Automatiseret Måling af mikrocirkulatorisk Blood Flow Velocity i lungemetastaser af rotter

Protocol

BEMÆRK: Alle dyrerelaterede procedurerne i denne protokol er tidligere godkendt af Duke University Institutional Animal Care og brug Udvalg (DUIACUC).

1. kræftcelle Kultur og Injection

1. Dyrk fluorescensmærkede metastatiske cancerceller (f.eks humane MDAMB231-GFP brystkræftceller, gave fra Dr. Patricia Steeg, NCI, og YFP-mærkede muse sarcomaceller, gave fra Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Institut for Strålebeskyttelse Oncology) i passende dyrkningsmedium (fx Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptavidin) ved 37 ° C, indtil ca. 90% sammenflydende.
2. Trypsinisér celler, vaske dem 2 gange med PBS, tælle, og derefter injicere dem i halevenerne isofluran-bedøvet 10 uger gamle kvindelige nøgne rotter ved 5 millioner celler pr dyr, ved hjælp af en sprøjte med en 27 G nål. Kirurgiske niveau anesthesIA er kontrolleret af den manglende reaktion på tå knivspids.

2. Overvågning af metastaser Brug MicroCT

1. Undersøg rotter en gang om ugen ved hjælp af en mikro-CT / micro-strålerøret, at påvise tilstedeværelsen af ​​metastaser omtrent over 2 mm i diameter i diameter. Mikro-CT er bestilt som tidligere beskrevet ^12.
   1. Om rotter til 3% isofluran anæstesi før billeddannelse. Bekræft dyb anæstesi ved tå knivspids.
   2. Efter indtræden af ​​anæstesi, hurtigt overføre rotter til den billeddannende vugge i imaging kammer og tilsluttes via en næse-kegle til en isofluran-luft blanding ved 2,5-3%. Juster placeringen af ​​rotte i holderen på en måde, dens Brystkassen anbringes i foton stråle af MicroCT scanner, ved hjælp udlandsstillingen kontrol og laser skilletegn på imaging vugge. Sørg døren til billeddannelse kammeret er lukket, at skærme investigator fra gammastråler.
   3. Styre positionen af ​​dyret igen medfarven videokamera. Udfør en lav opløsning CT billeddannelse prøvekørsel og bruge det resulterende billede for at justere synsfeltet til XYZ dimensioner brysthulen.
   4. Billede rotte thorax ved hjælp af en 2 mm Al filter ved 40 kVp, 2,5 mA, og 0,008 voxel 7 FPS og returnere dyret til sit bur. Imaging af et dyr bør tage højst 15 eller 20 minutter. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje.
   5. Bekræft metastaser ved fremkomsten af forholdsvis røntgenstrålingsuigennemskinnelige objekter, der ikke kan forklares ved intrathorakale blodkar (figur 1A)

