Mesure automatisée du flux sanguin Microcirculatory vitesse dans métastases pulmonaire des rats

Protocol

NOTE: Toutes les procédures liées aux animaux décrits dans le présent protocole ont été préalablement approuvé par le soin et l'utilisation institutionnelle animaux Comité Duke University (DUIACUC).

1. Culture cellulaire et cancer Injection

1. Cultiver des cellules cancéreuses métastatiques marquées par fluorescence (par exemple des cellules de cancer du sein MDAMB231-GFP humaines, don du Dr. Patricia Steeg, NCI, et les cellules de sarcome de la souris YFP-étiquetés, don du Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Département de radio-oncologie) dans un milieu de culture approprié (milieu de Eagle modifié par exemple par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline / streptavidine) à 37 ° C jusqu'à environ 90% de confluence.
2. Trypsiniser cellules, les laver deux fois avec du PBS, compter, et ensuite les injecter dans les veines de la queue de 10 semaines vieux rats nus féminins de l'isoflurane anesthésiés à 5 millions de cellules par animal, en utilisant une seringue avec une aiguille 27 G. Anesthes niveau chirurgicalesia est vérifiée par l'absence de réaction de pincement de l'orteil.

2. Suivi des métastases Utilisation microCT

1. Examiner les rats une fois par semaine en utilisant un micro-CT / micro-irradiateur, pour détecter la présence de métastases au-dessus d'environ 2 mm de diamètre de diamètre. Le micro-CT est commandé comme décrit précédemment ^12.
   1. Rats soumis à 3% d'isoflurane anesthésie préalable à l'imagerie. Confirmez anesthésie profonde par pincement de l'orteil.
   2. Après le début de l'anesthésie, transférer rapidement des rats au berceau de l'imagerie dans la chambre de l'imagerie et de se connecter via un nez cône à un mélange isoflurane-air à 2,5-3%. Ajuster la position du rat dans le berceau de façon que son thorax est positionné dans le faisceau de photons de la microCT scanner, en utilisant les commandes de position externes et délimiteur de laser sur le support de formation d'image. Se assurer que la porte de la chambre d'imagerie est fermé, pour protéger l'enquêteur des rayons gamma.
   3. Contrôler la position de l'animal en utilisant à nouveaula caméra vidéo couleur. Effectuez une basse résolution test d'imagerie CT terme, et d'utiliser l'image résultante pour régler le champ de vision aux dimensions xyz de la cavité thoracique.
   4. Image du thorax de rat en utilisant un filtre 2 mm Al à 40 kV, 2,5 mA, et 0,008 voxel au 7 FPS et le réexpédier vers sa cage. Imagerie d'un animal devrait prendre pas plus de 15 ou 20 min. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal.
   5. Confirmez métastases par l'apparition d'objets relativement radio-opaque qui ne peut être expliqué par des vaisseaux sanguins intrathoraciques (figure 1A)

