Protocol
NOTA: Tutte le procedure sugli animali relative descritte in questo protocollo sono stati precedentemente approvati dal Institutional Animal Care and Use Committee Duke University (DUIACUC).
1. Cancer Cell Culture e iniezione
- Coltivare cellule tumorali metastatiche fluorescente (ad esempio le cellule del cancro al seno MDAMB231-GFP umani, dono di Dr. Patricia Steeg, NCI, e le cellule del mouse sarcoma YFP-etichettati, dono del Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Dipartimento di Radioterapia Oncologica) in appropriato terreno di coltura (per es Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptavidina) a 37 ° C fino a circa il 90% confluenti.
- Trypsinize cellule, lavarli 2 volte con PBS, contare, e poi iniettarli nelle vene coda di isoflurano-anestetizzato 10 settimane ratti nudi femminili a 5 milioni di cellule per animale, usando una siringa con un ago 27 G. Anesthes livello chirurgiciia viene verificata dalla mancanza di reazione al pizzico punta.
2. Monitoraggio delle metastasi Uso microCT
- Esaminate ratti volta alla settimana usando un micro-CT / micro-irradiatore, per rilevare la presenza di metastasi sopra di circa 2 mm di diametro di diametro. Il micro-CT è incaricato come descritto in precedenza 12.
- Ratti soggetto a 3% isoflurano anestesia prima di imaging. Confermare profonda anestesia pizzico punta.
- Dopo insorgenza dell'anestesia, trasferire rapidamente i ratti alla culla di imaging nella camera di imaging e connettersi tramite un naso-cono per una miscela isoflurano-aria a 2,5-3%. Regolare la posizione del ratto in culla in modo che il suo torace è in posizione nel fascio di fotoni dello scanner microCT, utilizzando i comandi di posizione esterni e delimitatore laser sul supporto imaging. Assicurarsi che la porta della camera di imaging è chiusa, per proteggere l'investigatore dai raggi gamma.
- Controllare la posizione dell'animale utilizzando nuovamentela telecamera a colori. Eseguire un test di imaging CT a bassa risoluzione, e utilizzare l'immagine risultante per regolare il campo visivo alle dimensioni XYZ della cavità toracica.
- Immagine torace topo usando un filtro Al 2 mm 40 kVp, 2,5 mA, e 0.008 voxel a 7 FPS e rispedire l'animale nella sua gabbia. Imaging di un animale dovrebbe prendere non più di 15 o 20 minuti. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
- Conferma metastasi dalla comparsa di oggetti relativamente radiopachi che non può essere spiegato da vasi sanguigni intratoracica (Figura 1A)
Chirurgia 3. Finestra Camera
- Anestesia, segni vitali e cateterizzazione coda vena
- Selezionare gli animali con la presenza di malattia metastatica. Iniettare animale con un d intraperitonealeose di 50 mg / kg pentobarbital. Conferma a livello chirurgico anestesia pizzico punta prima di procedere.
Nota: i protocolli di anestesia dovrebbero essere abbinati al rispettivo apparato sperimentale. Pentobarbital stato scelto qui come anestetico ad azione prolungata, per indurre anestesia profonda per lunghe procedure, offrendo la possibilità di facile ri-somministrazione. Tuttavia, la perdita di animali da sovradosaggio è un problema comune con anestesia pentobarbital. Un'altra opzione che conserva riflessi autonomi in misura maggiore di pentobarbital è ketamina in combinazione con sedativi come la xilazina o medetomidina, che però consente solo per un singolo ciclo di ri-dosaggio. - Rasatura animali sul lato del corpo che ha la malattia metastatica, e nella zona del collo, utilizzando un clipper. Rimuovere tutti i restanti capelli sciolti dalla pelle. Dopo capelli sciolti viene rimosso, applicare una pomata veterinari per gli occhi, per evitare che si secchi.
NOTA: i topi nudi atimici possono avere capelli residuo requirimozione res prima di procedere con procedure chirurgiche. E 'molto importante rimuovere completamente tutti i capelli, come può interferire con le procedure chirurgiche e di imaging. - Fissare l'animale in posizione supina su una piastra di metallo che è posto su una piastra elettrica dell'acqua 37 ° C circolare. Le estremità anteriori e posteriori sono fissati sulla piastra con nastro.
