Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी पशु संबंधित प्रक्रियाओं पहले से ड्यूक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (DUIACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. कैंसर सेल संस्कृति और इंजेक्शन
- Fluorescently लेबल मेटास्टेटिक कैंसर की कोशिकाओं को खेती (जैसे मानव MDAMB231-GFP के स्तन कैंसर की कोशिकाओं, डॉ पेट्रीसिया Steeg, NCI, और YFP लेबल माउस सार्कोमा कोशिकाओं, डॉ डेविड Kirsch, ड्यूक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर, विकिरण ऑन्कोलॉजी विभाग से उपहार से उपहार) उचित संस्कृति के माध्यम में (जैसे Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / streptavidin के साथ (DMEM)) 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 90% मिला हुआ है जब तक।
- , कोशिकाओं Trypsinize पीबीएस के साथ उन्हें दो बार धोने, गिनती, और फिर एक 27 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर, पशु प्रति 5 मिलियन कोशिकाओं पर isoflurane-anesthetized 10 सप्ताह पुरानी महिला नग्न चूहों की पूंछ नसों में उन्हें इंजेक्षन। सर्जिकल स्तर anesthesआइए पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी से सत्यापित है।
Metastases का प्रयोग microCT 2. निगरानी
- मेटास्टेसिस व्यास में व्यास में ऊपर लगभग 2 मिमी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए, एक माइक्रो सीटी / माइक्रो Irradiator का उपयोग कर एक सप्ताह में एक बार चूहों की जाँच करें। पहले से 12 के रूप में वर्णित सूक्ष्म सीटी कमीशन है।
- इमेजिंग के लिए पहले 3% isoflurane संज्ञाहरण के अधीन रहते हुए चूहों। पैर के अंगूठे चुटकी से गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
- संज्ञाहरण के शुरू होने के बाद, जल्दी से इमेजिंग कक्ष में इमेजिंग पालने के लिए चूहों को हस्तांतरण और 2.5-3% से कम एक isoflurane हवा में मिश्रण करने के लिए एक नाक शंकु के माध्यम से कनेक्ट। इमेजिंग पालने पर बाहरी स्थिति नियंत्रण और लेजर सीमांकक का उपयोग करते हुए, अपनी छाती microCT स्कैनर की फोटॉन बीम में तैनात है कि एक तरह से पालने में चूहे की स्थिति को समायोजित करें। गामा किरणों से अन्वेषक ढाल, इमेजिंग कक्ष का दरवाजा बंद कर दिया है सुनिश्चित करें।
- फिर से उपयोग करते हुए जानवर की स्थिति नियंत्रणरंग वीडियो कैमरा। एक कम संकल्प सीटी इमेजिंग परीक्षण चलाने के प्रदर्शन, और वक्ष गुहा के xyz आयामों को देखने के क्षेत्र को समायोजित करने के परिणामस्वरूप छवि का उपयोग करें।
- छवि चूहा 40 केवीपी में 2 मिमी अल फिल्टर का उपयोग छाती, 2.5 एमए, और 7 एफपीएस में 0.008 voxel और उसके पिंजरे में पशु लौटने। एक जानवर की इमेजिंग नहीं अधिक से अधिक 15 या 20 मिनट के लिए ले जाना चाहिए। पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है कि एक जानवर वापस नहीं करते। यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक पहुंच के बाहर एक जानवर मत छोड़ो।
- Intrathoracic रक्त वाहिकाओं से नहीं समझाया जा सकता है कि अपेक्षाकृत रेडियो अपारदर्शी वस्तुओं की उपस्थिति द्वारा मेटास्टेसिस पुष्टि (चित्रा 1 ए)
3. विंडो चैंबर सर्जरी
- संज्ञाहरण, महत्वपूर्ण संकेत है और पूंछ नस कैथीटेराइजेशन
- Metastatic रोग की उपस्थिति के साथ जानवरों का चयन करें। एक intraperitoneal डी के साथ पशु इंजेक्षन50 मिलीग्राम / किग्रा pentobarbital की ose। आगे बढ़ने से पहले पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा शल्य-स्तर संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