3. Vindue Chamber Surgery

1. Anæstesi, vitale tegn og halevenen kateterisation
   1. Vælg dyr med tilstedeværelse af metastatisk sygdom. Injicer dyr med en intraperitoneal dose på 50 mg / kg pentobarbital. Bekræft kirurgisk niveau anæstesi ved tå knivspids, før du fortsætter.
      Bemærk: Anæstesi protokoller bør modsvares til den respektive forsøgsopstillingen. Pentobarbital blev valgt her som en langtidsvirkende bedøvelsesmiddel, med henblik på at fremkalde dyb anæstesi for langvarige procedurer, samtidig med at muligheden for facile re-dosering. Men tabet af dyr overdosering er et fælles problem med pentobarbital anæstesi. En anden mulighed, der bevarer autonome reflekser i højere grad end pentobarbital er ketamin i kombination med beroligende midler, såsom xylazin eller medetomidin, som dog tillader kun for en enkelt re-dosering cyklus.
   2. Barber dyr på den side af kroppen, der har metastatisk sygdom, og i halsområdet ved hjælp af en clipper. Tør alle resterende løse hår fra huden. Efter løse hår fjernes, anvende veterinær salve til øjnene, for at forhindre dem i at tørre ud.
      BEMÆRK: athymiske nøgne rotter kan have tilbageværende hår, vandskraveneres fjernelse før du fortsætter med kirurgiske procedurer. Det er meget vigtigt at fjerne alle håret grundigt, da det kan forstyrre med kirurgiske procedurer og billeddannelse.
   3. Fix dyret i rygleje på en metalplade, der er placeret på en 37 ° C vand, der cirkuleres varmepude. De forreste og hind ekstremiteter er fastgjort på pladen med tape.
      BEMÆRK: Det er nyttigt at kontrollere og registrere vitale tegn såsom puls og arterieblod iltning ved at bruge et pulsoximeter, hele kirurgiske og eksperimentelle procedurer.
2. Tracheal intubation
   1. For at placere et kateter til ventilation af dyret, først foretage en tværgående cervikal incision hud efterfulgt af median separation af den langsgående muskulatur ventral til luftrøret.
   2. Brug gentagen åbning til-lukning handling med en skarp pincet til at skabe en passage for suturen gennem den dorsale side af luftrøret.
   3. Lav et lille snit i trachea på Than ventrale side, ikke mere end semi-cirkulært, omtrent mellem den anden og tredje tracheale ring. Efterlad en tilstrækkelig lang del af luftrøret eksponeret på den dorsale overflade, for at muliggøre fiksering af tracheale kateter.
   4. Indsæt en 2,5 til 3,0 mm "Y" luftrør kanyle i luftrøret, og stram med en 4-0 monofilament sutur. Sørg kanylen er forbundet til et tryk cyklisk ventilator med en flaske forbundet med udløbet kanal, der er fyldt med 6 cm vand, for at opretholde en positiv pulmonal tryk. Indstrømmende gas bør være 100% ilt, medmindre eksperimentelt ønsket andet.
   5. Indsæt et kateter med en 25-27 G nål, og fyldt med hepariniseret saltvand ind i en af ​​halevenerne af rotter, og fastgør med tape.
      Bemærk: Sørg åbenheden af ​​halevenen kateteret under hele proceduren ved gentagen injektion af en lille mængde af hepariniseret saltvand i halevenen. Også oro-trakealintubation, dvs. vejledning af en trachealrør via munden af ​​bedøvede dyr og forbi strubehovedet i luftrøret, er et muligt alternativ til tracheotomi procedure, der er beskrevet her. Men denne metode kræver særlig uddannelse og erfaring, at undgå beskadigelse af luftrøret og også at udelukke utilsigtet kanylering af spiserøret.
3. Anvendelse af pulmonal vindue
   1. Fjern skindet fra den side af brystet, hvor metastatisk sygdom er beliggende, ved at skabe et indsnit og derefter afmontere huden ved stump dissektion.
      Bemærk: Huden kan udskæres og fjernes efter udstationeringsprocedurer
   2. Fortsæt ved at dissekere de to lag af overliggende muskulatur (pectoralis, serratus, og latissimus dorsi), men forlader mellemsiddende muskler intakt. Opret en perforering i brysthulen på ca. 1,5 cm i diameter, ved at fjerne dele af typisk to tilstødende ribber. Ideelt skal du finde perforering i regionens af den sjette og syvende rIBS.
   3. Osteotomi:
      1. For at minimere blødning og skader på lungeoverfladen, stramt holde ribben skal skæres med en fortandet kirurgisk pincet under skæring. Anvendelse af kirurgiske sakse, skæres den mediale side af ribben første, i en vinkel på ca. 45 °, hvorefter den spidse side af resterende rib knogle peger udenfor.
      2. Efterfølgende sender den laterale side af ribben knogle på en lignende måde, igen forlader den spidse side af ribben knogle peger udad, for at forhindre beskadigelse lungeoverfladen.
      3. Gentag proceduren for den tilstødende ribben, skær mellemsiddende muskler og fjern det udskårne stykke. Under denne procedure opretholde lunge tryk på en måde, mekanisk samspil mellem lungeoverfladen og brystkassen minimeres. Gør dette ved passende regulering af inspiration pres på ventilatoren.
   4. Montering af vindue:
      1. Indsæt en skræddersyet lunge vindue, der består af et dækglas, der erfastgjort til en plexiglas socket (figur 1B). Fastgør vinduet til stikket ved limning, eller ved at påføre en meget lille mængde vakuum fedt. Sæt vinduet på en sådan måde, at overfladen metastaser er placeret tæt på midten af ​​vinduet. Om nødvendigt justeres den indsatte hul for at bringe mikrometastase til midten af ​​vinduet ved at forstørre hullet en smule til den respektive side.
         BEMÆRK: Metastatisk sygdom på pleural overflade kan identificeres som klart genkendelige hvide prikker eller områder inden for de ellers lyserøde-til-laks farvede sunde dele af lungeoverfladen der vises overvejende langs sprækker. Mens micrometastases kan forekomme på andre områder af pleural ydre, de undersøgte cellelinier næsten altid vise belægning mikrometastaser i det perforerede område, når metastatisk sygdom kan radiologisk påvises.
      2. Efter indsættelse af stikket i perforering og skabe direkte kontakt med visceral lungehinden af ​​LUng, sutur kanterne af vinduesrammen til det omgivende intercostal muskel ved hjælp 4,0 monofilamentsutur (figur 1C). Brug en svag stigning af inspiration pres på ventilatoren for at hjælpe resterende luft at undslippe og for at skabe en tætning.
         Bemærk: Respirationshastigheden af rotter kan variere meget, afhængig af status for anæstesi, status af spænding eller angst, iltkoncentration af inspireret luft (FiO _2), etc. Det anbefales at justere respirationsraten mellem 70 og 90 bpm. Inspirationen pres bør justeres med forsigtighed og ikke sættes til mere end ca.. 8 cm _H2O (0,6 mmHg) for at undgå skader på lungeoverfladen.
   5. Placer dyret i en specialdesignet harpiksstopperen, der er designet til at fjerne Z-retningsbestemt bevægelse (figur 1D) på en stålplade, der er placeret på en termostatstyret (elektrisk) varmetæppe, under et fluorescens mikroskop. Styr dyrets kroptemperatur med en rektal termistor. Juster skruerne af dyret harpiksstopperen og inspiration pres på ventilatoren for at opnå optimal kontrol af lateral bevægelse.
      Bemærk: Naturlig vejrtrækning hos pattedyr involverer alle tre retninger af lunge bevægelse og bryst udvidelse: bilateral, dorso-ventrale og kranio-caudale. For at bevare det naturlige vejrtrækning bevægelse så meget som muligt, er det vigtigt at minimere Z-directional kompression i det nødvendige omfang. Da Z-dimensional tilbageholdenhed har potentiale til at indføre artefakter, der kan påvirke blodgennemstrømningen og andre parametre, er det tilrådeligt at holde betingelserne konstant under serie af gentagne målinger i det samme dyr.

