tiltrække chromatin remodeling enzymer, der resulterer i den transkriptionelle lukning af X-kromosomet 31. Denne spredning af Xist RNA kan visualiseres ved RNA FISH som et overtræk af X chromonogle, som også betegnes som en Xist sky. Da kvindelige ES-celler kan miste en af deres X-kromosomer på grund genomisk instabilitet, har vi og andre ansat kombinerede DNA-RNA FISH at studere XCI, for at sikre, at kun karyotypiske stabile celler vurderes i analysen af denne vigtige proces 22,32 -34. Som med enhver molekylærbiologisk teknik, har flere forskellige gode protokoller blevet offentliggjort 35-38. Her præsenterer vi vores metode, startende fra induktion af differentiering i muse ES-celler, fiksering af celler, mærkning af fisk sonder af Nick-oversættelse, forbehandling af faste celler til at tillade permeabilisering og efterfølgende sonde optagelse, hybridisering af sonden til mål, og endelig påvisning af proben ved fluorescensmærkede antistoffer. Den her præsenterede protokol tillader den trofaste detektion af Xist RNA og X-kromosom inden for en frist på to dage, og det grundlæggende i denne teknik kan sandsynligvis tilpasses til othendes systemer og forskningsområder.
Kombineret DNA-RNA FISH kan være teknisk udfordrende, da betingelser egnet til DNA FISH kan være for barsk for mindre stabile RNA-molekyler. Adskillige fremgangsmåder er blevet anvendt til at undersøge både DNA og RNA i den samme celle, omgår behovet for samtidig inkubation med prober påvisning både DNA og RNA. For eksempel i en overlejring fremgangsmåde er første RNA-FISH udført, og cellerne afbildes, og koordinaterne er taget. Efterfølgende samme objektglas anvendt til DNA-FISH, hvor signalet i RNA FISH er…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.
female mouse embryonic stem cells | will be made available upon request | ||
mouse embryonic fibroblasts | can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore | ||
ES cell culture medium | DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks. | ||
LIF | Chemicon | ESG1107 | |
DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10099141 | |
Penicillin–streptomycin (100×) | Invitrogen | 15140-122 | |
Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140-050 | |
ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
ES cell differentiation medium | IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid | ||
IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
Ascorbic acid (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
T25 cell culture dishes | Greiner Bio-one | 690160 | |
6-well cell culture dishes | Greiner Bio-one | 662160 | |
cell culture grade PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
falcon tubes | Falcon | 352196 | |
24×24 mm coverslips | Menzle | 780882 | |
gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC |
absolute 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions |
RNAse free water | Baxter | TKF7114 | |
sterile filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) | Roche | 11745816910 | |
biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) | Roche | 11745824910 | |
Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
2 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
sterilized cotton | |||
eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | |
yeast tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
mouse cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
eppendorf bench top microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
2M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
50+ hybridization solution | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7 | ||
formamide | Acros organics | 3272350000 | |
dextran sulfate | Fluka | 31403 | |
pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml |
HCL, 37% solution | Fluka | 84422 | |
object glasses | Starfrost | 8037/1 | |
20x SSC | Invitrogen | AM9763 | dilute to 2x SSC in RNAse free water |
10 mM Phosphate buffer, pH 7 | add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave | ||
denaturation buffer | 70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7 | ||
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
2M Tris pH 7.5 solution | |||
Tris-Saline-Tween washing solution (TST) | 100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter | ||
10x Saline solution | dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave | ||
Tris-Saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O | ||
BSA, purified, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
sheep-anti-dig antibody | Roche diagnostics | use 1:500 diluted in TSBSA | |
rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
mouse-anti-biotin antibody | Roche diagnostics | use 1:200 diluted in TSBSA | |
donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
Tris-Saline washing solution (TS) | 10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O | ||
Vectashield mounting medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
nail-varnish | |||
fluorescent miscroscope |