नोट: संज्ञाहरण प्रोटोकॉल संबंधित प्रयोगात्मक सेटअप के अनुरूप होना चाहिए। सतही फिर से खुराक के विकल्प की पेशकश करते हुए pentobarbital, लंबी प्रक्रिया के लिए गहरी संज्ञाहरण प्रेरित करने के क्रम में, एक लंबे समय से अभिनय संवेदनाहारी यहाँ के रूप में चुना गया था। हालांकि, overdosing के लिए जानवरों के नुकसान pentobarbital संज्ञाहरण के साथ एक आम समस्या है। Pentobarbital तुलना में एक बड़ा डिग्री करने के लिए स्वायत्त सजगता को बरकरार रखता है कि एक अन्य विकल्प ऐसे हालांकि केवल एक ही फिर से dosing चक्र के लिए परमिट जो xylazine या medetomidine, के रूप में बनी रहती साथ संयोजन में ketamine है। - एक क्लिपर का उपयोग कर, metastatic रोग है, और गर्दन क्षेत्र में है कि शरीर की तरफ जानवरों दाढ़ी। त्वचा से सभी शेष खुले बाल से साफ कर लें। खुले बाल हटा दिया है, के बाद बाहर सुखाने से उन्हें रोकने के लिए, आंखों के लिए पशु चिकित्सा मरहम लागू होते हैं।
नोट: Athymic नग्न चूहों requi कि अवशिष्ट बाल हो सकता हैसर्जिकल प्रक्रियाओं के साथ आगे बढ़ने से पहले रिस हटाने। यह शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि यह अच्छी तरह से सभी बाल हटाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। - एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी परिचालित हीटिंग पैड पर रखा गया है कि एक धातु की थाली पर एक लापरवाह स्थिति में पशु को ठीक करें। आगे और हिंदुस्तान के छोरों टेप के साथ थाली पर तय कर रहे हैं।
नोट: यह नियंत्रण और शल्य चिकित्सा और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दौरान, एक पल्स oximeter का उपयोग करके इस तरह के दिल की दर और धमनी रक्त oxygenation के रूप में महत्वपूर्ण लक्षण, रिकॉर्ड करने के लिए उपयोगी है।
- Metastatic रोग की उपस्थिति के साथ जानवरों का चयन करें। एक intraperitoneal डी के साथ पशु इंजेक्षन50 मिलीग्राम / किग्रा pentobarbital की ose। आगे बढ़ने से पहले पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा शल्य-स्तर संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
- सांस की नली इंटुबैषेण
- श्वासनली को अनुदैर्ध्य मांसलता उदर की औसत जुदाई के बाद आड़ा ग्रीवा त्वचा चीरा, पहला, पशु की सुनवाई के लिए एक कैथेटर जगह बनाने के लिए आदेश में।
- श्वासनली के पृष्ठीय पक्ष के माध्यम से सिवनी के लिए एक मार्ग बनाने के लिए एक तेज संदंश के साथ दोहराया उद्घाटन करने वाली समापन कार्रवाई का प्रयोग करें।
- टी पर श्वासनली में एक छोटा सा चीरावह उदर पक्ष, लगभग दूसरे और तीसरे सांस की नली अंगूठी के बीच, अर्द्ध परिपत्र नहीं की तुलना में अधिक है। सांस की नली कैथेटर के निर्धारण सक्षम करने के लिए, पृष्ठीय सतह पर उजागर श्वासनली की एक पर्याप्त लंबे हिस्से को छोड़ दें।
- श्वासनली में एक 2.5-3.0 मिमी "वाई" सांस की नली प्रवेशनी डालें, और 4-0 monofilament सीवन के साथ कस लें। सकारात्मक फेफड़े दबाव बनाए रखने के लिए, प्रवेशनी पानी के 6 सेमी से भर जाता है कि समाप्ति वाहिनी से जुड़ा एक बोतल के साथ एक दबाव साइकिल वेंटीलेटर से जुड़ा है सुनिश्चित करें। प्रयोगात्मक अन्यथा वांछित जब तक शाखा गैस, 100% ऑक्सीजन होना चाहिए।
- एक 25-27 जी सुई के साथ एक कैथेटर डालें, और चूहे की पूंछ नसों में से एक में heparinized खारा से भरा है, और टेप के साथ जगह में तय कर लो।