NOTA: E 'utile per controllare e registrare i segni vitali, come i tassi di cuore e sangue arterioso ossigenazione utilizzando un pulsossimetro, durante le procedure chirurgiche e sperimentali.
- Selezionare gli animali con la presenza di malattia metastatica. Iniettare animale con un d intraperitonealeose di 50 mg / kg pentobarbital. Conferma a livello chirurgico anestesia pizzico punta prima di procedere.
- L'intubazione tracheale
- Per posizionare un catetere per la ventilazione dell'animale, prima una incisione cutanea cervicale trasversale, seguita dalla separazione mediana della muscolatura ventrale longitudinale alla trachea.
- Utilizzare ripetuta azione di apertura a chiusura con una pinza taglienti per creare un passaggio per la sutura attraverso il lato dorsale della trachea.
- Fai una piccola incisione nella trachea su tegli lato ventrale, non superiore semicircolare, circa tra il secondo e il terzo anello tracheale. Lasciare sufficientemente lunga porzione della trachea esposta sulla superficie dorsale, per consentire il fissaggio del catetere tracheale.
- Inserire una 2,5-3,0 mm "Y" cannula tracheale nella trachea, e stringere con una sutura 4-0 monofilamento. Verificare la cannula è collegata ad un ventilatore ciclato a pressione con una bottiglia collegata al condotto di scadenza che viene riempito con 6 cm di acqua, per mantenere la pressione polmonare positiva. Flusso gas deve essere al 100% di ossigeno, a meno che sperimentalmente desiderato altrimenti.
- Inserire un catetere con un ago G 25-27, e riempito di soluzione fisiologica eparinizzata in una delle vene coda di ratto, e fissare in posizione con nastro.
NOTA: Assicurare la pervietà del catetere vena della coda per tutta la procedura iniettando ripetutamente una piccola quantità di soluzione fisiologica eparinizzata nella vena della coda. Inoltre, intubazione oro-tracheale, cioè la guida di un trachealetubo attraverso la bocca dell'animale anestetizzato e passato laringe nella trachea, è una possibile alternativa alla procedura tracheotomia descritta qui. Tuttavia, questo metodo richiede formazione e dell'esperienza specifica, per evitare danni alla trachea, e anche per impedire la cannulazione accidentali dell'esofago.
- Applicazione della finestra polmonare
- Rimuovere la pelle dal lato del torace in cui si trova la malattia metastatica, creando una incisione, e poi staccare la pelle con dissezione smussata.
Nota: La pelle può essere eliminata e rimossa successivamente al distacco - Procedere sezionando i due strati di muscolatura sovrapposizione (pettorale, dentato, e gran dorsale), ma lasciando intatti i muscoli intercostali. Creare una perforazione nella cavità toracica di circa 1,5 cm di diametro, rimuovendo porzioni tipicamente due nervature adiacenti. Idealmente, individuare la perforazione della regione della sesta e settima ribs.
- Osteotomia:
- Per ridurre al minimo il sanguinamento e danni alla superficie del polmone, ermeticamente tenere la nervatura da tagliare con dentate pinza chirurgica durante il taglio. Usando forbici chirurgiche, tagliare il lato mediale della nervatura prima, con un angolo di circa 45 °, lasciando la parte appuntita della costola rimanente indica all'esterno.
- Successivamente, tagliare la parte laterale della costola in modo simile, lasciando ancora la parte appuntita della costola punta verso l'esterno, per evitare danni alla superficie del polmone.
- Ripetere la procedura per la nervatura adiacente, quindi tagliare i muscoli intercostali e togliere il pezzo asportato. Durante questa procedura, mantenere la pressione polmonare in modo che l'interazione meccanica tra la superficie polmonare e la gabbia toracica è minimizzato. Per fare ciò, opportunamente regolare la pressione ispirazione sul ventilatore.
- Inserimento della finestra:
- Inserire una finestra polmone misura, costituito da un coprioggetti che èattaccato ad una presa plexiglas (Figura 1B). Fissare la finestra alla presa mediante incollaggio, oppure applicando una piccola quantità di grasso per vuoto. Inserire la finestra in modo che le metastasi superficiali sono situati vicino al centro della finestra. Se necessario, regolare il foro inserito per portare la micrometastasi al centro della finestra allargando leggermente il foro al rispettivo lato.