4. Imaging og måling af mikrocirkulatorisk Blood Flow

1. Saml røde blodlegemer via hjertepunktur og mærke dem med Dil (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 = 3 = -tetramethyl-indocarbocyanin perchlorat), som tidligere beskrevet <sup> 10.
2. Injicer 300 pi af mærkede røde blodlegemer i halevenen af ​​rotte før vinduet kammer kirurgi er udført, for at undgå første passage adhæsion effekter til glasset. Eliminere eventuelle luftbobler i sprøjten eller kateteret, som indføring af luft i venen vil hæmme yderligere injektioner.
3. Billede blodgennemstrømningen med et mikroskop CCD-kamera ved -40 ° C chip afkøling temperatur og ca. 100X samlet opløsning (dvs. med et 10X mikroskopobjektiv og 10X pre-kamera okulær). Brug standard Rhodamin / TRITC filtersæt (excitation 450-490 nm, emission> 515 nm). Optag den faktiske billedhastighed og pixel opløsning af de resulterende billedsekvenser. Optag på mindst 200 (ideelt omkring 300) billeder pr stack, for at sikre en vellykket analyse af strømhastighed.
4. Påfyld væsketab i dyret ved at injicere ca. 1 ml saltvand ip hver time.
   BEMÆRK: Eksperimentelle indstillinger, der involverer en intervention, fxet stof, der modificerer blodgennemstrømningen hastighed i en pulmonal cancer metastase, kræver gentagne målinger af blodgennemstrømning hastighed i pulmonal metastatisk cancer. For disse udvidede forsøg, er det vigtigt at tilføre dyret med tilstrækkelig væske.
5. Aflive dyr ved infusion af 3 ml 3N KCI i halevenen
6. Evaluer billedet stakke ved hjælp af en offentliggjort, offentligt tilgængelige Matlab-baseret computer algoritme, der vil skabe flow hastighed gråtoner og farve kodet kort til alle blodgennemstrømning spor ^10,11. Efterfølgende vurdere de resulterende gråtonebilleder ved hjælp kommercielt eller offentligt tilgængelige billedanalyse software, såsom billede J, efter tærsklingsrutine off værdier, der angiver ingen bevægelse af blodceller, dvs. ingen aktive kar.

Representative Results

Karrene i solide tumorer er kendt for at afvige væsentligt fra normal blodforsyning, der viser større grader af snoning og højere intervascular afstande ^13. Følgelig, blodgennemstrømning spor i eksperimentelle pulmonale brystkræft og sarkom metastaser har uregelmæssige former og store intervascular huller (figur 2A, lavere to paneler) i forhold til den normale lunge mikrocirkulationen (figur 2A, øvre panel). I en tidligere undersøgelse blev evnen af pulmonal vindue metode vist sig at udføre automatiserede målinger af ændringer i blodets strømningshastighed i normale lunger ^10. For at undersøge, om den pulmonale vindue metoden også kan måle en stigning i blodets strømningshastighed i lungemetastaser kombinationen drug af Sympatomimetikum efedrin og endothelin blokker ambrisentan der for nylig blevet fundet at øge det mikrovaskulære omsætning i sunde lunger,blev anvendt her (data under revision andetsteds). I denne undersøgelse er evnen af ​​fremgangsmåden vist sig at detektere en stigning i blodets strømningshastighed i lungemetastaser af muse sarkom forårsaget af dosering med kombinationen af ​​ephedrin (20 mg / kg) og endothelinreceptorantagonist ambrisentan (0,5 mg / kg, begge lægemidler intraperitonealt, figur 2B). Hvert datapunkt repræsenterer de poolede individuelle gennemsnit af tre målinger med fem minutters intervaller, gennemsnit over de data, der er erhvervet i fem dyr. Den første injektion signifikant (p <0,01) øget blodgennemstrømning hastighed i tumoren området fra 0,61 ± 0,12 mm / sek til 0,74 ± 0,19, mens den anden injektion opretholdes den forhøjede strømningshastighed på 0,74 ± 0,19 mm / sek (). Den anden injektion fremkaldte ikke nogen yderligere stigning i blodgennemstrømningen hastighed. N = 5, alle statistikker: gentagne målinger ANOVA.

Figur 1:. Procedure for at forberede en lungemetastaser bærende rotte for levende mikroskopi imaging (A) MicroCT billede af en rotte bærende lungemetastaser (pil) (B) Pulmonal vinduesramme (C) Rat med brystvæggen perforation og pulmonal vindue.. vedlagt. (D) fastholdelsesanordningen at begrænse Z-retningsbestemt bryst bevægelse. (E) Rat med vindue kammer og fastholdende anordning under fluorescensmikroskop. Bemærk: panel C og E viser Hår bærer Sprague Dawley-rotter, ikke athymiske nøgne rotter.

Figur 2: Kvantificering af stigninger i blod strøm af pulmonale metastaser. (A) blodgennemstrømning retning og hastighed i en normallunge og en cancer metastase fra MDAMB-231 og muse sarkom. Kolonnen på venstre side indeholder snap shots fra billedserier af fluorescens mikrofotografier. Alveolae kan identificeres som en del af baggrundsfluorescens mønster i normale lunger (øverste panel). Metastaser kunne være placeret ved fluorescens forårsaget af endogene fluorescerende proteiner af den injicerede cancerceller (stiplet linje). Kolonner til højre:. Farve-kodet Kort over blodgennemstrømning retning (indikatorhjulet farve markerer retning mod hvilke celler flow) og strømningshastighed, målt i mm / sekund (B) Ændringer i mikrocirkulatorisk blodgennemstrømning efter gentagen injektion af kombineret efedrin og ambrisentan (20 og 0,1 mg / kg per injektion). En betydelig stigning i den samlede strømningshastighed (gentagne målinger ANOVA, p <0,01) blev observeret efter den første injektion, men ikke efter den anden (n = 5).

Discussion

En model præsenteres der er muligt at billedet ændringer i mikrocirkulatorisk blodgennemstrømning og andre dynamiske processer i pulmonale metastaser af rotter, der anvender intravital mikroskopi og beregningsmæssige blodgennemstrømning analyse. Mens andre metoder eksisterer for at udføre mikroskopi på udsatte lunger i åbne ribcages af gnavere, denne model er også den første til at billedet pulmonale metastaser gennem en brystvæggen perforering i en lukket kiste indstilling. Ved anvendelse af denne metode, er vist muligheden for at måle farmakologisk inducerede ændringer i mikrocirkulatorisk blodgennemstrømning af lungemetastaser.

Der findes to grundlæggende metoder til afbildning af lungerne af levende gnavere, der er perfunderet ved spontan blodgennemstrømning, med direkte kontakt til lungeoverfladen: åben bryst modeller fjerne problemet med konstant bevægelse af lungen på grund af respiratorisk og hjerteaktivitet ved at anvende en suge vindue til overfladen af ​​lungen, samtidig med at resten af ​​kardiopulmonal komplekset til expog og kontrakt inden en åben brysthulen ^7,14. Selv om denne fremgangsmåde giver fremragende eksperimentel adgang, de åbne bryst betingelser og suge vindue indføre artefakter i forhold til betingelserne i en intakt lunge ^8. Alternativt lukket bryst procedurer, der forlader brystkassen stort set intakt bærer løftet om at bevare de oprindelige betingelser i ubeskadiget brystet hulrum, såsom den gensidige påvirkning af hjerte og lunge bevægelse på hinandens blodgennemstrømning dynamik. Disse modeller omfatter typisk en ramme med et vindue, der er syet af brystvæggen ¹⁵ eller en gennemsigtig membran, der bringes i direkte kontakt med lungerne overflade for at forhindre udtørring af vævet ^9. Vanskeligheden ved at forhandle om hjerte-bevægelse til at rumme og gøre det muligt for mikroskopi billedbehandling er en stor teknisk udfordring i lukkede brystet procedurer, og sandsynligvis ansvarlig for den lave samlede udbredelse af denne teknik. I vores tilfælde er kombinationen afet fast vindue holderamme og en Z-directional fastholdelsesanordningen har vist sig virkningsfuld i tilstrækkelig grad fjerne sideværts bevægelse af lungerne for at tillade automatiserede blod flowmålinger i lungekredsløbet i et lukket bryst vinduet ^10.

En almindelig metode til at måle blodgennemstrømning hastighed fra intravital mikroskopi billedstakke er brugen af fysisk matchning af blodgennemstrømning mønstre i hinanden følgende billeder af en given vaskulær segment ^14. For at reducere den tid, indsats forbundet med analyse af fartøjer enkelt portion blod, der er indført en blodgennemstrømning imaging algoritme, der frembringer blod strømningshastighedsgradienter kort over hele det optiske felt ^11. Udover tidsfordel denne metode tillader også samtidig rumlig analyse af blodgennemstrømningen i hele optiske felt, uanset vaskulær morfologi eller forgreningspunkter. Dette er især vigtigt, når man studerer tumormikromiljøet, hvor flere blodkar contribute levering status for en given tumor område ^13,16,17. Faktisk kan den kendte snoning af tumorvaskulatur og eksistensen af store intervascular huller ses tydeligt i både metastatisk typer, der er blevet undersøgt, (figur 2A). Den pulmonale vindue Metoden er også blevet testet for sin evne til at rapportere ændringer i blodets strømningshastighed i metastatisk læsion ved at måle virkningen af ​​en farmakologisk behandling, der for nylig er blevet fundet at øge blodgennemstrømningen hastighed i lungekredsløbet: den hypertensive lægemiddel efedrin øger minutvolumen, mens endothelin receptor blocker ambrisentan reducerer præ-kapillær arteriolær tone, hvilket resulterer, når lægemidlerne gives i kombination, i øget blodgennemstrømning hastighed i pulmonale kapillærer. Selv om disse data er i øjeblikket under revision andetsteds, evnen af ​​kombinationen af ​​en hypertensiv lægemiddel og en endothelinreceptorantagonist øge perifer muskulærperfusion er blevet offentliggjort uafhængigt ^18. Mens under normale betingelser, kan der observeres en dosisafhængig forøgelse af blodgennemstrømningen hastighed efter begge injektioner, kan den omstændighed, at den anden injektion ikke fører til en yderligere forøgelse af strømningshastigheden i sarkom metastaser skyldes, at maksimal tumorkar vasodilation Der er allerede opnået efter den første kombinerede injektion af efedrin og ambrisentan.

Følgende begrænsninger gælder for teknik præsenteres her: Denne protokol gælder for rotter (og teoretisk, lignende størrelse pattedyr) fra ca. 180 til 300 g eller mere. Mindre pattedyr, såsom mus vil kræve særlig modifikation til at rumme mere skrøbelige anatomi og fysiologi brystkassen. Den maksimale rumlige opløsning, der kan opnås med den præsenterede teknik teoretisk kun begrænset af den numeriske apertur af målet og tykkelsen af ​​dækslet slide, der anvendes (~ 0.08 til 0,1 um i standard mærker), til 100x mål, med brug af olie fordybelse. I imidlertid praksis kan den resterende bevægelse af lungen begrænse anvendelsen af ​​mål høj opløsning over 20X. Hvis al selvstændig bevægelse af lungen er elimineret, er den tidsmæssige opløsning af teknikken kun begrænset af rammen på kameraet, og signalstyrken af ​​det fluorescerende mærke, der bestemmer eksponeringstiden til ca. 100 billeder pr. Sekund Følgende yderligere begrænsninger gælder for den præsenterede teknik: på den ene side, den aktuelle mikroskopiske og beregningsmæssige indstilling kun tillader analyse af overfladen af ​​en given metastase. Anvendelsen af ​​dybde-gennemtrængende mikroskopi, såsom avancerede konfokal mikroskopi imaging strategier kan i fremtiden muliggøre måling af blodgennemstrømningen hastighed i 3 dimensioner. Også den præsenterede teknikken kan ikke i sin nuværende form, der bruges til at visualisere læsioner længere inde lungeparenkym. For det tredje, indsættelse af et glass vindue i direkte kontakt med fartøjer aktive blod har nogle potentiale til at forstyrre det mikrovaskulære flow af sig selv, via fysisk komprimering af blodkar, eller ved at påvirke locoregional temperatur. Fjerde anvendelse af en ekstern ventilator og positivt tryk i lungerne har også potentiale til at ændre pulmonal mikrocirkulatorisk blodgennemstrømning. Desuden er det kun begrænsede områder af brystkassen er praktisk tilgængelige for de beskrevne, relativt ukomplicerede kirurgiske procedurer. Andre områder af lungeoverfladen, såsom medial-ventrale eller dorsale adgang ville kræve mere udførlige kirurgiske teknikker, sammen med dybtgående forstyrrelser af biomekanik brystkassen. På grund af manglen på alternativer til mikroskopi billedbehandling for at studere mikrocirkulatorisk blodgennemstrømning, kan større udvikling forventes i den nærmeste fremtid for at overvinde disse forhindringer og studere maligniteter ved høj tidslig-rumlig opløsning i alle dele af gnaver lunge.

I sammendrag, en metode presteret at måle mønstre og ændringer i, mikrovaskulære blodstrømning hastighed i overfladen metastaser af rottelunge. Kombinere en akut lukket bryst kirurgisk model med en automatiseret metode til måling af blodgennemstrømningen hastighed i hele mikroskopiske optiske felt, denne teknik giver relativ bevarelse af det fysiologiske miljø af lungen, er i stand til at detektere ændringerne i den samlede mikrocirkulatorisk blodgennemstrømning hastighed og retning og er forholdsvis let at bruge. Det kan forventes, at denne teknik vil være til stor nytte for alle grupper, der studerer mikrocirkulationen af ​​pulmonale metastaser og andre dynamiske processer i denne indstilling hos gnavermodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Athymic nude rats	Charles River	Strain code 316	Female 10 week-old athymic nude rats
micro-CT/micro-Irradiator	Precision X-ray Inc.	Xrad 225Cx	Use MicroCT to detect metastases
DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline
Rodent ventilator	Kent Scientific	TOPO Small Animal Ventilator	Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax
Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright	Zeiss	Axioskop	Microscope for intravital imaging
Andor CCD camera	Andor	iXonEM 885	CCD camera for live imaging of blood flow
Pulse oximeter	StarrLife	MouseOx	Pulse oximeter
Fluorescence microscope	Zeiss	Axioskop	Fluorescence microscope