नोट: बार-बार पूंछ नस में heparinized खारा की एक छोटी राशि इंजेक्शन द्वारा प्रक्रिया के दौरान पूंछ नस कैथेटर की प्रत्यक्षता सुनिश्चित करें। इसके अलावा, ओरो-सांस की नली इंटुबैषेण, एक सांस की नली के मार्गदर्शन अर्थात्संवेदनाहृत पशु के मुंह के माध्यम से और श्वासनली में गला पिछले ट्यूब, यहाँ वर्णित है कि ट्रेकिआटमी प्रक्रिया के लिए एक संभावित विकल्प है। हालांकि, इस पद्धति श्वासनली को होने वाले नुकसान से बचने के लिए, और भी घेघा की आकस्मिक केन्युलेशन रोकना करने के लिए, विशेष प्रशिक्षण और अनुभव की आवश्यकता है।
- फेफड़े के खिड़की के आवेदन
- कुंद विच्छेदन का उपयोग कर त्वचा को निकाल तो एक चीरा बनाने, और से, metastatic रोग जहां स्थित है छाती की तरफ से त्वचा निकालें।
नोट: त्वचा excised और सेना की टुकड़ी के बाद हटाया जा सकता है - Overlaying मांसलता (वक्षपेशी, serratus, और latissimus dorsi) की दो परतों विदारक, लेकिन बरकरार पसलियों के बीच मांसपेशियों को छोड़ कर आगे बढ़ें। आम तौर पर दो आसन्न पसलियों के कुछ भागों को हटाने के द्वारा, व्यास में लगभग 1.5 सेमी की छाती गुहा में एक छिद्र बनाएँ। आदर्श रूप में, छठे और सातवें आर के क्षेत्र में छिद्र का पता लगानेIBS।
- Osteotomy:
- फेफड़ों की सतह के लिए खून बह रहा है और नुकसान को कम करने के लिए, कसकर काटने के दौरान एक दांतेदार शल्य चिकित्सा संदंश के साथ कटौती करने की पसली पकड़। शल्य कैंची का प्रयोग, बाहर इशारा करते हुए शेष पसली की हड्डी की उठाई पक्ष छोड़ रहा है, लगभग 45 डिग्री के कोण पर, पहली पसली की औसत दर्जे का पक्ष काटा।
- इसके बाद, फिर से फेफड़ों की सतह को नुकसान को रोकने के लिए, बाहर की ओर इशारा करते हुए पसली की हड्डी की उठाई पक्ष छोड़ रहा है, एक समान तरीके से पसली की हड्डी के पार्श्व पक्ष काटा।
- तो पसलियों के बीच मांसपेशियों में कटौती और excised टुकड़ा निकालने के लिए, आसन्न पसली के लिए प्रक्रिया को दोहराएं। इस प्रक्रिया के दौरान, फेफड़ों की सतह और रिब पिंजरे के बीच यांत्रिक बातचीत कम से कम है कि एक तरह से फेफड़ों दबाव बनाए रखें। उचित रूप से वेंटीलेटर पर प्रेरणा के दबाव को विनियमित करने से यह मत करो।
- खिड़की की प्रविष्टि:
- है कि एक coverglass से मिलकर, एक कस्टम बनाया फेफड़ों खिड़की डालेंएक Plexiglas सॉकेट (चित्रा 1 बी) से जुड़ी। , Gluing द्वारा या वैक्यूम तेल की एक बहुत छोटी राशि लागू करने के द्वारा सॉकेट में विंडो संलग्न। सतह मेटास्टेसिस बंद खिड़की के केंद्र में स्थित हैं कि एक तरह से खिड़की डालें। यदि आवश्यक हो, संबंधित पक्ष को थोड़ा छेद विस्तार से खिड़की के केंद्र के लिए micrometastasis लाने के लिए डाला छेद समायोजित करें।
नोट: फुफ्फुस सतह पर metastatic रोग दरारें के साथ मुख्य रूप से दिखाई देते हैं कि फेफड़ों के सतह की अन्यथा गुलाबी-टू-सामन रंग का स्वस्थ भागों के भीतर स्पष्ट रूप से स्वीकार करने योग्य सफेद डॉट्स या क्षेत्रों के रूप में पहचाना जा सकता है। Micrometastases फुफ्फुस बाहरी के अन्य क्षेत्रों पर भी हो सकती है, जबकि जांच सेल लाइनों लगभग हमेशा metastatic रोग radiologically पता लगाया जा सकता है एक बार, छिद्रित क्षेत्र में micrometastases सरफेसिंग प्रदर्शित करते हैं। - वेध में सॉकेट डालने, और एल के आंत फुस्फुस का आवरण के साथ सीधा संपर्क बनाने के बादUng, 4.0 monofilament सिवनी (चित्रा 1C) का उपयोग करते हुए, आसपास के पसलियों के बीच पेशी के लिए खिड़की के फ्रेम के किनारों सीवन। बचने के लिए और एक मुहर बनाने के लिए अवशिष्ट हवा मदद करने के लिए वेंटीलेटर पर प्रेरणा दबाव का एक मामूली वृद्धि का प्रयोग करें।