NOTA: La malattia metastatica sulla superficie pleurica può essere identificato come puntini bianchi chiaramente riconoscibili o aree all'interno delle parti altrimenti rosa-a-salmone colorati sani della superficie polmonare che appaiono prevalentemente lungo le fessure. Mentre micrometastasi possono verificarsi in altri settori dell'esterno pleurico, le linee cellulari esaminati mostrano quasi sempre affioramento micrometastasi nell'area perforata, una volta metastasi può essere rilevato radiologicamente. - Dopo aver inserito la presa nella perforazione, e creando il contatto diretto con la pleura viscerale lung, suturare i bordi della cornice della finestra al muscolo intercostali circostante, utilizzando 4,0 sutura monofilamento (Figura 1C). Utilizzare un leggero aumento della pressione di inspirazione del ventilatore per aiutare aria residua di fuggire e per creare una tenuta.
Nota: Il tasso di respirazione di ratti può variare notevolmente, a seconda dello stato di anestesia, lo stato di eccitazione o ansia, concentrazione di ossigeno dell'aria inspirata (FiO2), ecc E 'consigliabile regolare la frequenza respiratoria tra 70 e 90 bpm. La pressione ispirazione deve essere regolata con cautela e non può essere impostato a più di ca. 8 centimetri H 2 O (0,6 mmHg), per evitare danni alla superficie del polmone.
- Inserire una finestra polmone misura, costituito da un coprioggetti che èattaccato ad una presa plexiglas (Figura 1B). Fissare la finestra alla presa mediante incollaggio, oppure applicando una piccola quantità di grasso per vuoto. Inserire la finestra in modo che le metastasi superficiali sono situati vicino al centro della finestra. Se necessario, regolare il foro inserito per portare la micrometastasi al centro della finestra allargando leggermente il foro al rispettivo lato.
- Posizionare l'animale in un dispositivo di immobilizzazione progettato su misura che è progettato per eliminare Z-direzionale movimento (Figura 1D) su una piastra di acciaio che è posizionato su un termostatica (elettrica) termocoperta, sotto un microscopio a fluorescenza. Controllare il corpo dell'animaletemperatura con un termistore rettale. Regolare le viti del dispositivo di immobilizzazione degli animali, e la pressione di inspirazione del ventilatore per ottenere il controllo ottimale di movimento laterale.
Nota: la respirazione naturale in mammiferi coinvolge tutte e tre le direzioni di movimento del polmone e l'estensione del torace: bilaterali, dorso-ventrale, e cranio-caudale. Per preservare il movimento respirazione naturale per quanto possibile, è importante minimizzare la compressione Z-direzionale nella misura necessaria. Poiché il sistema di ritenuta Z-dimensionale ha il potenziale per introdurre artefatti che possono influenzare il flusso di sangue e altri parametri, si consiglia di mantenere le condizioni di costante durante serie di misure ripetute dello stesso animale.
- Rimuovere la pelle dal lato del torace in cui si trova la malattia metastatica, creando una incisione, e poi staccare la pelle con dissezione smussata.
4. Imaging e misurazione del flusso sanguigno Microcircolatoria
- Raccogliere i globuli rossi tramite puntura cardiaca ed etichettarli con DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 perclorato =, 3 = tetrametil-indocarbocyanine), come descritto in precedenza <sup> 10.
- Iniettare 300 ml di globuli rossi marcati nella vena della coda del topo prima dell'intervento camera di finestra è fatta, per evitare effetti primo passaggio adesione alla finestra di vetro. Eliminare eventuali bolle d'aria nella siringa o del catetere, come introduzione di aria nella vena inibirà ulteriori iniezioni.
- Immagine flusso di sangue con una telecamera CCD microscopio a -40 ° C di temperatura di raffreddamento di chip, e circa 100X risoluzione complessiva (cioè con un obiettivo microscopio 10X, 10X e pre-camera oculare). Utilizzare set di filtri Rhodamine / TRITC normali (eccitazione 450-490 nm, emissione> 515 nm). Registrare il frame rate e pixel la risoluzione effettiva delle sequenze di immagini risultanti. Record di almeno 200 (idealmente circa 300) le immagini per stack, per garantire l'analisi di successo della velocità del flusso.
- Rifornire perdita di liquidi negli animali iniettando circa 1 ml di soluzione fisiologica ip ogni hr.
NOTA: Le impostazioni sperimentali che coinvolgono un intervento, ad esempio,un farmaco che modifica la velocità del flusso sanguigno in una metastasi del cancro polmonare, richiede misurazioni ripetute di velocità del flusso sanguigno nel tumore metastatico polmonare. Per questi esperimenti estesi, è importante ricostituire l'animale con sufficiente liquido. - Euthanize animali per infusione di 3 ml di 3N KCl nella vena della coda
- Valutare le pile di immagini utilizzando una pubblicazione, pubblicamente disponibile algoritmo computer basato su Matlab che creerà il flusso di velocità in scala di grigi ea colori codificati mappe per tutto il flusso di sangue tracce 10,11. Successivamente valutare le risultanti immagini in scala di grigi utilizzando software di analisi dell'immagine commerciale o pubblicamente disponibili, come ad esempio Immagine J, dopo thresholding off valori che indicano nessun movimento di cellule del sangue, cioè non vascolare attiva.
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Representative Results
La vascolarizzazione nei tumori solidi è noto a differire significativamente da normale apporto di sangue, mostrando maggiori gradi di tortuosità, e superiori distanze InterVascular 13. Di conseguenza, le tracce del flusso sanguigno nel cancro al seno e sarcoma metastasi polmonari sperimentali hanno forme irregolari e grandi lacune InterVascular (figura 2A, inferiori di due pannelli) rispetto alla microcircolazione polmonare normale (Figura 2A, pannello superiore). In uno studio precedente, la capacità del metodo della finestra polmonare è stata dimostrata effettuare misurazioni automatizzate di cambiamenti nella velocità del flusso sanguigno nei polmoni normali 10. Al fine di verificare se il metodo della finestra polmonare può anche misurare un aumento della velocità del flusso sanguigno in metastasi polmonari, la combinazione del farmaco efedrina farmaco simpaticomimetici e il blocco ambrisentan endotelina recentemente trovato per aumentare la circolazione microvascolare in polmoni sani,è stato applicato qui (dati in esame altrove). In questo studio, la capacità del metodo è illustrato per rilevare un aumento della velocità del flusso sanguigno in metastasi polmonari di sarcoma del mouse, causato dal trattamento con la combinazione di efedrina (20 mg / kg) e il ambrisentan antagonista del recettore dell'endotelina (0,5 mg / kg, entrambi i farmaci per via intraperitoneale, Figura 2B). Ogni punto rappresenta i dati aggregati medie individuali di tre misurazioni con intervalli di cinque minuti, media delle dati acquisiti in cinque animali. La prima iniezione significativamente (p <0.01) aumentata velocità del flusso sanguigno nella zona del tumore da 0,61 ± 0,12 millimetri / sec a 0,74 ± 0,19, mentre la seconda iniezione mantenuta la velocità di flusso elevata a 0,74 ± 0,19 millimetri / sec (). La seconda iniezione non ha provocato un ulteriore aumento della velocità del flusso sanguigno. N = 5, tutte le statistiche: misure ripetute ANOVA.
Figura 1:. Procedura per preparare un ratto polmone metastasi-cuscinetto per l'imaging microscopia dal vivo (A) immagine microCT di una metastasi polmonari cuscinetto ratto (freccia) (B) cornice della finestra polmonare (C) Rat con perforazione della parete toracica e finestra polmonare.. allegati. (D) dispositivo di ritenuta per limitare Z-direzionale movimento del torace. (E) Rat con camera finestra e dispositivo frenare al microscopio a fluorescenza. Nota: Pannello C ed E mostrano capelli tenendo ratti Sprague Dawley, non atimici topi nudi.
Figura 2: Quantificazione di aumento del flusso sanguigno di metastasi polmonari. (A) direzione del flusso di sangue e la velocità in un normalepolmone e una metastasi del cancro da MDAMB-231 e mouse sarcoma. La colonna a sinistra contiene istantanee di immagine serie di micrografie fluorescenza. Alveolae può essere identificato come parte del modello fluorescenza di fondo nei polmoni normali (pannello superiore). Le metastasi può essere situato dalla fluorescenza causata da proteine fluorescenti endogene delle cellule tumorali iniettate (linea tratteggiata). Le colonne a destra:. Mappe colori codificati di direzione del flusso sanguigno (indicatore di colore ruota segna la direzione verso la quale le cellule flusso) e velocità del flusso, misurata in mm / secondo (B) Variazioni microcircolatorio flusso sanguigno dopo ripetute iniezioni di efedrina combinato ambrisentan (20 e 0,1 mg / kg per iniezione). Un aumento significativo della velocità di flusso generale (misure ripetute ANOVA, p <0,01) è stato osservato dopo la prima iniezione, ma non dopo il secondo (N = 5).
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Discussion
Un modello che viene presentato è fattibile immagine cambia in microcircolazione del flusso sanguigno e altri processi dinamici in metastasi polmonari di ratti, utilizzando la microscopia intravitale e analisi del flusso di sangue computazionale. Mentre altri metodi esistono per effettuare microscopia a polmoni esposte in ribcages aperti di roditori, questo modello è anche il primo ad immagine metastasi polmonari attraverso una perforazione della parete toracica in un ambiente chiuso del torace. Usando questo metodo, la fattibilità è mostrato per misurare le variazioni farmacologicamente indotte nel flusso ematico microcircolatorio di metastasi polmonari.
Due metodi di base esistono per immagine polmoni dei roditori viventi che sono perfusi da spontaneo flusso di sangue, con il contatto diretto con la superficie del polmone: modelli a torace aperto eliminano il problema di movimento costante del polmone a causa di attività respiratoria e cardiaca mediante l'applicazione di una finestra di aspirazione alla superficie del polmone, pur consentendo il resto del complesso cardiopolmonare a expe e contratto entro un open 7,14 cavità toracica. Mentre questo metodo fornisce un eccellente accesso sperimentale, le condizioni torace aperto e finestre di aspirazione introducono artefatti rispetto alle condizioni di un polmone intatto 8. In alternativa, procedure torace chiuso che lasciano la gabbia toracica sostanzialmente intatta portano la promessa di preservare le condizioni originali nella cavità toracica intatto, come l'influenza reciproca del moto cardiaca e polmonare l'uno sull'altro flusso sanguigno dinamico. Questi modelli coinvolgono tipicamente un telaio con una finestra che viene suturato alla parete toracica 15, o una membrana trasparente che viene portato a contatto diretto con la superficie polmonare contro l'essiccamento del tessuto 9. La difficoltà di negoziare il movimento cardiopolmonare per accogliere e permettere immagini di microscopia è una grande sfida tecnica delle procedure torace chiuso, e probabilmente responsabile per la scarsa diffusione globale di questa tecnica. Nel nostro caso, la combinazione diun telaio finestra possesso solido e un dispositivo di ritenuta Z-direzionale è dimostrato efficace per eliminare sufficientemente movimento laterale del polmone per consentire misurazioni automatizzate flusso sanguigno della circolazione polmonare in una finestra chiusa petto 10.
Un metodo comune per misurare la velocità del flusso di sangue dal intravitale pile di immagini microscopia è l'uso di corrispondenza spaziale dei modelli di flusso di sangue nelle immagini consecutive di un dato segmento vascolare 14. Per ridurre lo sforzo di tempo associato con l'analisi dei singoli vasi sanguigni, un algoritmo di imaging flusso di sangue è stato introdotto che produce mappe di velocità del flusso sanguigno dell'intero campo ottico 11. Oltre al vantaggio di tempo, questo metodo consente analisi spaziale simultanea del flusso sanguigno in tutto il campo ottico, indipendentemente dalla morfologia vascolare o punti di ramificazione. Ciò è particolarmente importante quando si studia il microambiente tumorale, in cui più vasi sanguigni contriBute a condizione d'alimentazione di una data area tumore 13,16,17. In effetti, la tortuosità nota di tumore vascolare e l'esistenza di grandi lacune InterVascular può essere visto chiaramente in entrambi i tipi di cancro metastatico che sono stati studiati, (Figura 2a). Il metodo della finestra polmonare è stato anche testato per la sua capacità di segnalare variazioni di velocità del flusso di sangue nella lesione metastatica, misurando l'effetto di un trattamento farmacologico che è stato recentemente trovato per aumentare la velocità del flusso di sangue in circolazione polmonare: l'efedrina farmaco ipertensivo aumenta la gittata cardiaca, mentre la ambrisentan bloccante dei recettori dell'endotelina riduce il tono arteriolare pre-capillare, che si traduce, quando i farmaci sono somministrati in combinazione, in aumento velocità del flusso sanguigno nei capillari polmonari. Anche se questi dati sono attualmente allo altrove, la capacità della combinazione di un farmaco ipertensiva e un antagonista del recettore dell'endotelina per aumentare muscolare perifericoperfusione è stato pubblicato in modo indipendente 18. Mentre in condizioni normali, un aumento dose-dipendente della velocità del flusso di sangue può essere osservata dopo due iniezioni, il fatto che la seconda iniezione non porta ad un ulteriore aumento della velocità del flusso in metastasi sarcoma potrebbe derivare dal fatto che i vasi tumorali massima vasodilatazione è già stato raggiunto dopo la prima iniezione combinata di efedrina e ambrisentan.
Le seguenti limitazioni si applicano alla tecnica qui presentata: Questo protocollo è applicabile ai ratti (e teoricamente, mammiferi dimensioni simili) da circa 180 a 300 g o più. Piccoli mammiferi come i topi richiederanno modifiche speciale per accogliere l'anatomia più fragile e fisiologia della gabbia toracica. La risoluzione spaziale massima che può essere ottenuta con la tecnica presentata è teoricamente limitata solo dalla apertura numerica dell'obiettivo e lo spessore del vetrino di copertura utilizzato (~ 0.08-0,1 micron di marche normali), di obiettivi 100X, con l'uso di immersione in olio. In pratica, tuttavia, il movimento rimanente del polmone potrebbe limitare l'uso di obiettivi di alta qualità oltre 20X. Se ogni movimento autonomo del polmone viene eliminata, la risoluzione temporale della tecnica è limitata solo dal frame rate della telecamera, e la forza del marcatore fluorescente, che determina il tempo di esposizione del segnale, a circa 100 fotogrammi al sec. I seguenti ulteriori limitazioni si applicano alla tecnica presentata: da un lato, l'impostazione microscopica e computazionale attuale consente solo l'analisi della superficie di un dato metastasi. L'uso di profondità penetrante microscopia, come le strategie di imaging microscopia confocale avanzata, potrà in futuro consentire la misurazione della velocità del flusso di sangue in 3 dimensioni. Inoltre, la tecnica presentata non può, nella sua forma attuale, essere utilizzato per visualizzare ulteriori lesioni all'interno del parenchima polmonare. In terzo luogo, l'inserimento di un glaFinestra ss in contatto diretto con i vasi sanguigni attivi ha un certo potenziale di perturbare il flusso microvascolare da solo, tramite compressione spaziale dei vasi sanguigni, oppure impatto temperatura locoregionale. In quarto luogo, l'uso di un ventilatore esterno e pressione positiva nel polmone ha anche il potenziale per alterare microcircolatorio flusso polmonare. Inoltre, le aree limitate della gabbia toracica sono praticamente accessibili per le procedure chirurgiche, relativamente semplici descritte. Altre aree della superficie del polmone, come l'accesso mediale-ventrale o dorsale richiederebbe tecniche chirurgiche più elaborate, insieme con profonde perturbazioni dei biomeccanica della gabbia toracica. A causa della mancanza di alternative per microscopia di imaging per studiare microcircolatorio il flusso di sangue, importanti sviluppi ci si può aspettare nel prossimo futuro per superare questi ostacoli e di studio neoplasie ad alta risoluzione temporale-spaziale in tutte le parti del polmone roditore.
In sintesi, un metodo è presENTED per misurare i modelli di, e cambiamenti, velocità del flusso sanguigno microvascolare in metastasi superficiali del polmone di ratto. Combinando un torace chiuso modello chirurgico acuto con un metodo automatizzato per misurare la velocità del flusso di sangue in tutto il campo ottica microscopica, questa tecnica offre conservazione relativa dell'ambiente fisiologico del polmone, è in grado di rilevare variazioni di velocità del flusso ematico microcircolatorio e della direzione , ed è relativamente facile da usare. Si può prevedere che questa tecnica sarà di grande utilità per tutti i gruppi che studiano la microcircolazione di metastasi polmonari e altri processi dinamici in questa impostazione malattia in modelli di roditori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
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