Protocol
NOT: Bu protokol açıklanan tüm hayvan ilgili prosedürler önceden Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (DUIACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Kanser Hücre Kültürü ve Enjeksiyon
- Floresan etiketli metastatik kanser hücrelerini Yetiştirmek (örn insan MDAMB231-GFP meme kanseri hücreleri, Dr. Patricia Steeg, NCI ve YFP etiketli fare sarkomu hücreleri, Dr David Kirsch, Duke Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Radyasyon Onkolojisi Bölümü'nden hediye hediye) Uygun bir kültür ortamında (örneğin, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptavidin ile (DMEM)), 37 ° C 'de yaklaşık olarak% 90, birbirine karışana kadar.
- Hücreleri Trypsinize PBS ile onları 2 kez yıkayın, saymak, ve sonra bir 27 G iğne ile bir şırınga kullanarak, hayvan başına 5 milyon hücre izofluran-anestezi 10 haftalık dişi çıplak sıçanların kuyruk damarlar içine enjekte edilir. Cerrahi düzey anesthesia ayak tutam tepki eksikliği tarafından doğrulanmadı.
Metastaz kullanma mikroBT 2. İzleme
- Metastaz çapı çapı yaklaşık 2 mm varlığını tespit etmek için, bir mikro-CT / mikro ışınlayıcı kullanılarak haftada bir sıçan inceleyin. Daha önce açıklandığı gibi 12 mikro-BT devreye alınmıştır.
- Görüntüleme önce% 3 izofluran anestezisi Konu fareler. Ayak tutam derin anestezi onaylayın.
- Anestezi başlangıcından sonra, hızla görüntüleme odasında görüntüleme beşiğine sıçan aktarmak ve% 2.5-3 bir izofluran-hava karışımı bir burun-koni aracılığıyla bağlayın. Görüntüleme beşiği harici pozisyon kontrolleri ve lazer sınırlayıcı kullanarak, kendi toraks mikroBT tarayıcının foton ışın konumlandırılmış bir şekilde beşikte sıçan konumunu ayarlayın. Gama ışınlarından araştırmacı kalkan, görüntüleme odasının kapısını kapalı olduğundan emin olun.
- Yine kullanarak hayvanın konumunu kontrolrenkli video kamera. Düşük çözünürlüklü BT görüntüleme deneme sürüşü gerçekleştirin ve göğüs boşluğunun xyz boyutlarına görüş alanını ayarlamak için çıkan görüntü kullanın.
- Görüntü sıçan 40 kVp bir 2 mm Al filtre kullanılarak toraks, 2.5 mA ve 7 FPS 0.008 Vokseller ve kafesine hayvan dönün. Bir hayvanın Görüntüleme en fazla 15 ya da 20 dakika sürer. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın.
- Intratorasik kan damarları tarafından izah edilemez nispeten radyo-opak nesnelerin görünümünü tarafından metastaz onaylayın (Şekil 1A)
3. Pencere Odası Cerrahisi
- Anestezi, vital bulgular ve kuyruk ven kateterizasyonu
- Metastatik hastalık varlığı ile hayvanları seçin. Bir karın içi d hayvan enjekte50 mg / kg pentobarbital ose. Devam etmeden önce ayak tutam cerrahi düzey anestezi onaylayın.
Not: Anestezi protokolleri ilgili deney düzeneği uygun olmalıdır. Kolay yeniden doz seçeneği sunarken Pentobarbital, uzun prosedürler için derin anestezi uyarmak için, uzun etkili anestetik olarak burada seçildi. Ancak, doz aşımı hayvanların kaybı pentobarbital anestezi ile ortak bir sorundur. Pentobarbital daha büyük bir dereceye kadar otonom refleksleri koruyan Başka bir seçenek de, ancak sadece tek bir yeniden dozaj çevrimi için izin iksilazin ya da medetomidin gibi sedatif ile kombinasyon halinde ketamin olup. - Bir clipper kullanarak, metastatik hastalık vardır, ve boyun bölgesinde vücudun yan tarafında hayvanlar Tıraş. Cilt kalan tüm gevşek saç silin. Gevşek saç kaldırıldıktan sonra, kurumasını önlemek için, gözlere veteriner merhem uygulayın.
NOT: Atimik çıplak sıçanlar requi artık saç olabilircerrahi işlemlerde devam etmeden önce res kaldırma. Cerrahi prosedürler ve görüntüleme müdahale edebilir gibi, iyice tüm saç kaldırmak için çok önemlidir. - 37 ° C su sirküle ısıtma yastığı yerleştirilmiş bir metal plaka üzerinde bir yatar pozisyonda hayvan Fix. Ön ve arka ekstremite bant ile plaka üzerine sabitlenir.
NOT: Bu kontrol ve cerrahi ve deneysel prosedürler boyunca, bir pulse oksimetre ile kalp oranları ve arteriyel kan oksijenlenme gibi vital bulguları, kayıt yararlıdır.
- Metastatik hastalık varlığı ile hayvanları seçin. Bir karın içi d hayvan enjekte50 mg / kg pentobarbital ose. Devam etmeden önce ayak tutam cerrahi düzey anestezi onaylayın.
- Trakeal entübasyon
- Trakea uzunlamasına kas ventral median ayrılması ardından çapraz servikal cilt kesisi, ilk, hayvanın havalandırma için bir kateter yerleştirmek yapmak için.
- Trakea dorsal tarafı ile dikiş için bir geçiş oluşturmak için keskin bir forseps ile tekrarlanan açılış-to-kapama eylemini kullanın.
- T trakea içine küçük bir kesi yapınO ventral yüzü, yaklaşık olarak ikinci ve üçüncü trakeal halka arasında, yarı dairesel daha fazla olamaz. Trakeal kateterin tespit sağlamak için, dorsal yüzeyi üzerinde açığa trakea yeterince uzun bir bölümü bırakın.
- Trakea içine 2,5-3,0 mm "Y" trakeal kanül yerleştirin ve 4-0 monofilament sütür ile sıkın. Pozitif akciğer basıncını sağlamak için, kanül su 6 cm ile doludur son kanalına bağlı bir şişe basınç devirli ventilatöre bağlı olduğundan emin olun. Deneysel aksi istenen sürece akan gaz,% 100 oksijen olmalıdır.
- Bir 25-27 G iğne ile bir kateter yerleştirin ve sıçan kuyruğu damarlar birine heparinli serum fizyolojik ile doldurulur, ve bant ile yerde sabitleyin.
NOT: arka arkaya kuyruk damarından heparinli tuz az miktarda enjekte edilerek işlem boyunca kuyruk damarı kateterinin açıklığını sağlamak. Ayrıca, oro-entübasyon, bir trakeal rehberlik yanianestezi verilen hayvanın ağız yoluyla ve nefes borusu içine gırtlak geçen tüp, burada açıklanan traketomi edilen prosedüre de bir olası alternatiftir. Ancak, bu yöntem trakea zarar görmesini önlemek için, ve aynı zamanda yemek borusu yanlışlıkla kanül engelleyecek, özel eğitim ve deneyim gerektirir.
- Pulmoner pencere Uygulaması
- Künt diseksiyon kullanarak cilt ayırma sonra bir kesi oluşturarak, tarafından, metastatik hastalık bulunduğu göğüs tarafındaki deriyi çıkarın.
Not: Cilt çıkarıldı ve dekolmanı sonraki kaldırılabilir - Bindirilirken kas (pektoralis, serratus ve latissimus dorsi) iki kat diseksiyon, ama sağlam interkostal kasları bırakarak devam edin. Tipik olarak, iki bitişik kaburga kısımları bertaraf eder, çap olarak yaklaşık 1.5 cm göğüs boşluğunda bir delik oluşturur. İdeal olarak, altıncı ve yedinci r bölgenin perforasyon bulunibs.
- Osteotomi:
- Akciğer yüzeyine kanama ve zararı en aza indirmek için, sıkı kesme sırasında bir dişli cerrahi forseps ile kesilecek kaburga tutun. Cerrahi makas kullanılarak, dış işaret kalan kaburga kemiği sivri bir kenar bırakan, yaklaşık 45 ° 'lik bir açı ile, ilk kaburga medial yan kesti.
- Daha sonra, yeniden akciğer yüzeyine zarar görmesini önlemek için, dışarı doğru bakan kabartma kemikten sivri bir kenar bırakan, benzer bir şekilde, kaburga kemiği yanal kenarını.
- Daha sonra interkostal kasları kesmek ve kesilmiş parça kaldırın, komşu kaburga için işlemi tekrarlayın. Bu prosedür sırasında, akciğer yüzey ve göğüs kafesi arasında mekanik bir etkileşim en aza indirecek bir şekilde akciğer basınç sağlar. Uygun ventilatöre ilham basıncını düzenleyerek bunu yapın.
- Pencerenin yerleştirilmesi:
- Bir coverglass oluşan bir özel yapılmış akciğer penceresini takınbir pleksiglas soketi (Şekil 1B) eklenmiş. , Yapıştırma ya da vakum yağ çok az miktarda uygulanarak sokete pencere takın. Yüzey metastazları yakın pencerenin merkezine yer almaktadır bir şekilde pencereyi yerleştirin. Gerektiği taktirde ilgili tarafına hafifçe delik genişletilirse, pencerenin merkezi Mikrometastaz getirmek için eklenen bir delik ayarlayın.
NOT: Plevral yüzeyde Metastatik hastalık çatlaklar boyunca ağırlıklı olarak görünen akciğer yüzeyinin aksi pembe-to-somon renkli sağlıklı parçalarının içinde açıkça tanınabilir beyaz noktalar veya alanlar olarak tespit edilebilir. Mikrometastazlar plevra dış diğer alanlarda oluşabilir iken, incelenen hücre çizgileri hemen hemen her zaman metastatik hastalık radyolojik tespit edilebilir kez delinmiş alanda mikrometastazları yüzey görüntüler. - Perforasyon içine soketi takarken, ve l viseral plevra ile doğrudan temas oluşturduktan sonraung, 4.0 monofilament sütür (Şekil 1C) kullanarak, çevredeki interkostal kas pencere çerçevesinin kenarlarını dikin. Kaçmak ve bir mühür oluşturmak için artık havayı yardımcı ventilatöre ilham basınç hafif bir artış kullanın.
Not: sıçanların solunum hızı 70 ile 90 bpm arasında solunum hızını ayarlamak için tavsiye vb anestezi, heyecan veya anksiyete durumu, solunan havanın oksijen konsantrasyonu (FiO2), durumuna bağlı olarak, büyük ölçüde değişebilir. ilham basıncı dikkatle ayarlanmalıdır ve yaklaşık fazla ayarlanmalıdır. 8 cm H2O (0.6 mm Hg), akciğer yüzeyine zarar görmesini önlemek için.
- Bir coverglass oluşan bir özel yapılmış akciğer penceresini takınbir pleksiglas soketi (Şekil 1B) eklenmiş. , Yapıştırma ya da vakum yağ çok az miktarda uygulanarak sokete pencere takın. Yüzey metastazları yakın pencerenin merkezine yer almaktadır bir şekilde pencereyi yerleştirin. Gerektiği taktirde ilgili tarafına hafifçe delik genişletilirse, pencerenin merkezi Mikrometastaz getirmek için eklenen bir delik ayarlayın.
- Flöresanlı bir mikroskop altında, bir termostatik (elektrik) ısıtma battaniyesi üzerine yerleştirilen bir çelik plaka ile Z-yönlü hareketi (Şekil 1D) ortadan kaldırmak için tasarlanmıştır özel olarak tasarlanmış süzgeç hayvan yerleştirin. Hayvanın vücudu kontrolrektal termistör kullanarak sıcaklığı. Hayvan süzgeç vidalarını ayarlayın ve ventilatöre ilham basıncı yanal hareket optimal kontrolü sağlamak için.
Not: ikili, dorso-ventral ve kranyokaudal: memelilerde Doğal solunum akciğer hareketi ve göğüs uzantısı üç yön içerir. Mümkün olduğunca doğal bir solunum hareketi korumak için, gerekli ölçüde Z yönlü sıkıştırma en aza indirmek için önemlidir. Z-boyutlu emniyet kan akışını ve diğer parametreleri etkileyebilir eserleri tanıtmak potansiyeline sahip olduğundan, aynı hayvanda tekrarlayan ölçümler dizi boyunca sürekli koşullarını tutmak için tavsiye edilir.
- Künt diseksiyon kullanarak cilt ayırma sonra bir kesi oluşturarak, tarafından, metastatik hastalık bulunduğu göğüs tarafındaki deriyi çıkarın.
4. Görüntüleme ve Ölçüm Mikrosirkülasyonda Kan Akımının
- Kalp ponksiyonu ile kırmızı kan hücreleri toplamak ve daha önce tarif edildiği gibi, DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 = 3 = tetrametil-indokarbosiyanin perklorat) ile etiket <sup> 10.
- Pencere bölmesi ameliyatı yapılır önce cam pencere için ilk geçiş yapışma etkilerini önlemek için, sıçanın kuyruk venine işaretli kırmızı kan hücrelerinin 300 ul enjekte edilir. Ven içine hava giriş başka enjeksiyon inhibe gibi, şırınga ya da sonda herhangi bir hava kabarcığı ortadan kaldırır.
- Görüntü kan sıcaklığı -40 ° C soğutma çip bir mikroskop CCD kamera ile akış ve yaklaşık 100X toplam çözünürlük (10X mikroskop objektif yani, ve 10X ön kamera göz). Standart Rodamin / TRITC filtre setleri (uyarma 450-490 nm, emisyon> 515 nm) kullanın. Ortaya çıkan görüntü dizilerinin gerçek kare hızı ve piksel çözünürlüğü kaydedin. Yığının başına rekor en az 200 (ideal etrafında 300) görüntüleri, akış hızı başarılı analizini sağlamak.
- Tuzlu su ip yaklaşık 1 ml her bir saat enjekte edilerek hayvanda sıvı kaybı doldurun.
NOT: Bir müdahale içeren deneysel ayarları, örneğinBir akciğer kanseri metastazı kan akış hızını değiştiren bir ilaç, pulmoner metastatik kanser kan akış hızı tekrarlanan ölçümler gerektirir. Bu genişletilmiş deneyler için, yeterli sıvı ile hayvan doldurmak için önemlidir. - Kuyruk venine 3N KCI 3 ml infüzyon ile hayvanlara Euthanize
- Tüm kan akışı için akış hızı gri tonlu ve renkli kodlanmış haritalar 10,11 izleri yaratacak bir yayınlanan kamuya açık Matlab tabanlı bir bilgisayar algoritması kullanarak görüntü yığınlarını değerlendirin. Daha sonra, kan hücrelerinin hiçbir hareket gösterir aktif damarsal yani değerleri kapalı eşikleme sonra, örneğin Görüntü J gibi ticari veya kamuya açık görüntü analiz yazılımı kullanarak ortaya çıkan gri tonlu görüntüleri değerlendirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Katı tümörlerde damar kıvrımlarında daha fazla derece ve daha yüksek intervasküler mesafeleri 13 gösteren normal kan akımının önemli ölçüde farklıdır bilinmektedir. Normal akciğer mikro (Şekil 2A, üst panel) ile karşılaştırıldığında duruma göre, deneysel akciğer, meme kanseri ve sarkom metastazlarında kan akışı parçalar düzensiz şekiller ve geniş intervasküler boşluklar (Şekil 2A, iki alt paneller) sahiptir. Bir önceki çalışmada, pulmoner pencere yöntemi yeteneği, normal akciğerlerde 10 kan akış hızı değişiklikleri otomatik ölçümler yapmak için gösterilmiştir. Pulmoner pencere yöntemi de akciğer metastazlarında kan akım hızında artış ölçebilirsiniz olup olmadığını araştırmak amacıyla, sempatomimetik ilaç efedrin ve son zamanlarda sağlıklı akciğerlerde mikrovasküler dolaşımını artırmak için bulunmuştur endotelin engelleyici ambrisentan ilaç kombinasyonu,(başka bir yerde inceleme altında veri) burada uygulandı. Bu çalışmada, yöntemin özelliği efedrin kombinasyonu ile dozlama neden olduğu fare sarkom, akciğer metastazları kan akış hızında bir artışa (20 mg / kg) ve endotelin reseptör antagonisti ambrisentan (0.5 mg / tespit etmek için gösterilmiştir kg, periton boşluğu içine, her iki ilaç, Şekil 2B). Her veri noktası beş dakikalık aralıklarla üç ölçümün toplanmış bireysel ortalamaları temsil, beş hayvanlarda elde edilen veriler üzerinden ortalama. İkinci enjeksiyon 0.74 ± 0.19 mm / sn yüksek akış hızı muhafaza ise ilk enjeksiyon anlamlı (p <0.01), 0.74 ± 0.19 ile 0.61 ± 0.12 mm / sn tümör bölgesinde kan akım hızı arttı (). ikinci enjeksiyon kan akış hızında daha fazla artış meydana getirmemiştir. N = 5, tüm istatistikler: tekrarlanan ölçümler ANOVA.
Şekil 1:. Bir sıçan yatak akciğer metastazları (ok) canlı mikroskobu görüntüleme için bir akciğer metastazları taşıyan sıçan hazırlamak için Prosedür (A) mikroBT görüntüsü (B) Akciğer pencere çerçevesi göğüs duvarı perforasyon ve pulmoner pencere (C) Sıçan.. bağlı. Z-yönlü göğüs hareketini sınırlamak için (D) frenleyici cihazı. floresan mikroskop altında (E) pencere gözü ile Sıçan ve frenleyici cihaz. Not: Panel C ve Sprague Dawley sıçanları taşıyan E gösterisi saç, çıplak sıçanları atımık değil.
Şekil 2: akciğer metastazlarının kan akışındaki artış miktarının belirlenmesi. Normal olarak (A) kan akımı yönü ve hızıAkciğer ve MDAMB-231 ve fare sarkomu bir kanser metastazı. Sol taraftaki sütun floresan mikrograflarından görüntü serisi snap shot içerir. Alveolae Normal akciğerde eşiğe deseni (üst panel) bir parçası olarak tanımlanabilir. Metastaz enjekte kanseri hücrelerinin (kesikli çizgi) endojen fluoresan proteinleri neden olduğu floresan ile yer alabilir. Sağa Sütunlar:. Renk kodlu kan akış yönünü haritaları (renk göstergesi tekerlek hücreleri aktığı doğru yönü işaret) ve akış hızı, mm ölçülen / saniye (B) kombine efedrin tekrarlanan enjeksiyonundan sonra mikrosirkülatuar kan akımında değişiklikler ve Ambrisentan (20, 0.1 mg enjeksiyon başına / kg). Genel akış hızında önemli bir artış (tekrarlanan ölçümler ANOVA, p <0.01), ilk enjeksiyondan sonra gözlenen, ancak değildi sonra ikinci (N = 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir model İntra vital mikroskopik ve hesaplama kan akışı analizi kullanılarak mikro dolaşım kan akışı ve sıçanların akciğer metastazı Diğer dinamik süreçleri, görüntü değişikliklerine mümkün olduğu gösterilmiştir. Diğer yöntemler kemirgenler açık ribcages maruz akciğerler üzerinde mikroskopi gerçekleştirmek için var iken, bu model aynı zamanda bir kapalı göğüs ortamda bir göğüs duvarı perforasyon ile görüntü pulmoner metastazlar için ilk. Bu yöntemle kullanarak, fizibilite pulmoner metastaz mikrosirkülatuar kan akımında farmakolojik kaynaklı değişiklikleri ölçmek için gösterilmiştir.
İki temel yöntem görüntü akciğer yüzeyine doğrudan temas ile, spontan kan akışının perfüze olan yaşam kemirgenler akciğerleri vardır: açık göğüs modelleri nedeniyle solunum ve kalp aktivitesi akciğerin sürekli hareket sorununu ortadan kaldırmak bir emme penceresi uygulayarak akciğer yüzeyine, kardiyopulmoner kompleksinin geri kalanı izin verirken expve ve açık göğüs boşluğu 7,14 içinde sözleşme. Bu yöntem, mükemmel deneysel erişim sağlarken, bozulmamış bir akciğer 8 koşullarına göre, açık göğüs koşulları ve emme penceresi eserler getirmektedir. Alternatif olarak, göğüs kafesi terk kapalı göğüs prosedürleri büyük ölçüde sağlam, dinamik birbirlerinin kan akımı üzerine kardiyak ve pulmoner hareket karşılıklı etkisi olarak sağlam göğüs boşluğunda orijinal şartları, koruma sözünü ayı. Bu modeller genel olarak göğüs duvarı 15 veya doku 9 kurumasını önlemek için akciğer yüzey ile doğrudan temas ettirilir saydam zar suture edilen bir pencere ile bir çerçeve içerir. karşılamak ve mikroskopi görüntüleme sağlamak için kardiyopulmoner hareket müzakere zorluk büyük bir teknik kapalı göğüs prosedürlerinin meydan ve bu tekniğin düşük toplam yayılması için muhtemelen sorumludur. Bizim durumunda, kombinasyonkatı pencere tutma çerçevesi ve Z-yönlü sınırlama cihazı yeterince kapalı göğüs pencere 10 pulmoner dolaşım otomatik kan akışı ölçümlerine izin verecek şekilde akciğerin yanal hareketini ortadan kaldırmak için etkili olduğu kanıtlanmıştır.
Bir ortak yöntem intravital mikroskopi görüntü yığınlarının kan akış hızını ölçmek için verilen damar segmentinin 14 ardışık görüntüler kan akımı desen mekansal uyumu kullanılmasıdır. Tek kan damarlarının analizi ile ilgili zaman çaba azaltmak için, kan akımı görüntüleme algoritması tüm optik alanında 11 kan akım hızı haritalar üreten getirilmiştir. Zaman avantajı yanında, bu yöntem aynı zamanda bağımsız olarak damar morfolojisi veya dallanma noktaları, tüm optik alanında kan akımının eş zamanlı mekansal analizini sağlar. Birden fazla kan damarları katkılarının tümör mikro, eğitim sırasında özellikle önemlidirdirilmektedir, belirli bir tümör alanının 13,16,17 besleme durumu. Gerçekten de, tümör damar bilinen eğrilik ve büyük intervasküler boşlukların varlığı açıkça araştırılmıştır hem metastatik kanser türleri, (Şekil 2A) 'de görülebilir. pulmoner pencere yöntemi yakın zamanda akciğer dolaşımı, kan akış hızının arttırılması için bulunmuştur bir ilaç tedavisinin etkisi ölçülerek metastatik lezyonda kan akış hızı değişiklikleri bildirmek yeteneği için test edilmiştir: hipertansif ilaç efedrin endotelin reseptör bloker ilaçlar Ambrisentan birlikte verildiğinde pulmoner kılcal artmış kan akım hızında, sonuçları önceden kılcal arteriolar sesi azaltır oysa, kardiyak çıkışı artar. Bu veriler başka inceleme altında anda birlikte, hipertansif ilaç kombinasyonunun kabiliyeti ve bir endotelin reseptör antagonisti periferal kas artırmakperfüzyon bağımsız 18 yayımlanmıştır. Normal koşullar altında, kan akış hızının, doza bağımlı bir artış, her iki enjeksiyondan sonra gözlenen edilebilir olsa da, ikinci enjeksiyon sarkomu metastazlarında akış hızında bir artışa neden olmadığı gerçeği gerçeğinden neden olabilir maksimum tümör damarlarının damar genişlemesi Zaten efedrin ve ambrisentan ilk kombine enjeksiyonundan sonra ulaşıldı.
aşağıdaki kısıtlamalar Burada sunulan teknik için geçerlidir: Bu protokol, yaklaşık olarak 180-300 g veya daha fazla grup fareye (ve teorik olarak aynı büyüklükte memeliler) için de geçerlidir. Fare gibi küçük memeliler göğüs kafesinin daha kırılgan anatomisi ve fizyolojisini karşılamak için özel değişiklik gerektirecektir. sunulan teknik ile elde edilebilen maksimum uzamsal çözünürlük teorik olarak sadece amacı sayısal açıklık ve ikinci kapak sürgü kalınlığına (sınırlıdır ~ 0.Standart markalar 08-,1 mikron), yağ daldırma kullanımı ile 100X hedefleri için. Ancak pratikte, akciğer kalan hareketi 20X ötesinde yüksek çözünürlüklü hedefleri kullanımını kısıtlayabilir. Akciğerin tüm özerk hareket elenirse, tekniğin zamansal çözünürlük sadece saniyede yaklaşık 100 kare, kamera kare hızı ve pozlama süresini belirler floresan etiket, sinyal gücü ile sınırlıdır. Aşağıdaki ilave sınırlamalar getirmiştir tekniği uygulanır: bir yandan, mevcut mikroskobik ve hesaplama ayar belirli bir metastaz yüzeyinin sadece analiz edilmesine izin verir. gibi gelişmiş konfokal mikroskopi görüntüleme stratejileri gibi derinlik-delici mikroskopi, kullanımı, gelecekte 3 boyutlu olarak kan akış hızı ölçümü sağlayabilir. Ayrıca, sunulan tekniği, mevcut haliyle, akciğer parankimi içinde daha lezyonlar görselleştirmek için kullanılamaz. Bir GLA Üçüncü, eklemeaktif kan damarları ile doğrudan temas halinde p pencere ya da lokal sıcaklık etkileme yolu ile kan damarlarının mekansal sıkıştırma yolu ile tek başına mikrovasküler akış, karıştırmayı için bir potansiyele sahiptir. Dördüncü olarak, akciğerde bir dış vantilatör ve pozitif basınç kullanımı, aynı zamanda, pulmoner mikro dolaşım kan akışını değiştirmek için potansiyele sahiptir. Ayrıca, göğüs kafesinin sadece sınırlı alanlar tarif nispeten komplike cerrahi prosedürler için pratik erişilebilir. Böyle medial-ventral veya dorsal erişimi gibi akciğer yüzeyinin diğer alanlar, göğüs kafesinin biyomekanik derin tedirginlikler ile birlikte daha ayrıntılı cerrahi teknikler, gerektirecektir. Çünkü mikrosirkülatuar kan akışını incelemek için görüntüleme mikroskop için alternatiflerin eksikliği, önemli gelişmeler bu engellerin üstesinden gelmek ve kemirgen akciğer her yerinde yüksek zamansal-mekansal çözünürlükte maligniteler çalışma yakın bir gelecekte beklenebilir.
Özetle, yöntem pres edilmektedirmodellerini ve sıçan akciğer yüzey metastazları mikrovasküler kan akım hızı, değişiklikleri ölçmek için ented. Tüm mikroskopik optik alanında kan akış hızının ölçülmesi için otomatik bir yöntem ile bir dar kapalı göğüs cerrahi bir model bir araya getiren, bu teknik, akciğer fizyolojik ortamın nispi koruma sağladığı toplam mikrodolaşım kan akış hızı ve yönü değişiklikleri saptayabilir ve kullanımı nispeten kolaydır. Bu teknik, kemirgen modellerinde bu hastalık ortamda pulmoner metastazlar ve diğer dinamik süreçlerin mikro dolaşımı çalışma tüm gruplara büyük kullanım olacağı beklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
- Billingsley, K. G., et al. Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg. 229, 602-610 (1999).
- Rashid, O. M., Takabe, K. The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis. J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).
- Mayer, A., Vaupel, P. Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy. Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).
- Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. Tumor oxygen measurements and personalized medicine. Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Palmer, G. M., et al. Optical imaging of tumor hypoxia dynamics. Journal of biomedical optics. 15, (2010).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).
- Fontanella, A. N., et al. Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm. Microcirculation. , (2013).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, 385-393 (1994).
- Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free. The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).
- Evans, S. M., et al. Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors. Radiation research. 170, 677-690 (2008).
- Radiloff, D. R., et al. The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude. Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).