Chirurgie 3. Chambre Fenêtre

1. Anesthésie, les signes vitaux et veine de la queue cathétérisme
   1. Sélectionnez animaux avec la présence de la maladie métastatique. Injecter animal avec un d intrapéritonéaleose de 50 mg / kg de pentobarbital. Confirmez niveau anesthésie chirurgicale par pincement de l'orteil avant de procéder.
      Note: protocoles d'anesthésie doivent être adaptées à la configuration expérimentale respective. Pentobarbital a été choisi ici comme un anesthésique à action prolongée, afin d'induire anesthésie profonde pendant de longues procédures, tout en offrant la possibilité de re-dosage facile. Toutefois, la perte d'animaux à un surdosage est un problème commun avec anesthésie au pentobarbital. Une autre option qui préserve réflexes autonomes à un degré plus grand que le pentobarbital est la kétamine en combinaison avec des sédatifs tels que la xylazine ou médétomidine, qui permet cependant uniquement pour un cycle de ré-dosage unique.
   2. Raser les animaux sur le côté du corps qui a la maladie métastatique, et dans la région du cou en utilisant une tondeuse. Essuyer tout en restant cheveux dénoués de la peau. Après les cheveux dénoués est retirée, appliquer une pommade vétérinaire pour les yeux, pour les empêcher de se dessécher.
      REMARQUE: rats nus athymiques peuvent avoir les cheveux résiduel qui requiélimination res avant de procéder à des interventions chirurgicales. Il est très important d'enlever tous les cheveux soigneusement, car il peut interférer avec les procédures chirurgicales et d'imagerie.
   3. Fixer l'animal dans une position couchée sur une plaque métallique qui est placé sur un coussin chauffant l'eau C 37 ° distribué. Les extrémités avant et arrière sont fixés sur la plaque avec du ruban adhésif.
      NOTE: Il est utile de contrôler et d'enregistrer les signes vitaux, tels que la fréquence cardiaque et l'oxygénation artérielle du sang en utilisant un oxymètre de pouls, tout au long des procédures chirurgicales et expérimentales.
2. Intubation trachéale
   1. Afin de placer un cathéter pour la ventilation de l'animal, d'abord faire une incision transversale du col de la peau, suivie de la séparation médiane ventrale de la musculature longitudinale de la trachée.
   2. L'utilisation répétée des mesures ouverture à la fermeture avec une forte pince pour créer un passage pour le fil de suture à travers la face dorsale de la trachée.
   3. Faire une petite incision dans la trachée sur til face ventrale, pas plus que semi-circulaire, approximativement entre le deuxième et le troisième anneau trachéal. Laisser un temps suffisamment long portion de la trachée exposée sur la face dorsale, afin de permettre la fixation de la sonde trachéale.
   4. Insérez un mm "Y" canule trachéale de 2,5 à 3,0 dans la trachée, et serrer avec une suture 4-0 monofilament. Se assurer que la canule est reliée à un ventilateur de pression cyclée avec une bouteille reliée au conduit d'expiration qui est rempli de 6 cm d'eau, pour maintenir la pression pulmonaire positive. Flot de gaz devrait être de 100% d'oxygène, à moins expérimentalement souhaité autrement.
   5. Insérer un cathéter avec une aiguille de 25 à 27 G, et rempli de solution saline héparinée dans l'une des veines de la queue du rat, et fixer en place avec du ruban adhésif.
      REMARQUE: Veiller à la perméabilité du cathéter veine de la queue toute la procédure en injectant plusieurs reprises une petite quantité de sérum physiologique hépariné dans la veine de la queue. En outre, l'intubation oro-trachéale, ce est à dire la direction d'un trachéaletube par la bouche de l'animal anesthésié et au-delà du larynx dans la trachée, est une alternative possible à la procédure de trachéotomie qui est décrit ici. Cependant, cette méthode nécessite une formation spéciale et de l'expérience, pour éviter d'endommager la trachée, et aussi pour empêcher l'cathétérisme accidentelle de l'œsophage.
3. Application de la fenêtre pulmonaire
   1. Retirer la peau du côté de la poitrine où se trouve la maladie métastatique, en créant une incision, puis détacher la peau en utilisant une dissection mousse.
      Remarque: La peau peut être excisé et retiré après détachement
   2. Passez en disséquant les deux couches de muscles recouvrant (pectoral, dentelé et grand dorsal), mais en laissant les muscles intercostaux intacte. Créer une perforation dans la cavité thoracique d'environ 1,5 cm de diamètre, en enlevant des parties de typiquement deux nervures adjacentes. Idéalement, localiser la perforation dans la région de la sixième et de la septième ribs.
   3. Ostéotomie:
      1. Pour minimiser les saignements et les dommages à la surface du poumon, tenir fermement la nervure à couper avec une pince chirurgicale dentées pendant la coupe. Avec des ciseaux chirurgicaux, couper la partie médiane de la première nervure, à un angle d'environ 45 °, laissant le côté pointu de l'os de côte reste pointant extérieur.
      2. Par la suite, couper la face latérale de l'os de la nervure d'une manière similaire, en laissant à nouveau la partie pointue de l'os de la nervure dirigée vers l'extérieur, pour éviter d'endommager la surface du poumon.
      3. Répétez la procédure pour la nervure adjacente, puis couper les muscles intercostaux et retirer la pièce excisée. Pendant cette procédure, maintenir la pression de poumon de façon que l'interaction mécanique entre la surface du poumon et la cage thoracique est minimisée. Pour ce faire, en régulant la pression appropriée de l'inspiration sur le ventilateur.
   4. Insertion de la fenêtre:
      1. Insérer une fenêtre de poumon sur mesure, composé d'une lamelle qui estrelié à une prise en plexiglas (figure 1B). Fixer la fenêtre à la douille par collage, ou par l'application d'une très petite quantité de graisse à vide. Insérez la fenêtre de façon que les métastases de surface sont situés à proximité du centre de la fenêtre. Si nécessaire, ajuster le trou inséré pour amener le micrométastases au centre de la fenêtre en agrandissant légèrement le trou sur le côté respectif.
         REMARQUE: maladie métastatique sur la surface pleurale peut être identifié en tant que points blancs clairement reconnaissables ou des zones à l'intérieur des parties autrement à rose saumon couleur saines de la surface du poumon qui apparaissent principalement le long des fissures. Bien micrométastases peuvent se produire sur d'autres secteurs de l'extérieur pleural, les lignées cellulaires étudiées présentent presque toujours surfaçage micrométastases dans la zone perforée, une fois que la maladie métastatique peut être radiologiquement détecté.
      2. Après l'insertion de la douille dans la perforation, et la création d'un contact direct avec la plèvre viscérale de la lUng, suturer les bords du cadre de la fenêtre au muscle intercostal environnant, en utilisant 4,0 suture monofilament (figure 1C). Utilisez une légère augmentation de la pression de l'inspiration sur le ventilateur pour aider air résiduel de se échapper et pour créer un joint.
         Note: Le taux de rats de la respiration peut varier considérablement, en fonction du statut de l'anesthésie, état ​​d'excitation ou d'anxiété, concentration en oxygène de l'air inspiré _(FiO2), etc. Il est recommandé de régler le taux de respiration entre 70 et 90 bpm. La pression de l'inspiration devrait être réglé avec prudence et ne pas être réglé à plus de env. 8 cm H ₂ O (0,6 mm de Hg), pour éviter d'endommager la surface du poumon.
   5. Placer l'animal dans un dispositif de retenue conçu sur mesure qui est conçu pour éliminer le mouvement dans la direction Z (figure 1D) sur une plaque d'acier qui est positionné sur une thermostatique (électricité) couverture chauffante, sous un microscope à fluorescence. Contrôler le corps de l'animalla température rectale à l'aide d'une thermistance. Ajuster les vis du dispositif de retenue d'animal, et la pression d'inspiration sur le ventilateur pour obtenir un contrôle optimal de mouvement latéral.
      Remarque: la respiration naturelle chez les mammifères implique tous les trois directions de mouvement du poumon et l'extension de la poitrine:, dorso-ventral et cranio-caudale bilatérale. Afin de préserver le mouvement de la respiration naturelle autant que possible, il est important de minimiser la compression dans la direction Z dans la mesure nécessaire. Parce que l'appuie-Z-dimensionnelle a le potentiel d'introduire des artefacts qui peuvent affecter la circulation sanguine et d'autres paramètres, il est conseillé de garder conditions constante pendant série de mesures répétées chez le même animal.