नोट: चूहों के श्वसन दर यह 70 और 90 धड़कन प्रति मिनट के बीच श्वसन दर को समायोजित करने के लिए recommendable है आदि संज्ञाहरण, उत्साह या चिंता की स्थिति, प्रेरित हवा की ऑक्सीजन एकाग्रता (FIO 2), की स्थिति पर निर्भर करता है, बहुत भिन्न हो सकते हैं। प्रेरणा दबाव सावधानी के साथ समायोजित किया जाना चाहिए और नहीं लगभग अधिक से अधिक करने के लिए सेट किया जाना है। 8 सेमी एच 2 ओ (0.6 एमएमएचजी), फेफड़ों की सतह को नुकसान से बचने के लिए।
- है कि एक coverglass से मिलकर, एक कस्टम बनाया फेफड़ों खिड़की डालेंएक Plexiglas सॉकेट (चित्रा 1 बी) से जुड़ी। , Gluing द्वारा या वैक्यूम तेल की एक बहुत छोटी राशि लागू करने के द्वारा सॉकेट में विंडो संलग्न। सतह मेटास्टेसिस बंद खिड़की के केंद्र में स्थित हैं कि एक तरह से खिड़की डालें। यदि आवश्यक हो, संबंधित पक्ष को थोड़ा छेद विस्तार से खिड़की के केंद्र के लिए micrometastasis लाने के लिए डाला छेद समायोजित करें।
- एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे, एक थर्मास्टाटिक (इलेक्ट्रिकल) हीटिंग कंबल पर तैनात है कि एक स्टील प्लेट पर जेड दिशात्मक आंदोलन (चित्रा -1) को खत्म करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि एक कस्टम डिजाइन restrainer में पशु स्थिति। जानवर के शरीर पर नियंत्रणएक गुदा thermistor का उपयोग कर तापमान। पशु restrainer का शिकंजा समायोजित करें, और वेंटीलेटर पर प्रेरणा दबाव पार्श्व आंदोलन का इष्टतम नियंत्रण हासिल करने के लिए।
नोट: द्विपक्षीय, Dorso-उदर, और cranio-दुम: स्तनधारियों में प्राकृतिक श्वास फेफड़ों के आंदोलन और सीने में विस्तार के सभी तीन दिशाओं शामिल है। जितना संभव हो प्राकृतिक सांस लेने आंदोलन को संरक्षित करने के लिए, यह आवश्यक हद तक जेड दिशात्मक संपीड़न कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। जेड आयामी संयम रक्त प्रवाह और अन्य मानकों को प्रभावित कर सकता है कि कलाकृतियों को पेश करने की क्षमता है, क्योंकि यह एक ही जानवर में दोहराया माप की श्रृंखला के दौरान लगातार शर्तों रखने की सलाह दी जाती है।
- कुंद विच्छेदन का उपयोग कर त्वचा को निकाल तो एक चीरा बनाने, और से, metastatic रोग जहां स्थित है छाती की तरफ से त्वचा निकालें।
4. इमेजिंग और मापन microcirculatory रक्त के प्रवाह की
- कार्डियक पंचर के माध्यम से लाल रक्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने और पहले से वर्णित के रूप में, DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, = 3 -tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) के साथ उन्हें लेबल <समर्थन> 10।
- खिड़की कक्ष सर्जरी से किया जाता है इससे पहले कि कांच की खिड़की को पहले पास आसंजन प्रभाव से बचने के लिए, चूहे की पूंछ नस में से लेबल लाल रक्त कोशिकाओं के 300 μl इंजेक्षन। नस में हवा की शुरूआत के किसी भी आगे इंजेक्शन रोकना होगा, सिरिंज या कैथेटर में किसी भी हवाई बुलबुले को खत्म।
- छवि रक्त तापमान ठंडा -40 डिग्री सेल्सियस चिप पर एक माइक्रोस्कोप सीसीडी कैमरा के साथ प्रवाह, और लगभग 100X समग्र संकल्प (एक 10X खुर्दबीन उद्देश्य के साथ यानी, और 10X पूर्व कैमरा आंख का)। मानक Rhodamine / TRITC फिल्टर सेट (उत्तेजना 450-490 एनएम, उत्सर्जन> 515 एनएम) का प्रयोग करें। जिसके परिणामस्वरूप छवि दृश्यों की वास्तविक फ्रेम दर और पिक्सेल संकल्प रिकार्ड। स्टैक प्रति रिकॉर्ड कम से कम 200 (आदर्श के आसपास 300) छवियों, प्रवाह वेग के सफल विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए।
- खारा आईपी के लगभग 1 मिलीलीटर हर घंटा इंजेक्शन द्वारा पशु में द्रव नुकसान की भरपाई होगी।
नोट: एक हस्तक्षेप शामिल है कि प्रायोगिक सेटिंग, जैसेएक फेफड़े के कैंसर मेटास्टेसिस में रक्त प्रवाह वेग को संशोधित करने वाली एक दवा, फेफड़े के मेटास्टेटिक कैंसर में रक्त प्रवाह वेग के दोहराया माप की आवश्यकता है। इन बढ़ाया प्रयोगों के लिए, यह पर्याप्त तरल पदार्थ के साथ जानवर की भरपाई करने के लिए महत्वपूर्ण है। - पूंछ नस में 3N KCl की 3 मिलीलीटर के अर्क से जानवरों Euthanize
- सभी रक्त प्रवाह के लिए प्रवाह वेग स्केल और रंग इनकोडिंग नक्शे 10,11 निशान पैदा करेगा कि एक प्रकाशित, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध Matlab आधारित कंप्यूटर कलन विधि का उपयोग छवि के ढेर का मूल्यांकन। बाद में, रक्त कोशिकाओं का कोई आंदोलन से संकेत मिलता है कि कोई सक्रिय वाहिका संरचना यानी कि मूल्यों को बंद thresholding के बाद, ऐसी छवि जम्मू के रूप में वाणिज्यिक या सार्वजनिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जिसके परिणामस्वरूप स्केल छवियों का मूल्यांकन।
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Representative Results
ठोस ट्यूमर में vasculature को टेढ़ा-मेढ़ापन का अधिक से अधिक डिग्री, और उच्च intervascular दूरी 13 दिखा रहा है, सामान्य रक्त की आपूर्ति से काफी अलग करने के लिए जाना जाता है। सामान्य फेफड़े के microcirculation में (2A चित्रा, ऊपरी पैनल) की तुलना में जब तदनुसार, प्रयोगात्मक फेफड़े के स्तन कैंसर और सार्कोमा मेटास्टेसिस में रक्त के प्रवाह को पटरियों अनियमित आकार और बड़े intervascular अंतराल (2A चित्रा, कम दो पैनलों) है। पिछले एक अध्ययन में, फेफड़े खिड़की विधि की क्षमता सामान्य फेफड़ों 10 में रक्त प्रवाह वेग में परिवर्तन का स्वचालित माप प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन किया गया। फेफड़े के खिड़की विधि भी फेफड़े के मेटास्टेसिस में रक्त प्रवाह वेग में वृद्धि के उपाय कर सकते हैं कि क्या जांच करने के लिए आदेश में, sympathomimetic दवा इफेड्रिन और हाल ही में स्वस्थ फेफड़ों में microvascular परिसंचरण को बढ़ाने के लिए पाया गया है कि endothelin अवरोधक ambrisentan की दवा संयोजन,(कहीं और समीक्षा के तहत डाटा) यहाँ लागू किया गया था। इस अध्ययन में, विधि की क्षमता इफेड्रिन के संयोजन के साथ खुराक की वजह से माउस सार्कोमा, के फेफड़े मेटास्टेसिस में रक्त प्रवाह वेग में वृद्धि (20 मिलीग्राम / किग्रा) और endothelin रिसेप्टर प्रतिपक्षी ambrisentan (0.5 मिलीग्राम / पता लगाने के लिए दिखाया गया है किलो, intraperitoneally दोनों दवाओं, चित्रा 2 बी)। हर डेटा बिंदु पांच मिनट के अंतराल के साथ तीन माप की जमा व्यक्ति के औसत का प्रतिनिधित्व करता है, पांच पशुओं में प्राप्त डेटा पर औसतन। दूसरा इंजेक्शन 0.74 ± 0.19 मिमी / सेकंड में ऊंचा प्रवाह वेग को बनाए रखा है, जबकि पहले इंजेक्शन काफी (पी <0.01), 0.74 ± 0.19 के लिए 0.61 ± 0.12 मिमी / सेकंड से ट्यूमर क्षेत्र में रक्त के प्रवाह वेग में वृद्धि हुई है ()। दूसरा इंजेक्शन रक्त प्रवाह वेग में किसी भी आगे बढ़ाने के प्रकाश में लाना नहीं था। एन = 5, सभी आँकड़े: दोहराया उपायों एनोवा।
चित्रा 1:। एक चूहे असर फेफड़ों मेटास्टेसिस (तीर) का जीना माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए एक फेफड़ों मेटास्टेसिस असर चूहा तैयार करने के लिए प्रक्रिया (ए) microCT छवि (बी) के पल्मोनरी खिड़की के फ्रेम छाती दीवार वेध और फेफड़े के खिड़की के साथ (सी) चूहा।। संलग्न। जेड दिशात्मक छाती आंदोलन को सीमित करने के लिए (डी) निरोधक उपकरण। प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे (ई) खिड़की कक्ष के साथ चूहा और निरोधक उपकरण। नोट: पैनल सी और Sprague Dawley चूहों असर ई शो बाल, नग्न चूहों athymic नहीं।
चित्रा 2: फेफड़े के मेटास्टेसिस के रक्त के प्रवाह में वृद्धि की मात्रा। एक सामान्य (क) में रक्त के प्रवाह की दिशा और वेगफेफड़े, और MDAMB-231 और माउस सार्कोमा से एक कैंसर मेटास्टेसिस। बाईं ओर स्तंभ प्रतिदीप्ति micrographs की छवि श्रृंखला से तस्वीर शॉट शामिल हैं। Alveolae सामान्य फेफड़ों में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पैटर्न (ऊपरी पैनल) के हिस्से के रूप में पहचान की जा सकती है। मेटास्टेसिस इंजेक्शन के कैंसर की कोशिकाओं (धराशायी लाइन) की अंतर्जात fluorescing प्रोटीन की वजह से प्रतिदीप्ति द्वारा स्थित किया जा सकता है। सही करने के लिए कॉलम:। रंग-इनकोडिंग रक्त प्रवाह दिशा के नक्शे (रंग सूचक पहिया कोशिकाओं जो प्रवाह की दिशा में दिशा अंक) और प्रवाह वेग, मिमी में मापा जाता है / दूसरे (बी) के संयुक्त इफेड्रिन के दोहराया इंजेक्शन के बाद microcirculatory रक्त प्रवाह में परिवर्तन और ambrisentan (20 और 0.1 मिलीग्राम प्रति इंजेक्शन / किग्रा)। समग्र प्रवाह वेग में एक महत्वपूर्ण वृद्धि (दोहराया उपायों एनोवा, पी <0.01) पहले इंजेक्शन के बाद मनाया गया था, लेकिन नहीं दूसरे के बाद (एन = 5)।
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Discussion
एक मॉडल intravital माइक्रोस्कोपी और कम्प्यूटेशनल रक्त प्रवाह विश्लेषण का उपयोग microcirculatory रक्त प्रवाह और चूहों के फेफड़े मेटास्टेसिस में अन्य गतिशील प्रक्रियाओं में छवि में परिवर्तन संभव है कि प्रस्तुत किया है। अन्य तरीकों कृन्तकों के खुले ribcages में उजागर फेफड़ों पर माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए मौजूद हैं, यह मॉडल भी एक बंद छाती सेटिंग में एक छाती दीवार छिद्र के माध्यम से छवि फेफड़े के मेटास्टेसिस के लिए सबसे पहले है। इस विधि का प्रयोग, व्यवहार्यता फेफड़े metastases के microcirculatory रक्त के प्रवाह में औषधीय प्रेरित परिवर्तनों को मापने के लिए दिखाया गया है।
दो बुनियादी तरीकों छवि को फेफड़ों की सतह के लिए सीधे संपर्क के साथ, सहज रक्त प्रवाह द्वारा perfused कर रहे हैं कि जीवित कृन्तकों के फेफड़ों में मौजूद हैं: खुले सीने मॉडल की वजह से श्वसन और हृदय की गतिविधि के लिए फेफड़ों की निरंतर गति की समस्या को खत्म करने के लिए एक चूषण खिड़की लगाने से फेफड़ों की सतह के लिए, हृदय परिसर के बाकी जबकि अनुमति विस्तार करने के लिएऔर और एक खुली छाती गुहा 7,14 के भीतर अनुबंध। इस विधि उत्कृष्ट प्रयोगात्मक पहुँच प्रदान करता है जबकि एक अक्षुण्ण फेफड़ों 8 की शर्तों की तुलना में, खुले सीने की स्थिति और चूषण खिड़की कलाकृतियों का परिचय। वैकल्पिक रूप से, रिब पिंजरे छोड़ दें कि बंद छाती प्रक्रियाओं काफी हद तक बरकरार ऐसे गतिशील एक-दूसरे के खून के प्रवाह पर हृदय और फेफड़े के प्रस्ताव के आपसी प्रभाव के रूप में बरकरार छाती गुहा में मूल स्थिति, संरक्षण का वादा सहन। इन मॉडलों को आम तौर पर छाती दीवार 15, या ऊतक 9 के सूखने को रोकने के लिए फेफड़ों की सतह के साथ सीधे संपर्क में लाया जाता है कि एक पारदर्शी झिल्ली को sutured है कि एक खिड़की के साथ एक फ्रेम शामिल है। समायोजित और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग सक्षम करने के लिए हृदय गति बातचीत की कठिनाई एक प्रमुख तकनीकी बंद छाती प्रक्रियाओं की चुनौती है, और इस तकनीक की कम समग्र प्रसार के लिए शायद जिम्मेदार है। की हमारे मामले में, संयोजनएक ठोस खिड़की होल्डिंग फ्रेम और एक जेड दिशात्मक निरोधक उपकरण पर्याप्त एक बंद छाती खिड़की 10 में फेफड़े के संचलन के स्वचालित रक्त प्रवाह माप अनुमति देने के लिए फेफड़ों के पार्श्व आंदोलन खत्म करने के लिए प्रभावी साबित हो गया है।
एक आम तरीका intravital माइक्रोस्कोपी छवि के ढेर से रक्त प्रवाह वेग को मापने के लिए एक दिया संवहनी खंड 14 के लगातार छवियों में रक्त प्रवाह पैटर्न के स्थानिक मिलान का इस्तेमाल होता है। एकल रक्त वाहिकाओं के विश्लेषण के साथ जुड़े बार प्रयास को कम करने के लिए, एक रक्त प्रवाह इमेजिंग एल्गोरिथ्म है कि पूरे ऑप्टिकल क्षेत्र में 11 से रक्त प्रवाह वेग नक्शे का उत्पादन शुरू किया गया है। समय लाभ के अलावा, इस पद्धति का भी ध्यान दिए बिना संवहनी आकृति विज्ञान या शाखाओं में बंटी अंक की, पूरे ऑप्टिकल क्षेत्र में रक्त के प्रवाह का एक साथ स्थानिक विश्लेषण की अनुमति देता है। कई रक्त वाहिकाओं योगदान जहां ट्यूमर microenvironment, का अध्ययन करते हैं तो यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैBute एक दिया ट्यूमर क्षेत्र 13,16,17 की आपूर्ति की स्थिति के लिए। दरअसल, ट्यूमर वाहिका के नाम से जाना टेढ़ा-मेढ़ापन और बड़े intervascular अंतराल के अस्तित्व को स्पष्ट रूप से जांच की गई है कि दोनों मेटास्टेटिक कैंसर के प्रकार, (2A चित्रा) में देखा जा सकता है। फेफड़े के खिड़की विधि को भी हाल ही में फेफड़े के संचलन में रक्त प्रवाह वेग को बढ़ाने के लिए पाया गया है कि एक औषधीय उपचार के प्रभाव को मापने के द्वारा, मेटास्टैटिक घाव में रक्त प्रवाह वेग में परिवर्तन रिपोर्ट करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया है: उच्च रक्तचाप से ग्रस्त दवा इफेड्रिन endothelin रिसेप्टर अवरोधक ambrisentan दवाओं संयोजन में दिया जाता है जब फेफड़े केशिकाओं में बढ़ रक्त प्रवाह वेग में, जो परिणाम के पूर्व केशिका arteriolar टोन, कम कर देता है, जबकि हृदय उत्पादन बढ़ जाता है। इन आंकड़ों कहीं और समीक्षा के अंतर्गत वर्तमान में कर रहे हैं, एक उच्च रक्तचाप से ग्रस्त दवा के संयोजन की क्षमता और एक endothelin रिसेप्टर प्रतिपक्षी परिधीय मांसपेशियों को बढ़ाने के लिएछिड़काव स्वतंत्र रूप से 18 प्रकाशित किया गया है। सामान्य परिस्थितियों में, रक्त प्रवाह वेग की एक खुराक पर निर्भर वृद्धि दोनों इंजेक्शन के बाद देखा जा सकता है, वहीं दूसरी इंजेक्शन सार्कोमा मेटास्टेसिस में प्रवाह वेग का एक और वृद्धि करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है तथ्य यह है कि इस तथ्य से परिणाम हो सकता है कि अधिक से अधिक ट्यूमर जहाजों वाहिकाप्रसरण पहले से ही Ephedrine और ambrisentan की पहली संयुक्त इंजेक्शन के बाद तक पहुँच गया है।
