Summary
إدخال جزيئات صغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين تقدم إمكانية كبيرة للتميز النشاط البيولوجي لمركبات جديدة، والمخدرات، والسموم، وكذلك لبحث مسارات التنموية الأساسية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة الخطوط العريضة الخطوات التي تغلب على الحواجز الطبيعية لهذا النهج، وتوسيع المنفعة من طراز الجنين ذبابة الفاكهة.
Abstract
كان الجنين ذبابة الفاكهة طويلة نموذجا مختبر قوية لتوضيح الآليات الجزيئية والجينية التي تتحكم في التنمية. سهولة التلاعب الجيني مع هذا النموذج قد حل محل النهج الدوائية التي هي شائعة في النماذج الحيوانية الأخرى والمقايسات خلية مقرها. نحن هنا تصف التطورات الحديثة في البروتوكول الذي يتيح تطبيق الجزيئات الصغيرة إلى تطوير ذبابة الفاكهة الجنين. تفاصيل طريقة الخطوات للتغلب على الكتامة من قشر البيض مع الحفاظ على سلامة الجنين. ويتحقق قشر البيض permeabilization عبر مجموعة واسعة من مراحل النمو عن طريق تطبيق الموصوفة سابقا د الليمونين الجنين permeabilization المذيبات (EPS 1) والشيخوخة الأجنة في انخفاض درجة الحرارة (18 درجة مئوية) قبل العلاج. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استخدام صبغة حمراء بعيدة (CY5) كمؤشر permeabilization، وهو متوافق مع تطبيقات المصب التي تشمل انفلونزا الحمراء والخضراء القياسيةالأصباغ orescent في الأعمال التحضيرية الحية والثابتة. هذا البروتوكول تنطبق على الدراسات التي تستخدم المركبات النشطة بيولوجيا لبحث آليات التنموية فضلا عن الدراسات التي تهدف إلى تقييم النشاط ماسخة أو دوائية من جزيئات صغيرة uncharacterized.
Introduction
يستمر الجنين ذبابة الفاكهة ليكون نموذجا رئيس الوزراء للتحقيق في الآليات الأساسية للتنمية 2. يتم اعتماد هذا النموذج قوية من قبل مجموعة واسعة من الأدوات الجينية الجزيئية التي تسمح التلاعب من الأساس أي الجينات في أي نقطة زمنية وضمن أي جهاز النامية. حجم صغير، والتطور السريع، وتوصيف واسعة من التشكل الجنين ذبابة الفاكهة جعله نموذجا للاختيار للشاشات الوراثية، وكثير منها قد كشفت مسارات التنموية الأساسية 3،4. وقد اتسمت العديد من الظواهر في الجنين ذبابة الفاكهة والتأويل هي بسهولة، وغالبا ما توفر وسيلة لتحديد الآليات الوراثية الجزيئية الكامنة وراء مسؤولة عن سمة غير طبيعية.
تاريخيا، كان أحد أوجه القصور في نموذج جنين ذبابة صعوبة إدخال جزيئات صغيرة إلى الأنسجة الجنينية. لقد طرحت هذه العقبة القيود على: 1) لناجي النشطة بيولوجيا الجزيئات الصغيرة المعروفة باسم تحقيقات لاستجواب الآليات التنموية و2) باستخدام هذا النموذج الذي أنشئ لتقييم النشاط ماسخة أو دوائية من جزيئات صغيرة uncharacterized. نتيجة لذلك، لم تستغل استغلالا كافيا إمكانية فحص الجنين ذبابة في توصيف النشاط جزيء صغير.
تسليم الجزيئات الصغيرة إلى الجنين ذبابة يمكن أن يتحقق مع طريقتين: 1) permeabilization من قشر البيض و2) حقن مكروي. تقدم هذه المقالة التقدم لطريقة permeabilization التي هي سهلة لتنفيذ في إعداد مختبر ذبابة الفاكهة التقليدية. تجدر الإشارة إلى أن التطورات الحديثة في طرق حقن مكروي مع التكنولوجيا على microfluidics تساهم أيضا إلى أساليب إدخال المركبات إلى 5،6 الجنين. إدخال جزيئات إلى الجنين والوقاية منها عن طريق طبقة شمعية من قشر البيض 7. يتكون قشر البيض ذبابة الفاكهة من خمس طبقات. منالداخل الى الخارج وهم: الغشاء المحي، وطبقة شمعية، وطبقة المشيمية الداخلية، وباطنة المشيماء ومشيماء أديمية ظاهرة 8. يمكن إزالة طبقات المشيمي الخارجي الثلاثة الطلوع وجيزة من الجنين في تمييع التبييض، ويشار إليها باسم خطوة dechorionation. ويمكن بعد ذلك للخطر طبقة شمعية كشفها بواسطة التعرض للمذيبات العضوية، مثل هيبتان واوكتان 7،9، مما يجعل الجنين dechorionated قابلة للاختراق، في حين لا يزال المغطى في الغشاء المحي الأساسية. ومع ذلك، واستخدام هذه المذيبات يدخل المضاعفات الناجمة عن سميتها وصعوبة في تنظيم عملها permeabilizing قوية، وكلاهما له آثار سلبية على سلامة الجنين صارخ 9،10.
وثمة طريقة permeabilization باستخدام تكوين الجنين يطلق permeabilization المذيبات (EPS) التي سبق وصفها 1. يتكون هذا المذيب من د الليمونين والمشتقة من النباتات، التي تمكن السطحي المذيب لتكون misciblالبريد مع مخازن مائي. سمية منخفضة من د الليمونين والقدرة على تمييع المذيبات لتركيزات المطلوب قد حقق وسيلة فعالة لتوليد أجنة قابلة للاختراق مع قابلية عالية 1. ومع ذلك، فقد استمرت اثنين من العوامل الذاتية لتحقيق القيود على التطبيق. الأولى، إثبات عدم التجانس الأجنة في نفاذية بعد العلاج EPS، حتى عندما يتم الحرص على الحفاظ على التدريج التنموية وثيق. الثانية والأجنة أثبتت مضى عليها أكثر من ثماني ساعات تقريبا الصعب permeabilize، بما يتفق مع تصلب قشر البيض الذي يحدث بعد وضع البيض 11.
الموصوفة هنا هي التقدم في طريقة EPS ما يلي: 1) المساعدة في تحديد وتحليل الأجنة permeabilized شبه مماثل، حتى بعد تنفيذ الخطوات التثبيت والمناعية و2) تمكين permeabilization الأجنة في وقت متأخر من النقاط الزمنية التنموية (> 8 ساعة، المرحلة 12 وما فوق). على وجه التحديد، وتطبيق صبغة الحمراء بعيدة،حمض الكربوكسيلية CY5، يوصف يخدم كمؤشر النفاذية، والتي استمرت في الجنين خلال تطوير والفورمالديهايد بعد التثبيت. بالإضافة إلى ذلك، وتبين أن تربية الأجنة عند 18 درجة مئوية يحافظ على قشر البيض في حالة حساسة EPS، وتمكين permeabilization الأجنة في المراحل المتأخرة (12-16 المراحل).
هذه التطورات التغلب على القيود التي سبق ذكرها للمنهجية EPS. وبالتالي فإن هذا التطبيق توفير المحققين مع وسيلة لإدخال جزيئات صغيرة من الفائدة إلى الجنين في نقاط متميزة الوقت التنموية مع الحفاظ على قدرتها على البقاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحضير للثقافات يطير، حلول وأجهزة المناولة الأجنة
- إعداد الأقفاص من ذبابة الفاكهة. وضع 500 + الذباب التزاوج من سلالة المطلوب في قفص السكان مزودة 10 سم لوحة آغار العنب وبقعة من معجون الخميرة. الحفاظ على الثقافة في حاضنة تسيطر 25 درجة مئوية الرطوبة. ملاحظة: الثقافات القفص تتطلب يوم او يومين من تكييف للحصول على جنين زرع أنماط متناسقة. يتم تغيير لوحات العنب مع عجينة الخميرة مرة واحدة في الصباح ومرة في المساء خلال تكييف.
- إعداد EPS. حلول الدافئة السطحي (كوكاميد DEA والكحول سلس) في 37 درجة مئوية. ماصة 18 مل من د الليمونين إلى قارورة زجاجية التلألؤ مجهزة بقضيب الصغيرة. ماصة 1 مل كل من اثنين السطحي (5٪ تركيز النهائي من كل منهما) إلى د الليمونين. تخلط جيدا وإزالة بقضيب. ملاحظة: هذا الحل الأسهم EPS من هو جيد لحوالي 2 أشهر في درجة حرارة الغرفة. الحليجب أن تكون درجة حرارة عند 37 درجة مئوية وملتف إلى ذوبان كامل السطحي قبل استخدامها. يجب أن يتم تخزين EPS ود الليمونين في وعاء زجاجي لأنها سوف تذوب بعض المواد البلاستيكية على مر الزمن.
- إعداد حل الجنين dechorionation، وسائل الحضانة، وصبغ والحلول المخدرات. خلط 25 مل من التبييض مع 25 مل H 2 O ووضعه في طبق ضحل. إعداد تعديل المتوسطة الأساسية الحضانة (MBIM) وMBIM-T وفقا لصفة قبل 1،12. إعداد شيلدز وسانغ M3 خلية مستنبت وبرنامج تلفزيوني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر قائمة المواد). إعداد محلول المخزون من permeabilization الصبغة في 10 ملي التركيز في DMSO.
- تجميع الأجهزة الجنين للمناولة واللوازم:
- إعداد dechorionation وسلة العلاج EPS (انظر الشكل 1A). قطعت قسما 3 سم من المتاح البولي بروبلين 50 مل الطرد المركزي / الثقافة أنبوب مع منشار ذو أسنان غرامة. جعل دافق سطح اللحام عن طريق فرك قسم أنبوب على الالتزام الصنفرةعلى سطح الفوق. لحام المقطع أنبوب لNitex شبكة من النايلون من قبل ذوبان حافة الباب أنبوب فوق لهب والملحة إلى شبكة على لوحة زجاجية. السماح لتبرد وتقليم قبالة شبكة إضافية. ملاحظة: ان الجانبين الهائل وأسفل تسمح الشطف السريع والكامل الخروج من التبييض المتبقية وEPS في الخطوات منها. وينبغي القيام بالخطوات اللحام تحت غطاء الدخان.
- إعداد سلة التنمية. قطع الجزء العلوي من أجهزة الطرد المركزي 50 مل / الثقافة أنبوب تدفق مع حافة الغطاء. إزالة وتعديل الحد الأقصى عن طريق الاستغناء عن افتتاح المركزية والشقوق على طول الحافة كما هو مبين في الشكل 1B. المسمار الغطاء على شبكة وعلى المواضيع من قطع أنبوب الباب وتقليم شبكة إضافية. ملاحظة: غطاء يحتوي على الشقوق في حافة تسمح نشرها إلى متوسطة الأكبر عند وضعه في خزان صحن 60 ملم (الشكل 1B).
- إعداد مكونات غرفة الشريحة. قطع مربع من الغشاء DO أكبر منغرفة فتح الشريحة. تطبيق طبقة رقيقة جدا من الشحوم فراغ إلى الشفة داخل فتح. يلصق غشاء DO في افتتاح ختم ضد الشحوم مع عصابة التجنيب. تقليم الغشاء DO الزائدة عن طريق خفض إعادته بالقرب من الدائري التجنيب. ملاحظة: مواصفات غرفة الشريحة يمكن العثور عليها في Kiehart 13 آخرون هذه الغرفة ليست متاحة تجاريا ويتطلب تصنيع مخصصة من قبل ورشة ميكانيكا.
2. السقالات وDechorionation، والعلاج EPS من الأجنة
- التدريج الأجنة عن طريق جمع في الوقت المناسب. ضبط لوحة العنب / الخميرة الطازجة إلى الأقفاص ذبابة في AM. تسمح الأجنة لتكون وضعت لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. تجاهل هذه اللوحة واستبدالها مع لوحة العنب / الخميرة الطازجة لزرع الجنين اللاحقة من 2 ساعة على 25 درجة مئوية. جمع هذه اللوحة والمكان في 18 درجة مئوية حاضنة لمزيد من التدريج التنموية. ملاحظة: 1 ساعات التنمية في 25 ° C يساوي 2 ساعة للتنميةفي 18 درجة مئوية. ويمكن رؤية تأثير الشيخوخة عند 18 درجة مئوية مقابل 25 درجة مئوية على الحفاظ على permeabilization EPS في الأجنة مرحلة متأخرة في الشكل 2.
- Dechorionation. شطف بلطف الأجنة الخروج من لوحة العنب في سلة وشبكة باستخدام 25 ° C ماء الصنبور والفرشاة. شطف الخميرة الزائدة بعيدا عن الأجنة في سلة تحت تيار لطيف من ماء الصنبور. تزج في سلة 50٪ التبييض لمدة 2 دقيقة. غسل الأجنة بدقة تحت تيار من مياه الصنبور. ملاحظة: بخ بلطف محلول التبييض على أجنة بشكل متقطع باستخدام ماصة بلاستيكية. بينما 2 دقيقة وعادة ما يكفي لdechorionation كاملة، يجب فحص هذه المرة الحضانة عن طريق الفحص المباشر وتبعا لذلك. الحفاظ على الأجنة dechorionated في سلة مغمورة في مياه الحنفية والشروع فورا في خطوة EPS.
- علاج EPS
- إعداد ستة أطباق 60 ملم مع حوالي 10 مل من برنامج تلفزيوني في كل منهما. إعداد التخفيف عن طريق إذابة EPS 75 EPS ميكرولتر في 2.925 مل MBIM (1:40) في دورق 50 مل الزجاج مع دوامات. ملاحظة: A أشكال مستحلب الأبيض من هذا الخليط.
- وصمة عار المياه الزائدة من أسفل السلة مع شبكة مختبر قضاء. تزج في سلة EPS المخفف في كوب ودوامة فورا لتفريق الأجنة في حل EPS في أسفل السلة. تواصل يحوم الحركة لمدة 30 ثانية. ملاحظة: التخفيفات EPS ومرات التعرض يمكن أن تختلف على السيطرة النفاذية. فمن المستحسن أن التخفيفات EPS الأمثل ومرات العلاج تنشأ تجريبيا مع سلالات الذباب المستخدمة. زيادة وقت التعرض إلى 60-90 ثانية مواتية لمرحلة 12 و الأجنة السن.
- إزالة سلة، وصمة عار بعيدا EPS الزائدة مع مختبر قضاء. المضي قدما مع ست يغسل متتابعة في 10 مل من برنامج تلفزيوني في أطباق 60 ملم. استخدام ماصة بلاستيكية لبخ بلطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني في كل من ستة يغسل. المضي قدما لصبغ وخطوات العلاج من تعاطي المخدرات. ملاحظة: EPS يمكن التخلص من أسفل الحوض.
3. صبغ والدواء علاج Permeabilized الأجنة
- صبغ العلاج
- إضافة 5 ميكرولتر من 10 ملي CY5 الكربوكسيلية حمض صبغ * إلى 1 مل من MBIM-T (50 ميكرومتر تركيز النهائي) في أنبوب 1.5 مل microfuge ودوامة لخلط. ملاحظة: * اختيار الصبغة يعتمد على تحليل المصب. حمض الكربوكسيلية CY5 فعالة للتحليلات لاحقة باستخدام التثبيت والمناعية. رودامين B مفيد لتحليل الأجنة الحية. انبعاث الحمراء رودامين B، والانبعاثات الخضراء من عناصره 1، يمكن تقديم بعض التعقيدات مع تطبيقات المصب باستخدام مضان. المخدرات أو السم يمكن أن تضاف إلى محلول الصبغة لبدء العلاج في هذه المرحلة، أو للحد من العلاج من تعاطي المخدرات / السم لنبضة في هذه المرحلة. ينبغي توخي الحذر في التعامل معها والتخلص من المخدرات والسموم وفقا لمعايير السلامة MSDS والبيئية.
- نقل الأجنة من سلة شبكة لمحلول الصبغة باستخدام الفرشاة. غطاء الأنبوب وعكس بشكل متكرر لضمانالأجنة تطفو بحرية في تعليق في محلول الصبغة. وضع أنبوب على الكرسي الهزاز الإيماء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة أنبوب من nutator والسماح الأجنة تسوية. إزالة محلول الصبغة مع ماصة غرامة واستبدالها مع 1 مل من MBIM-T لغسل. عكس أنبوب لاعادة تعليق أجنة تماما. دعونا الأجنة تسوية وكرر مع ثلاثة يغسل MBIM-T. إزالة كافة MBIM-T من شطف النهائي، والشروع في الخطوة الحضانة.
- الحضانة للتنمية الأجنة
- نقل الأجنة إلى واحدة من مجلسين: سلة التطوير أو غرفة الشريحة. ملاحظة: يفضل سلة التنمية لفترات أطول التنموية، ومطلوب إذا تثبيت والمناعية الخطوات اللاحقة ليتم تنفيذها. غرفة الشريحة هو الأمثل لدقة أعلى الوقت الفاصل بين التصوير والأكثر فعالية لفترات قصيرة التنموية (على سبيل المثال، فإن الأحداث الجنينية المبكرة). المخدرات أو السم يمكن أن تضاف إلى متوسطة على مختلف تركيزات والجنين ديمكن رصد التطور، في الوقت الحقيقي مع أجنة حية أو في نقطة النهاية باستخدام التثبيت القياسية والمناعية البروتوكولات.
- التنمية في سلال
- تنظيف سلة التنمية من خلال التدفق مع الايثانول 70٪، وشطف جيدا مع غير المتأينة المياه وصمة عار الجافة مع مختبر قضاء. إعداد 6 مل من الحضانة المتوسطة مع التركيز المطلوب من المخدرات أو السم. وضع سلة التنمية في المتوسط 60 ملم في أخذ الطبق الحرص على عدم اعتراض فقاعات الهواء تحت قاعدة شبكة. ملاحظة: يتم استخدام اثنين من وسائل الإعلام شيوعا: MBIM وحده، أو MBIM/M3 في 50:50 الخليط، وهذا الأخير هو أكثر فعالية لفترات أطول التنمية.
- نقل الأجنة permeabilized لشبكة السطحية في قاعدة سلة مع الفرشاة. بخ بلطف الأجنة مع وسائل الاعلام من الخزان المحيطة بها. تفريق الأجنة مع الفرشاة بحيث تكون في أحادي الطبقة على شبكة. ملاحظة: الشروع في التصوير المجهري وتقييم الجدوى permeabilization وخصائص العلاقات العامةeparation (راجع الخطوة 4).
- التنمية في غرفة الشرائح
- عكس غرفة الشريحة وتطبيق حبة صغيرة من الشحوم فراغ على محيط الافتتاح. وضع 150 ميكرولتر من المتوسطة مع المبلغ المطلوب من المخدرات أو السامة على سطح غشاء DO داخل فتح. ملاحظة: يتم استخدام اثنين من وسائل الإعلام شيوعا: MBIM وحده، أو MBIM/M3 في 50:50 الخليط، وهذا الأخير هو أكثر فعالية لفترات أطول التنمية.
- نقل الأجنة permeabilized إلى تراجع وسائل الإعلام مع الفرشاة. تفريق الأجنة جعلها تستقر على الغشاء داخل قطرة.
- تطبيق بعناية ساترة 25 مم دائريا فوق افتتاح بالتالي تسطيح المتوسط. اضغط برفق على طول محيط ساترة على شكل خاتم مع الشحوم. ملاحظة: الشروع في التصوير المجهري لتقييم الجدوى permeabilization وخصائص إعداد (راجع الخطوة 4).
4. Identification من Permeabilized الأجنة قابلة للحياة
- تحديد الأجنة permeabilized. مراقبة الأجنة تحت المجهر epifluorescence مع مجهزة بكاميرا رقمية. الحصول على صور (في الموجة الزرقاء لتحديد الملف الشخصى صفار تألق ذاتي) من عدة حقول باستخدام المجهر الثابتة وإعدادات الكاميرا.
- تحديد permeabilization الأجنة على أساس كثافة مضان النسبي. استخدام stereomicroscope مع مسافة عمل كبيرة لاستيعاب سلة والسماح التلاعب في الأجنة. يجب أن تكون مجهزة المجهر مع مرحلة XYZ برمجة، epifluorescence إضاءة وكاميرا رقمية. الصورة الأجنة مع الحرص على تسجيل التعرض والمعلمات موقف المرحلة من كل صورة الجنين لتمكين إعادة تقييم نفس الأجنة في نقطة وقت لاحق (انظر نتيجة ممثل في الشكل 3). ملاحظة: سوف أنماط امتصاص الصبغة تختلف تبعا الصبغة المستخدمة، وطول العمر والتعرض الجنين. هناك مجموعة واسعةامتصاص الصبغة عبر إعداد واحد هو نموذجي ويعكس الاختلاف في درجة permeabilization.
- تحديد الأجنة قابلة للحياة. بعد وسم موقف الأجنة permeabilized، متابعة تطور الجنين في درجة حرارة الغرفة أو 25 درجة مئوية. العودة سلة أو غرفة الشريحة إلى المجهر. مراقبة تحت الأزرق قناة مضان والحصول على صورة من تألق ذاتي صفار في الأجنة التي تم تحديدها سابقا permeabilized. تقييم الجدوى وفقا لتطور الطبيعي للتوزيع صفار (انظر راند وآخرون (1) ونتيجة ممثل في الشكل 3). ملاحظة: معالم شكلية أخرى من الجنين لاحظ مع brightfield المجهري يمكن استخدامها لتقييم الجدوى. فمن المستحسن أن تحديد مستوى النفاذية والتي تتوافق مع قابلية أن تحدد تجريبيا مع كل صبغة وسلالة من ذبابة المستخدمة.
- تقييم آثار المخدرات أو السموم في أجنة قابلة للحياة permeabilized.
- الأجنة اإلجراءاتssed مع تستعد البروتوكول أعلاه لعدد من التحليلات التقليدية لاحقة إلى المخدرات أو التعرض للسموم. وتعتبر العديد من أنواع مختلفة من التحليلات في مناقشة أدناه وتشمل الملاحظة المباشرة من التشكل في الأجنة الحية وكذلك يحلل آخر تثبيت-المناعية. يتم تحسين كلا من هذين النهجين باستخدام الأصباغ الحيوية (مثل GFP) التي تكشف عن أنماط التعبير الجيني والنسب الخلية وملامح التشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم التعامل مع الأجهزة في الصورة الجنين في الشكل رقم 1 للمساعدة في تصور الأجهزة "محلية الصنع" للتلاعب في البروتوكولين أعلاه. النتائج رأينا في الشكل 2 يوضح تأثير قوي من تربية الأجنة عند 18 درجة مئوية على قدرتها على أن permeabilized بواسطة EPS في مراحل متأخرة من التنمية. يتم تطبيق هذا الشرط في الخطوة بروتوكول 2.1. وينظر فعالية حمض صبغ CY5 الكربوكسيلية للكشف عن مستويات مختلفة من نفاذية ينظر عادة في EPS الأجنة المعالجة في الشكل 3. وينظر إلى ديناميات التنموية للتوزيع الصبغة في صفار أيضا في الشكل 3، وكشف عن المعيار المستخدم لتقييم الجدوى ، كما هو موضح في البروتوكول الخطوة 4.2. ويتضح فائدة الصبغة CY5 في تحديد الجنين permeabilization اللاحقة للعلاج السم، والفورمالديهايد التثبيت والمناعية عن طريق النتيجة في الشكل 4.
: together.within المحافظة على صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. التعامل مع الأجنة الأجهزة للأسلوب EPS. يتم استخدام سلة مسطحة القاع في dechorination وربحية السهم الخطوات التعرض (A، A '). يتم استخدام سلة لتطوير التعرض التنموية أطول من الجنين permeabilized (B، B '). يتم استخدام غرفة شريحة لحالات التعرض التنموية أقصر ودقة أعلى تصوير الأجنة الحية (C، C '. انظر النص لمزيد من الوصف).
الشكل 2. تأثير الشيخوخة عند 18 درجة مئوية على كفاءة العائد على السهم في الأجنة مرحلة متأخرة. تم جمع الأجنة لمدة ساعتين تليها الشيخوخة عند 18 درجة مئوية لمدة 20 ساعة (ألواح AA "،
الرقم 3. إدراج CY5 في أجنة قابلة للاختراق وقابلة للحياة. تم جمع الأجنة عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة والعمر لمدة 14 ساعة عند 18 درجة مئوية (أي ما يعادل 7-9 أجنة ساعة عند 25 درجة مئوية، ومرحلة 12). بعد dechorination، EPS تم علاج (1:40 في MBIM لمدة 1 دقيقة)، يليه الحضانة في CY5 صبغ (50 ميكرومتر في MBIM-T لمدة 15 دقيقة). تم غسلها ثلاث مرات في الأجنة MBIM-T ونقلها إلى سلة التنمية مع MBIM في الخزان. سمح التنمية عroceed لمدة 8 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يتم تصوير امتصاص CY5 (الأحمر) في القناة الحمراء بعيدة فورا بعد العلاج صبغ والغسل (لوحة A) وبعد 8 تنمية الموارد البشرية (لوحة B). ويعتبر توزيع صفار تألق ذاتي من قبل في القناة الزرقاء. امتصاص الصبغة، وبالتالي النفاذية، وينظر إلى تختلف من جنين إلى الجنين. وينظر صبغ CY5 (الحمراء) في توطين للصفار (الأزرق)، والتي تصبح مركزة إلى تجويف الأمعاء في المرحلة 16 (البنفسجية، لوحة B).
الشكل 4. تحديد permeabilization وميثيل الزئبق الآثار في الأجنة الثابتة وimmunostained. تم جمع الأجنة عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة والذين تتراوح أعمارهم بين 14 ساعة عند 18 درجة مئوية (أي ما يعادل 7-9 أجنة ساعة عند 25 درجة مئوية، ومرحلة 12). بعد dechorination، وقد تم علاج EPS (1:40 في MBIM لمدة 1 دقيقة)، يليه الحضانة فيصبغ CY5 (50 ميكرومتر في MBIM-T لمدة 15 دقيقة) جنبا إلى جنب مع ميثيل الزئبق (50 ميكرومتر ميثيل الزئبق، لوحة B) أو DMSO التحكم المذيبات (تركيز النهائي 0.1٪، لوحة A). تم غسلها الأجنة مع MBIM-T، ووضعها في سلة التنمية مع MBIM: M3 المتوسطة في الخزان والذين تتراوح أعمارهم بين 8 لساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة. تم الأجنة ثم ثابتة في مرحلتين 4٪ بارافورمالدهيد هيبتان بإعداد بروتوكول قياسي 14. تم تنفيذ تلطيخ مع المضادة للFasciclin الثاني (الأخضر في A، B والأبيض في A '، B') لتسمية الخلايا العصبية الحركية والأجسام المضادة للelav (الحمراء في A، B) لتسمية كل أجسام الخلايا العصبية. وكشفت CY5 الصبغة بواسطة مضان المباشر، الأمر الذي يتطلب التعرض طويلة بسبب كثافة مضان تقلص بسبب التثبيت (CY5 هو شبه زرقاء اللون في جميع لوحات). وينظر إلى آثار ميثيل الزئبق في الزخرفة غير النظامية وclusteحلقة من أجسام الخلايا العصبية chordotonal الجانبي (elav إيجابية، وصفت باللون الأحمر ويرمز مع السهام البيضاء في مقابل B A). بالإضافة إلى ذلك، ينظر إلى المتفرعة من سمات قطعي (SN) (الأسهم الخضراء الصلبة في A ') لتكون متغيرة بصورة كبيرة مع ميثيل الزئبق التعرض (الأسهم الخضراء الصلبة في B ") بما يتفق مع آثار ذكرت سابقا لميثيل الزئبق على الجنين 15. وينظر الإسقاط من بين القطع والأعصاب قطعي في جذورها إلى أن النازحين الخلف مع ميثيل الزئبق التعرض (السهم الأخضر مفتوحة في B '). ملاحظة: ميثيل الزئبق هو عصبي قوي. ينبغي الحرص على ارتداء القفازات وحماية العين عند التعامل مع. وينبغي أن يتم التخلص منها من خلال منشأة سلامة البيئة المؤسسية والخدمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحدد الأسلوب أعلاه وسيلة الحصول على أجنة قابلة للحياة ذبابة الفاكهة التي هي في متناول العلاجات جزيء صغير عبر مجموعة واسعة التنموية. هذا الأسلوب يقدم الرواية والاستنتاج بسيط هو أن الشيخوخة الأجنة عند 18 درجة مئوية تمكن permeabilization الأجنة مرحلة متأخرة مع نفس فعالية كما رأينا سابقا فقط في الأجنة مرحلة مبكرة. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت استخدام CY5 الصبغة الحمراء بعيدة حمض الكربوكسيلية كمؤشر نفاذية فعالة في التطبيقات وآخر إصلاح لا تتداخل مع علامات الفلورسنت الحمراء والخضراء التقليدية التي يمكن استخدامها للكشف عن الظواهر التنموية. هذه النتائج تقدم كبير في فعالية وجدوى أسلوب EPS.
هذا الأسلوب هو قابل للتحليلات كل من المعيشة والاستعدادات الجنين ثابت. باستخدام المجهر brightfield وغرفة الشريحة إعداد، المظاهر التقليدية ليسجل في النصف الأول من تطور الجنين هي حركات مثل التخلقcellularization من الأريمة، وتشكيل ثلم رأسي، واستطالة germband وتراجع germband 1. مع GFP أو طلب تقديم العروض للصحفيين النهاية أكثر تحديدا يمكن تمييزها، مثل أنماط تجزئة المبكر وتشكيل الهياكل العصبية في تطور لاحق 1. أيضا تمكين تقارير GFP RFP ومراقبة الأحداث التنموية في العيش أجنة permeabilized في كل غرفة الشرائح والتحضيرات سلة التنموية. وهناك طريقة بسيطة لتحديد سمية الإجمالي من المخدرات الكيميائية أو تطبيق هو رصد نمط البروتين صفار صناعة السيارات في مضان في القناة الزرقاء لتحديد تأخير أو توقف التطور 1.
لديه منهجية EPS أيضا إمكانيات كبيرة لتوسيع أدوات التحقيق للحشرات غير نموذج، ولا سيما البعوض، والتي تشترك في بنية مماثلة من قشر البيض. أن تطبيق الجزيئات الصغيرة إلى الأجنة من أنواع الحشرات الأخرى تفتح سبيلا من investigatiحيث تعاني من نقص في النهج الجينية القياسية للدراسات الفنية حاليا. الأجنة وضعت في سلال يمكن معالجتها لتثبيت الفورمالديهايد، وبالتالي فتح التحليلات إلى مجموعة واسعة من الكواشف المناعية متوفرة للدراسات ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، يتطلب هذه الخطوة أن تقرير آخر من الإصلاح permeabilization يكون ممكنا لربط الظواهر مع الأجنة التي بذلت للوصول إلى المخدرات. وقد أثبت تطبيق CY5 صبغة حمض الكربوكسيلية فعالة للغاية لهذا النهج. يؤخذ حمض الكربوكسيلية CY5 بكفاءة حتى في الأجنة permeabilized (الشكل 3A). أثناء تطوير يتركز CY5 في صفار، التي عزلها في نهاية المطاف في تجويف الأمعاء في مرحلة تشكيل 14 و في وقت لاحق (الشكل 3B). بعد التثبيت، CY5 مضان انخفضت بشكل ملحوظ، ولكن يمكن كشفها بشكل موثوق في القناة الهضمية ويعمل كعلامة من تلك الأجنة التي تم permeabilized بفعالية في البداية (انظر الدقة ممثلULT الشكل 4). تجدر الإشارة إلى أن الكشف CY5 في هذه المرحلة يتطلب التعرض تعد كاميرا (على سبيل المثال، 1-4 ثواني) للكشف. وبالتالي، يمكن التهديف من الظواهر مع أنماط المناعية المضي قدما باستخدام إشارة CY5 لتأكيد الأجنة permeabilized بالمثل جنبا إلى جنب مع علامات الأنسجة محددة (على سبيل المثال، أجسام مضادة محددة العصبية رأينا في الشكل 4).
التحدي الأكبر في هذا الأسلوب هو حساسية من حيوية الجنين الى عملية permeabilization، وهو الأمر الذي قد كدر طويلة المحاولات السابقة لتطوير هذا الأسلوب 9،10،16. الجدوى اللاحقة لpermeabilization هي التي تعتمد على العمر بشكل صارخ، ويزيد بشكل كبير من كبار السن الجنين هو عليه permeabilization 9. حتى الآن، وكما بينا سابقا، يصبح نفاذية الصعب على نحو متزايد مع تقدم العمر 1. يوضح تقرير حديث الآن القدرة على permeabilize الأجنة في مرحلة متأخرة (المرحلة 14) عن طريق إعادة استدعاء-التهاب الكبدتين كمذيب بالاشتراك مع د الليمونين 17. الأداة المساعدة اسعة من هذه الطريقة الأخيرة ليست واضحة كما تميزت تأثير دواء واحد فقط (نوكودازول)، وليس وصفها التطبيق إلى الأجنة مرحلة سابقة 17. وعلاوة على ذلك، وتطبيق الخطوة التنمية C 18 ° المبينة أعلاه غلة أواخر نفاذية المرحلة ومواصلة يتجنب استخدام المذيبات العضوية السامة. فإن المحقق الذي هو جديد على بروتوكول EPS تجربة تقلب في permeabilization وقدرتها على البقاء على نتائج المحاولات الأولية. الخطوات المذكورة هنا تعطي المحقق الأدوات اللازمة لمنهجية تختلف الظروف من العلاجات permeabilization والخطوات اللاحقة الحضانة لتحسين الظروف لسلالات معينة من ذبابة الفاكهة أنهم يعملون في إعداد مختبر الخاصة بهم.
تحديا إضافيا مع الأسلوب هو التباين في امتصاص المواد الكيميائية يرى من الجنين الى الجنين. وينعكس هذا التباين في عدم تجانسامتصاص CY5 صبغ ينظر في الأجنة على الفور بعد العلاج صبغ (الشكل 3A). في المقابل، رودامين B صبغ هو أكثر بسرعة وبشكل متساو فرقت عبر الأنسجة الجنينية من CY5 صبغ (الشكل 2B "). وبالتالي، قد تكون تؤوي بعض التباين الجنين إلى الجنين في خصائص توزيع هذه المادة الكيميائية، المخدرات أو السم من الفائدة ومتأصل في الأسلوب. حيث القياس الكمي للجرعة أمر بالغ الأهمية، فمن المستحسن أن يتميز امتصاص الدواء أو المادة السامة من الفائدة من خلال الطريقة التحليلية البديلة. ومع ذلك، فإن سهولة بروتوكول أعلاه، والقدرة على فحص مئات من الأجنة، بما يسمح للمحقق لتقييم الاستجابات جرعة ويسجل الظواهر مميزة مع القليل من الموارد الاستثمارية، مما يجعل لالنهج الأول قوية لتميز المخدرات أو السموم في هذا درجة عالية من التطور نظام نموذجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