4. imagerie et mesure du débit sanguin Microcirculatory

1. Recueillir les globules rouges par ponction cardiaque et les étiqueter avec Dil (1,1-3,3,3 -dioctadecyl = = perchlorate, 3 =-tétraméthyl indocarbocyanine), comme décrit précédemment <sup> 10.
2. Injecter 300 ul de globules rouges marqués dans la veine caudale du rat avant l'opération de la chambre de fenêtre est fait, pour éviter les effets première passe d'adhérence à la vitre en verre. Éliminer les bulles d'air dans la seringue ou un cathéter, que l'introduction de l'air dans la veine va inhiber d'autres injections.
3. Image du flux sanguin avec une caméra CCD de microscope à -40 ° C puce température de refroidissement, et d'environ 100X résolution globale (ce est à dire avec un objectif de microscope 10X, 10X et pré-caméra oculaire). Utilisez standards jeux de filtres rhodamine / TRITC (excitation 450-490 nm, émission> 515 nm). Enregistrer le taux de trame et pixel résolution réelle des séquences d'images qui en résultent. Marquer au moins 200 (idéalement environ 300) images par pile, afin d'assurer une analyse réussie de la vitesse d'écoulement.
4. Reconstituer la perte de fluide dans l'animal en injectant environ 1 ml de solution saline ip chaque h.
   REMARQUE: Les paramètres expérimentaux qui impliquent une intervention, par exempleun médicament qui modifie la vitesse d'écoulement du sang dans une métastase de cancer pulmonaire, nécessite des mesures répétées de la vitesse d'écoulement du sang dans le cancer métastatique pulmonaire. Pour ces expériences étendues, il est important de reconstituer l'animal avec suffisamment de liquide.
5. Euthanasier les animaux en perfusion de 3 ml de 3N KCl dans la veine de la queue
6. Évaluer les piles d'images en utilisant un, disponible publiquement algorithme publié ordinateur basé sur Matlab qui créera flux niveaux de gris de la vitesse et des cartes de couleur codé pour tous les flux de traces de sang ^10,11. Évaluer la suite les images en niveaux de gris résultant en utilisant un logiciel d'analyse d'image commerciale ou accessibles au public, tels que Image J, après un seuil hors des valeurs qui indiquent aucun mouvement de globules, ce est à dire pas de système vasculaire active.