निम्नलिखित सीमाओं यहाँ प्रस्तुत तकनीक को लागू करें: इस प्रोटोकॉल लगभग 180-300 जी या अधिक से चूहों (और सैद्धांतिक रूप से, समान आकार स्तनधारियों) के लिए लागू है। चूहों जैसे छोटे स्तनधारी रिब पिंजरे के और अधिक नाजुक शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान को समायोजित करने के लिए विशेष संशोधन की आवश्यकता होगी। प्रस्तुत तकनीक के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि अधिकतम स्थानिक संकल्प सैद्धांतिक रूप से ही उद्देश्य की संख्यात्मक एपर्चर और प्रयोग किया जाता है कि कवर स्लाइड की मोटाई (द्वारा सीमित है ~ 0।मानक ब्रांडों में 08-0.1 माइक्रोन), तेल विसर्जन के उपयोग के साथ 100X उद्देश्यों, करने के लिए। लेकिन व्यवहार में, फेफड़ों के शेष आंदोलन 20X परे उच्च संकल्प उद्देश्यों के उपयोग को सीमित कर सकता है। फेफड़ों के सभी स्वायत्त प्रस्ताव का सफाया कर दिया गया है, तो तकनीक का अस्थायी समाधान केवल प्रति सेकंड लगभग 100 फ्रेम करने के लिए, कैमरे के फ्रेम दर, और जोखिम समय निर्धारित करता है जो फ्लोरोसेंट लेबल के सिग्नल की शक्ति द्वारा सीमित है। निम्न अतिरिक्त सीमाओं प्रस्तुत तकनीक के लिए लागू होते हैं: एक हाथ पर, वर्तमान सूक्ष्म और कम्प्यूटेशनल सेटिंग एक दिया मेटास्टेसिस की सतह का ही विश्लेषण की अनुमति देता है। इस तरह के उन्नत confocal माइक्रोस्कोपी इमेजिंग रणनीति के रूप में गहराई मर्मज्ञ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, भविष्य में तीन आयामों में रक्त प्रवाह वेग की माप के लिए सक्षम हो सकता है। इसके अलावा, प्रस्तुत तकनीक, अपने मौजूदा रूप में, फेफड़ों पैरेन्काइमा अंदर आगे घावों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। एक GLA का तीसरा, प्रविष्टिसक्रिय रक्त वाहिकाओं के साथ सीधे संपर्क में एसएस खिड़की, या locoregional तापमान को प्रभावित करने से रक्त वाहिकाओं के स्थानिक संपीड़न के माध्यम से ही microvascular प्रवाह, उपद्रव करने के लिए कुछ क्षमता है। चौथा, फेफड़ों में एक बाहरी वेंटीलेटर और सकारात्मक दबाव का उपयोग भी फेफड़े microcirculatory रक्त के प्रवाह को बदलने की क्षमता है। इसके अलावा, रिब पिंजरे के ही सीमित क्षेत्रों में वर्णित है, अपेक्षाकृत गैर सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए व्यावहारिक रूप से सुलभ हैं। इस तरह के औसत दर्जे-उदर या पृष्ठीय उपयोग के रूप में फेफड़ों की सतह के अन्य क्षेत्रों में, रिब पिंजरे के बायोमैकेनिक्स का गहरा perturbations के साथ और अधिक व्यापक शल्य चिकित्सा तकनीक, की आवश्यकता होगी। क्योंकि microcirculatory रक्त के प्रवाह का अध्ययन करने के लिए इमेजिंग माइक्रोस्कोपी के लिए विकल्प की कमी की वजह से, प्रमुख घटनाओं इन बाधाओं पर काबू पाने और कृंतक फेफड़ों के सभी भागों में उच्च लौकिक-स्थानिक संकल्प पर कैंसर का अध्ययन करने के लिए निकट भविष्य में उम्मीद की जा सकती।
सारांश में, एक विधि दबाव हैके पैटर्न, और चूहा फेफड़ों की सतह मेटास्टेसिस में microvascular रक्त प्रवाह वेग में परिवर्तन को मापने के लिए ented। पूरे सूक्ष्म ऑप्टिकल क्षेत्र में रक्त के प्रवाह वेग को मापने का एक स्वचालित पद्धति के साथ एक तीव्र बंद छाती शल्य मॉडल का मेल है, इस तकनीक, फेफड़ों के शारीरिक पर्यावरण के सापेक्ष संरक्षण प्रदान करता है समग्र microcirculatory रक्त प्रवाह वेग और दिशा में परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम है , और उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। यह इस तकनीक कृंतक मॉडल में इस रोग की स्थापना में फेफड़े के मेटास्टेसिस और अन्य गतिशील प्रक्रियाओं के microcirculation में अध्ययन करने वाले सभी समूहों के लिए बहुत काम का हो जाएगा कि उम्मीद की जा सकती।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
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