Representative Results

La vascularisation dans les tumeurs solides est connu pour différer considérablement de l'approvisionnement en sang normale, montrant de plus grands degrés de tortuosité et les distances intervasculaires plus élevés ^13. En conséquence, les pistes de la circulation sanguine dans le cancer du sein et de métastases pulmonaires sarcome expérimentales ont des formes irrégulières et de grandes lacunes intervasculaires (figure 2A, deux panneaux inférieurs) par rapport à la microcirculation pulmonaire normale (figure 2A, panneau supérieur). Dans une étude précédente, la capacité de la méthode de la fenêtre pulmonaire a été démontrée pour effectuer des mesures automatiques de variations de la vitesse d'écoulement du sang dans les poumons normaux ^10. Afin de déterminer si la méthode de la fenêtre pulmonaire peut également mesurer une augmentation de la vitesse d'écoulement du sang dans les métastases pulmonaires, la combinaison de médicaments de l'éphédrine médicament sympathomimétique et le bloqueur ambrisentan de l'endothéline qui a été trouvé récemment pour augmenter la circulation microvasculaire dans les poumons sains,a été appliqué ici (données en cours d'examen ailleurs). Dans cette étude, la capacité du procédé est représenté à détecter une augmentation de la vitesse d'écoulement du sang dans les métastases pulmonaires de sarcome de souris, provoquée par administration de la combinaison de l'éphédrine (20 mg / kg) et la ambrisentan antagoniste des récepteurs de l'endothéline (0,5 mg / kg, les deux médicaments par voie intraperitoneale, Figure 2B). Chaque point de données représente les moyennes individuelles groupées de trois mesures avec des intervalles de cinq minutes, en moyenne sur les données acquises dans cinq animaux. La première injection de façon significative (p <0,01) la vitesse d'augmentation du flux sanguin dans la région de la tumeur à partir de 0,61 ± 0,12 mm / s à 0,74 ± 0,19, alors que la seconde injection a maintenu la vitesse d'écoulement élevée à 0,74 ± 0,19 mm / s (). La seconde injection n'a provoqué aucune augmentation supplémentaire de la vitesse d'écoulement du sang. N = 5, toutes les statistiques: mesures répétées ANOVA.

(A) Image Procédure pour préparer un rat métastases pulmonaires-palier pour l'imagerie par microscopie en temps réel microCT d'un palier de rat métastases pulmonaires (flèche) (B) du cadre de fenêtre pulmonaire (C) Rat avec perforation de la paroi thoracique et fenêtre pulmonaire: la figure 1... (E) Rat avec la chambre de la fenêtre et le dispositif de retenue sous le microscope de fluorescence attachés. (D) dispositif de Retenir pour limiter le mouvement de la poitrine de Z-directionnelle.. Remarque: le panneau C et E montrent les cheveux portant rats Sprague-Dawley, pas athymiques rats nus.

Figure 2: Quantification de l'augmentation de la circulation sanguine de métastases pulmonaires. (A) direction d'écoulement du sang et de la vitesse à une normalepoumon, et une métastase de cancer de MDAMB-231 et le sarcome de la souris. La colonne de gauche contient des tirs instantanés de la série d'images de microscopie de fluorescence. Alvéoles peut être identifié dans le cadre du modèle de fluorescence de fond dans les poumons normaux (panneau supérieur). Les métastases peuvent être localisés par la fluorescence provoquée par des protéines présentant une fluorescence endogène des cellules cancéreuses injectées (ligne en pointillés). Colonnes à droite:. Cartes couleur codée de direction de l'écoulement de sang (de couleur mobile indicateur marque la direction vers laquelle les cellules se écoulent) et vitesse d'écoulement, mesurée en mm / seconde (B) Les changements dans la circulation sanguine de la microcirculation après l'injection répétée de l'éphédrine combinés et ambrisentan (20 et 0,1 mg / kg par injection). Une augmentation significative de la vitesse d'écoulement global (mesures répétées ANOVA, p <0,01) a été observée après la première injection, mais pas après le deuxième (n = 5).

Discussion

On présente un modèle qui est possible à l'évolution de l'image dans le débit sanguin microcirculatoire et d'autres processus dynamiques dans des métastases pulmonaires de rat, en utilisant la microscopie intravitale et l'analyse de la circulation sanguine calcul. Alors que d'autres méthodes existent pour effectuer la microscopie sur les poumons exposés en cages thoraciques ouvertes de rongeurs, ce modèle est également le premier à l'image des métastases pulmonaires par une perforation de la paroi thoracique dans un cadre fermé poitrine. En utilisant ce procédé, la possibilité est représentée sur le plan pharmacologique pour mesurer les changements induits dans le flux sanguin microcirculatoire des métastases pulmonaires.

Deux méthodes de base existent à l'image les poumons des rongeurs vivants qui sont perfusées par la circulation sanguine spontanée, par contact direct avec la surface du poumon: les modèles à thorax ouvert éliminer le problème de mouvement constant du poumon dû à l'activité respiratoire et cardiaque en appliquant une fenêtre d'aspiration à la surface du poumon, tout en permettant au reste du complexe cardio-pulmonaire à expet et le contrat dans un ^7,14 de la cavité de la poitrine ouverte. Bien que ce procédé offre un excellent accès expérimentale, les conditions thoraciques ouvertes et la fenêtre d'aspiration introduire des artefacts par rapport aux conditions d'un poumon intact ^8. Alternativement, les procédures à thorax fermé qui laissent la cage thoracique en grande partie intacte portent la promesse de préserver les conditions d'origine dans la cavité thoracique intacte, comme l'influence mutuelle de mouvement cardiaque et pulmonaire sur le débit dynamique de l'autre de sang. Ces modèles comportent généralement un cadre avec une fenêtre qui est suturé à la paroi thoracique ^15, ou une membrane transparente qui est amené en contact direct avec la surface du poumon pour éviter le dessèchement du tissu ^neuf. La difficulté de négocier le mouvement cardio pour accueillir et de permettre l'imagerie microscopique est un défi technique majeur des procédures à thorax fermé, et probablement responsable de la faible spread global de cette technique. Dans notre cas, la combinaison deun cadre de fenêtre de maintien solide et un dispositif de retenue dans la direction Z se est avéré efficace pour éliminer suffisamment le mouvement latéral du poumon automatisés pour permettre des mesures de débit sanguin de la circulation pulmonaire dans une fenêtre ¹⁰ à thorax fermé.

Une méthode courante pour mesurer la vitesse de intravitale piles d'images de microscopie d'écoulement du sang est l'utilisation d'correspondance spatiale des modèles de flux de sang dans les images successives d'un segment donné ¹⁴ vasculaire. Afin de réduire l'effort de temps associée à l'analyse des vaisseaux sanguins simples, un algorithme de formation d'image d'écoulement sanguin a été introduit qui produit des cartes de vitesse d'écoulement du sang de la totalité du champ optique ^11. Outre le gain de temps, ce procédé permet également l'analyse spatiale simultanée de la circulation sanguine dans tout le champ optique, quelle que soit la morphologie vasculaire ou des points de ramification. Ceci est particulièrement important lorsque l'on étudie le micro-environnement de la tumeur, où de multiples vaisseaux sanguins CONTRIBute à l'état d'alimentation d'une zone de tumeur donnée ^13,16,17. En effet, la tortuosité connu de la vascularisation de la tumeur et l'existence de grandes lacunes intervasculaires peut être clairement vu dans les deux types métastatiques de cancer qui ont été étudiés, (figure 2A). Procédé de fenêtre pulmonaire a également été testé pour sa capacité à rendre compte des changements dans la vitesse d'écoulement du sang dans la lésion métastatique, en mesurant l'effet d'un traitement pharmacologique qui a été trouvé récemment pour augmenter la vitesse d'écoulement du sang dans la circulation pulmonaire: l'éphédrine médicament hypertensive augmente le débit cardiaque, alors que le récepteur de l'endothéline ambrisentan bloqueur réduit le tonus artériolaire pré-capillaire, ce qui entraîne, lorsque les médicaments sont administrés en combinaison, une augmentation de la vitesse d'écoulement du sang dans les capillaires pulmonaires. Bien que ces données sont en cours d'examen ailleurs, la capacité de la combinaison d'un médicament hypertenseur et un antagoniste des récepteurs de l'endothéline pour augmenter musculaire périphériqueperfusion a été publié indépendamment ^18. Alors que dans des conditions normales, une augmentation dose-dépendante de la vitesse d'écoulement de sang peut être observée après deux injections, le fait que la seconde injection ne conduit pas à une augmentation supplémentaire de la vitesse d'écoulement dans les métastases de sarcome pourrait résulter du fait que les vaisseaux tumoraux maximale vasodilatation a déjà été atteint après la première injection combiné de l'éphédrine et de l'ambrisentan.

Les limitations suivantes se appliquent à la technique présentée ici: Ce protocole est applicable à des rats (et théoriquement, de mammifères de taille semblable) d'environ 180 à 300 g ou plus. Petits mammifères tels que les souris, il faudra modification spéciale pour accueillir l'anatomie plus fragile et la physiologie de la cage thoracique. La résolution spatiale maximale qui peut être atteinte avec la technique présentée est théoriquement limitée que par l'ouverture numérique de l'objectif et l'épaisseur de la lamelle qui est utilisé (~ 0.08 à 0,1 um dans les marques standards), aux objectifs 100X, avec l'utilisation d'immersion dans l'huile. Dans la pratique cependant, le mouvement reste du poumon pourrait limiter l'utilisation des objectifs de haute résolution au-delà de 20X. Si tout mouvement autonome du poumon est éliminée, la résolution temporelle de la technique est limitée uniquement par la fréquence d'images de la caméra, et la force du signal du marqueur fluorescent, qui détermine le temps d'exposition, à environ 100 images par seconde. Les restrictions supplémentaires suivantes se appliquent à la technique présentée: d'une part, la mise microscopique et de calcul actuelle ne permet l'analyse de la surface d'une métastase donné. L'utilisation de la microscopie à la profondeur de pénétration, tels que les stratégies de pointe d'imagerie de microscopie confocale, à l'avenir peut permettre la mesure de la vitesse d'écoulement du sang en trois dimensions. En outre, la technique présentée ne peut pas, dans sa forme actuelle, être utilisé pour visualiser les lésions de plus à l'intérieur du parenchyme pulmonaire. En troisième lieu, l'insertion d'un glafenêtre ss en contact direct avec des vaisseaux sanguins actifs a un certain potentiel de perturber la circulation microvasculaire par lui-même, par l'intermédiaire de compression spatiale des vaisseaux sanguins, ou en ayant un impact température locorégionale. En quatrième lieu, l'utilisation d'un ventilateur externe et une pression positive dans les poumons a également un potentiel pour modifier le débit sanguin microcirculatoire pulmonaire. De plus, des zones limitées de la cage thoracique sont pratiquement accessibles pour les procédures chirurgicales décrites, relativement simples. Autres zones de la surface du poumon, tels que l'accès médial-ventrale ou dorsale exigeraient techniques chirurgicales plus complexes, avec des perturbations profondes de la biomécanique de la cage thoracique. En raison de l'absence d'alternatives à la microscopie imagerie pour étudier le flux sanguin microcirculatoire, les faits marquants on peut se attendre dans un proche avenir pour surmonter ces obstacles et d'étudier les tumeurs malignes à résolution temporelle-spatiale élevée dans toutes les parties du poumon de rongeur.

En résumé, un procédé est presented pour mesurer des motifs et des changements dans, la vitesse du flux sanguin microvasculaire dans les métastases de surface du poumon de rat. La combinaison d'un à thorax fermé modèle chirurgical aigu avec une méthode automatisée de mesure de la vitesse d'écoulement du sang dans tout le champ optique microscopique, cette technique offre préservation relative de l'environnement physiologique du poumon, est capable de détecter des changements dans la vitesse du flux sanguin microcirculatoire générale et l'orientation et est relativement facile à utiliser. On peut se attendre que cette technique sera d'une grande utilité à tous les groupes qui étudient la microcirculation de métastases pulmonaires et d'autres processus dynamiques dans ce cadre de la maladie dans des modèles de rongeurs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope