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Biology

के Permeabilization की एक विधि Published: July 13, 2014 doi: 10.3791/51634
Automatic Translation
1
1Department of Environmental Medicine, University of Rochester School of Dentistry and Medicine

Summary

विकासशील ड्रोसोफिला भ्रूण को छोटे अणुओं का परिचय उपन्यास यौगिकों, दवाओं, और विषाक्त पदार्थों के जैविक गतिविधि निस्र्पक के साथ ही मौलिक विकास के रास्ते की जांच के लिए के लिए महान क्षमता प्रदान करता है. वर्णित विधियों के साथ साथ ड्रोसोफिला भ्रूण मॉडल की उपयोगिता का विस्तार, इस दृष्टिकोण को प्राकृतिक बाधाओं पर काबू पाने कि कदम रूपरेखा.

Abstract

ड्रोसोफिला भ्रूण लंबे विकास को नियंत्रित कि आणविक और आनुवंशिक तंत्र elucidating के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगशाला मॉडल की गई है. इस मॉडल के साथ आनुवंशिक जोड़तोड़ की आसानी अन्य पशु मॉडल और सेल आधारित assays में आम हैं कि औषधीय दृष्टिकोण supplanted किया है. यहाँ हम विकासशील फल मक्खी भ्रूण को छोटे अणुओं के आवेदन सक्षम बनाता है एक प्रोटोकॉल में हाल के अग्रिमों का वर्णन. विधि भ्रूण व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए eggshell के अछिद्रता पर काबू पाने के लिए कदम विवरण देता है. विकास के चरणों की एक विस्तृत रेंज में eggshell permeabilization विलायक एक पहले से वर्णित लाइमोनीन भ्रूण permeabilization (1 ईपीएस) के आवेदन के द्वारा और (18 डिग्री सेल्सियस) पहले उपचार के लिए कम तापमान पर उम्र बढ़ने के भ्रूण से प्राप्त किया जाता है. इसके अलावा, एक permeabilization सूचक के रूप में एक दूर की लाल डाई (Cy5) के उपयोग के मानक लाल और हरे रंग फ्लू से जुड़े बहाव के अनुप्रयोगों के साथ संगत है, जो वर्णन किया गया हैलाइव और तय तैयारी में orescent रंजक. इस प्रोटोकॉल विकास तंत्र की जांच के साथ ही uncharacterized छोटे अणुओं की टेराटोजेनिक या pharmacologic गतिविधि का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से पढ़ाई के लिए करने के लिए bioactive यौगिकों का उपयोग अध्ययन के लिए लागू है.

Introduction

ड्रोसोफिला भ्रूण विकास 2 के बुनियादी तंत्र की जांच के लिए एक प्रमुख मॉडल होना जारी है. इस शक्तिशाली मॉडल किसी भी समय बिंदु पर है और किसी भी विकासशील अंग के भीतर अनिवार्य रूप से किसी भी जीन की जोड़तोड़ की अनुमति है कि आणविक आनुवंशिक उपकरणों की एक विस्तृत सरणी के द्वारा समर्थित है. ड्रोसोफिला भ्रूण की morphogenesis के छोटे आकार के तेजी से विकास और व्यापक लक्षण वर्णन यह मौलिक विकास के रास्ते 3,4 पर्दाफाश किया है, जिनमें से कई आनुवंशिक स्क्रीन, के लिए पसंद की एक मॉडल बनाने के. ड्रोसोफिला भ्रूण में कई phenotypes विशेषता है और आसानी से व्याख्या कर रहे हैं, अक्सर एक असामान्य विशेषता के लिए जिम्मेदार अंतर्निहित आणविक आनुवंशिक तंत्र की पहचान करने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने के लिए किया गया है.

ऐतिहासिक, मक्खी भ्रूण मॉडल की एक कमी भ्रूण के ऊतकों के लिए छोटे अणुओं को शुरू की कठिनाई दिया गया है. 1) हमें: इस बाधा पर सीमाओं के समक्ष रखी हैजांच विकास तंत्र से पूछताछ और 2) uncharacterized छोटे अणुओं की टेराटोजेनिक या pharmacologic गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए इस स्थापित मॉडल का उपयोग करने के रूप में जाना जाता है bioactive छोटे अणुओं आईएनजी. एक परिणाम के रूप में, मक्खी भ्रूण की स्क्रीनिंग संभावित छोटे अणु गतिविधि के लक्षण वर्णन में underutilized किया गया है.

Eggshell का 1) permeabilization और 2) microinjection: मक्खी भ्रूण को छोटे अणुओं की डिलिवरी दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है. यह लेख एक पारंपरिक ड्रोसोफिला प्रयोगशाला की स्थापना में निष्पादित करने के लिए आसान कर रहे हैं कि permeabilization की विधि को अग्रिम प्रस्तुत करता है. यह microfluidics तकनीक के साथ microinjection तरीकों में हाल के अग्रिमों भी भ्रूण 5,6 यौगिकों शुरू करने के तरीकों के लिए योगदान दे रहा है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. भ्रूण को अणुओं को शुरू eggshell 7 के एक मोमी परत से रोका है. ड्रोसोफिला खोल पांच परतों के होते हैं. सेअंदर बाहर वे हैं: पीतक झिल्ली, मोमी परत, भीतरी कोरियोनिक परत, endochorion और exochorion 8. तीन बाहरी कोरियोनिक परतों पतला ब्लीच में भ्रूण की संक्षिप्त प्रकट होना द्वारा हटाया जा सकता है, एक कदम dechorionation के रूप में भेजा. यह अंतर्निहित पीतक झिल्ली में encased रहता है, जबकि उजागर मोमी परत तब, dechorionated भ्रूण पारगम्य प्रतिपादन ऐसे हेपटैन और ओकटाइन 7,9 के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स,, के लिए जोखिम से समझौता किया जा सकता है. हालांकि, इन विलायकों का उपयोग उनकी विषाक्तता और भ्रूण व्यवहार्यता 9,10 पर पूर्ण रूप से नकारात्मक प्रभाव पड़ता है, जो दोनों के अपने मजबूत permeabilizing कार्रवाई, विनियमित करने में कठिनाई के कारण जटिलताओं का परिचय.

विलायक एक रचना में कहा भ्रूण permeabilization (ईपीएस) का उपयोग permeabilization की पद्धति पहले से 1 वर्णित किया गया है. इस विलायक miscibl होने के लिए विलायक कि सक्षम लाइमोनीन और संयंत्र व्युत्पन्न surfactants के होते हैंजलीय बफ़र्स के साथ ई. लाइमोनीन और वांछित सांद्रता के लिए विलायक पतला करने की क्षमता का कम विषाक्तता उच्च व्यवहार्यता 1 के साथ पारगम्य भ्रूण उत्पन्न करने के लिए एक प्रभावी तरीका सामने आए है. हालांकि, दो अंतर्जात कारकों आवेदन करने के लिए सीमाओं को लाने के लिए जारी किया है. सबसे पहले, भ्रूण देखभाल करीब विकासात्मक मचान बनाए रखने के लिए लिया जाता है, तब भी जब ईपीएस उपचार के बाद पारगम्यता में विविधता प्रदर्शित करता है. दूसरा, लगभग आठ घंटे से अधिक पुराने अंडे 11 बिछाने के बाद होता है कि eggshell के एक सख्त साथ संगत, permeabilize करने के लिए मुश्किल साबित हो रहा है भ्रूण.

यहाँ वर्णित ईपीएस विधि के क्षेत्र में प्रगति कर रहे हैं कि: 1) निर्धारण और immunostaining चरणों निष्पादित और 2)> (देर से विकास के समय बिंदुओं पर 8 घंटा, चरण भ्रूण की permeabilization सक्षम किया गया है, के बाद भी लगभग हूबहू permeabilized भ्रूण की पहचान और विश्लेषण में सहायता 12 और पुराने). विशेष रूप से, एक दूर की लाल रंग के आवेदन,Cy5 कार्बोक्जिलिक एसिड, विकास के दौरान और formaldehyde निर्धारण के बाद भ्रूण में बनी रहती है, जो एक पारगम्यता सूचक के रूप में कार्य करता है वर्णन किया गया है. इसके अलावा, यह 18 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण पालन देर चरण भ्रूण (चरणों 12-16) के permeabilization सक्षम करने, एक ईपीएस संवेदनशील राज्य में eggshell का कहना है कि दिखाया गया है.

इन अग्रिमों ईपीएस कार्यप्रणाली को पहले उल्लेख सीमाओं को पार. यह आवेदन इसलिए व्यवहार्यता बनाए रखते हुए अलग विकासात्मक समय बिंदुओं पर भ्रूण के हित के लिए छोटे अणुओं को पेश करने के लिए एक साधन के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करेगा.

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Protocol

1. फ्लाई संस्कृति, समाधान, और भ्रूण हैंडलिंग उपकरणों की तैयारी

  1. ड्रोसोफिला के एक पिंजरे संस्कृति तैयार करें. एक 10 सेमी अंगूर अगर प्लेट और खमीर पेस्ट की एक जगह के साथ लगे एक जनसंख्या पिंजरे में वांछित तनाव की 500 संभोग मक्खियों रखें. एक 25 डिग्री सेल्सियस आर्द्रता नियंत्रित इनक्यूबेटर में संस्कृति को बनाए रखने. नोट:   केज संस्कृतियों लगातार भ्रूण बिछाने पैटर्न प्राप्त करने के लिए कंडीशनिंग के एक या दो दिन की आवश्यकता होती है. खमीर पेस्ट के साथ अंगूर प्लेटें कंडीशनिंग के दौरान सुबह और एक बार शाम को एक बार बदल रहे हैं.
  2. ईपीएस तैयार करें. 37 डिग्री सेल्सियस पर surfactants (cocamide डीईए और Ethoxylated शराब) की गर्म समाधान पिपेट एक छोटी सी हलचल पट्टी से लैस एक गिलास जगमगाहट शीशी लाइमोनीन की 18 मिलीलीटर. पिपेट लाइमोनीन 1 एमएल दो surfactants (प्रत्येक के 5% अंतिम एकाग्रता) में से प्रत्येक. अच्छी तरह मिक्स और हलचल पट्टी हटा दें. नोट: ईपीएस के इस शेयर समाधान कमरे के तापमान पर लगभग 2 महीने के लिए अच्छा है. समाधान37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म और पूरी तरह से उपयोग करने से पहले surfactants solubilize को swirled किया जाना चाहिए. वे समय के साथ कुछ प्लास्टिक भंग करेंगे के रूप में ईपीएस और लाइमोनीन एक ग्लास कंटेनर में संग्रहित किया जाना चाहिए.
  3. भ्रूण dechorionation समाधान, ऊष्मायन माध्यमों, डाई और दवा समाधान तैयार करें. 25 मिलीलीटर एच 2 हे और उथले डिश में जगह के साथ ब्लीच का 25 मिलीलीटर का मिश्रण. पूर्व नुस्खा 1,12 के अनुसार संशोधित बुनियादी ऊष्मायन मध्यम (MBIM) और MBIM आयकर तैयार करें. शील्ड्स को तैयार है और (माल की सूची देखें) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एम 3 सेल संस्कृति माध्यम और पीबीएस गाया. DMSO में 10 मिमी एकाग्रता में permeabilization डाई के शेयर समाधान तैयार करें.
  4. भ्रूण से निपटने उपकरणों और आपूर्ति इकट्ठा:
    1. Dechorionation और ईपीएस उपचार टोकरी (चित्रा 1 ए देखें) तैयार करें. एक ठीक दांतेदार देखा के साथ एक डिस्पोजेबल 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र / संस्कृति ट्यूब के एक 3 सेमी अनुभाग काट दिया. पालन ​​sandpaper पर ट्यूब खंड रगड़ से वेल्डिंग सतह फ्लश बनाओएक benchtop सतह के लिए. वेल्ड एक लौ पर ट्यूब खंड के रिम के पिघलने और एक गिलास प्लेट पर जाल करने पर दबाकर Nitex नायलॉन जाल के लिए ट्यूब अनुभाग. शांत करते हैं और अतिरिक्त जाल बंद ट्रिम. नोट: सरासर पक्षों और नीचे संबंधित कदमों पर अवशिष्ट ब्लीच और ईपीएस के बंद तेजी से और पूरी धोने के लिए अनुमति देते हैं. वेल्डिंग कदम एक धूआं हुड के तहत बाहर किया जाना चाहिए.
    2. एक विकास टोकरी तैयार करें. टोपी के रिम से भरा एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र / संस्कृति ट्यूब के शीर्ष भाग काट दिया. निकालें और चित्रा 1 बी में दिखाया गया है रिम साथ एक केंद्रीय उद्घाटन और notches के बाहर काटने से टोपी को संशोधित. जाल पर और काट ट्यूब खंड के धागे पर टोपी स्क्रू और अतिरिक्त जाल ट्रिम. नोट: टोपी 60 मिमी जलाशय पकवान (चित्रा 1 बी) में तैनात जब थोक मध्यम करने के प्रसार की अनुमति है कि रिम में notches होता है.
    3. एक स्लाइड चैंबर के घटक तैयार करें. से भी बड़ा है कि क्या करना झिल्ली के एक वर्ग में कटौतीस्लाइड कक्ष उद्घाटन. उद्घाटन के अंदर होंठ के लिए वैक्यूम तेल की एक बहुत पतली परत लागू करें. अनुचर अंगूठी के साथ तेल के खिलाफ यह सील खोलने में डीओ झिल्ली प्रत्यय. करीब अनुचर अंगूठी करने के लिए इसे वापस काटने से अतिरिक्त डीओ झिल्ली ट्रिम. नोट:. स्लाइड चैम्बर के लिए निर्दिष्टीकरण Kiehart एट अल 13 में पाया जा सकता है इस कक्ष व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है और एक मशीन की दुकान से कस्टम निर्माण की आवश्यकता है.

2. मचान, dechorionation, और भ्रूण के ईपीएस उपचार

  1. समयबद्ध संग्रह द्वारा भ्रूण मचान. पूर्वाह्न में मक्खी संस्कृति पिंजरे में एक ताजा अंगूर / खमीर प्लेट सेट करें. भ्रूण 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए रखी जा करने की अनुमति दें इस थाली त्यागें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के एक बाद भ्रूण बिछाने के लिए एक ताजा अंगूर / खमीर थाली के साथ की जगह आगे विकास के मंचन के लिए 18 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इस थाली और जगह ले लीजिए. नोट: 25 डिग्री सेल्सियस पर विकास की 1 घंटा विकास के 2 घंटे के बराबर है18 डिग्री सेल्सियस पर देर चरण भ्रूण में ईपीएस permeabilization बनाए रखने पर 25 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 18 डिग्री सेल्सियस पर उम्र बढ़ने के प्रभाव चित्रा 2 में देखा जा सकता है.
  2. Dechorionation. धीरे 25 डिग्री सेल्सियस पानी के नल और एक तूलिका का उपयोग कर जाल टोकरी में अंगूर की थाली से दूर भ्रूण कुल्ला. दूर नल से पानी की एक सौम्य धारा के तहत टोकरी में भ्रूण से अतिरिक्त खमीर कुल्ला. 2 मिनट के लिए 50% ब्लीच में टोकरी विसर्जित कर दिया. अच्छी तरह से पानी के नल की एक धारा के तहत भ्रूण धो लें. नोट: धीरे रहकर एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग भ्रूण पर ब्लीच समाधान धार. 2 मिनट पूरा dechorionation के लिए आमतौर पर पर्याप्त है, वहीं इस ऊष्मायन समय प्रत्यक्ष परीक्षा द्वारा जाँच और उसके अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए. नल के पानी में डूबे टोकरी में dechorionated भ्रूण बनाए रखें और ईपीएस कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें.
  3. ईपीएस उपचार
    1. प्रत्येक में पीबीएस के लगभग 10 मिलीलीटर के साथ छह 60 मिमी व्यंजन तैयार करते हैं. 2.925 मिलीग्राम MBI में 75 μl ईपीएस भंग करके ईपीएस कमजोर पड़ने की तैयारीघूमता के साथ एक 50 मिलीलीटर कांच बीकर में एम (1:40). नोट: इस मिश्रण से एक सफेद पायस रूपों.
    2. पोंछ एक प्रयोगशाला के साथ जाल टोकरी के नीचे से अतिरिक्त पानी दाग. बीकर में पतला ईपीएस में टोकरी विसर्जित कर दिया और तुरंत टोकरी के नीचे में ईपीएस समाधान में भ्रूण को फैलाने के लिए चक्कर आने. 30 सेकंड के लिए प्रस्ताव घूमता जारी. नोट: ईपीएस dilutions और जोखिम बार पारगम्यता नियंत्रित करने के लिए अलग किया जा सकता है. यह इष्टतम ईपीएस dilutions और उपचार बार इस्तेमाल किया जा रहा है मक्खियों के उपभेदों के साथ अनुभव से स्थापित किया जा सिफारिश की है. 60-90 सेकंड के लिए जोखिम समय में वृद्धि चरण 12 और पुराने भ्रूण के लिए अनुकूल है.
    3. , टोकरी निकालें पोंछ एक प्रयोगशाला के साथ अतिरिक्त ईपीएस दूर दाग. 60 मिमी व्यंजन में पीबीएस के 10 एमएल में छह अनुक्रमिक washes के साथ आगे बढ़ें. धीरे छह washes में से प्रत्येक में पीबीएस के साथ भ्रूण धारा निकलना करने के लिए एक प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग करें. डाई करने के लिए आगे बढ़ें और नशीली दवाओं के उपचार कदम. नोट: ईपीएस सिंक के नीचे से निपटाया जा सकता है.

Permeabilized भ्रूण की 3. डाई और दवा इलाज

  1. डाई उपचार
    1. 10 मिमी Cy5 कार्बोक्जिलिक एसिड डाई * एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब और मिश्रण करने के भंवर में MBIM-टी (50 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) की मिलीलीटर 1 करने के 5 μl जोड़ें. नोट: * डाई की च्वाइस बहाव के विश्लेषण पर निर्भर करता है. Cy5 कार्बोक्जिलिक एसिड निर्धारण और immunostaining का उपयोग बाद के विश्लेषण के लिए प्रभावी है. Rhodamine बी रहने वाले भ्रूण के विश्लेषण के लिए उपयोगी है. Rhodamine बी के लाल उत्सर्जन, और इसके चयापचयों 1 की हरी उत्सर्जन, प्रतिदीप्ति का उपयोग बहाव के अनुप्रयोगों के साथ कुछ जटिलताओं पेश कर सकते हैं. दवा या विष इस स्तर पर उपचार आरंभ करने के लिए, या इस स्तर पर एक नाड़ी को दवा / विष उपचार सीमित करने के लिए डाई समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है. केयर एमएसडीएस और पर्यावरण सुरक्षा मानकों के अनुसार संभाल और दवाओं और विषाक्त पदार्थों के निपटान के लिए रखा जाना चाहिए.
    2. एक तूलिका का प्रयोग डाई समाधान के लिए जाल टोकरी से भ्रूण स्थानांतरण. ट्यूब टोपी और सुनिश्चित करने के लिए बार बार पलटनाभ्रूण डाई समाधान में निलंबन में स्वतंत्र रूप से नाव. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक nutating घुमाव पर ट्यूब रखें.
    3. Nutator से ट्यूब निकालें और भ्रूण व्यवस्थित करते हैं. ठीक एक विंदुक के साथ डाई समाधान निकालें और धोने के लिए MBIM आयकर के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें. पूरी तरह से भ्रूण फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब पलटना. भ्रूण व्यवस्थित करते हैं और तीन और MBIM आयकर washes के साथ दोहराएँ. अंतिम कुल्ला करने से सभी MBIM आयकर निकालें और ऊष्मायन कदम के लिए आगे बढ़ें.
  2. भ्रूण के विकास के लिए ऊष्मायन
    1. विकास टोकरी या स्लाइड चैंबर: दो कक्षों में से एक भ्रूण स्थानांतरण. नोट: विकास टोकरी अब विकासात्मक अवधि के लिए पसंद किया जाता है, और बाद के निर्धारण और immunostaining कदम निष्पादित करने के लिए कर रहे हैं यदि आवश्यक है. स्लाइड चैम्बर उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग के लिए इष्टतम है और कम विकास की अवधि (जैसे, जल्दी भ्रूण की घटनाओं) के लिए सबसे प्रभावी है. दवा या विष विभिन्न सांद्रता और भ्रूण डी के माध्यम से जोड़ा जा सकता हैevelopment मानक निर्धारण का उपयोग करते हुए और प्रोटोकॉल immunostaining लाइव भ्रूण के साथ या एक समापन बिंदु पर वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है.
    2. टोकरी में विकास
      1. 70% इथेनॉल के साथ squirting द्वारा एक विकास टोकरी साफ, de-ionized पानी से अच्छी तरह कुल्ला और पोंछ प्रयोगशाला के साथ सूखी दाग. दवा या विष की वांछित एकाग्रता के साथ ऊष्मायन माध्यम के 6 मिलीलीटर की तैयारी. मेष आधार के तहत 60 मिमी पकवान ख्याल रखने के लिए नहीं जाल हवाई बुलबुले में मध्यम में विकास टोकरी रखें. नोट: दो मीडिया आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं: 50:50 मिश्रण में अकेले MBIM, या MBIM/M3, बाद अब विकास अवधि के लिए अधिक प्रभावी किया जा रहा है.
      2. एक तूलिका के साथ टोकरी के आधार में सतह के जाल को permeabilized भ्रूण स्थानांतरण. धीरे आसपास के जलाशय से मीडिया के साथ भ्रूण धार. वे जाल पर एक monolayer में हैं कि इतने तूलिका के साथ भ्रूण फैलाने. नोट: माइक्रोस्कोपी इमेजिंग करने के लिए आगे बढ़ें और जनसंपर्क के permeabilization और व्यवहार्यता विशेषताओं का मूल्यांकनeparation (चरण 4 देखें).
    3. स्लाइड चैंबर में विकास
      1. स्लाइड कक्ष उलटें और खोलने की परिधि पर वैक्यूम तेल का एक छोटा सा मनका लागू होते हैं. उद्घाटन के भीतर ऐसा झिल्ली की सतह पर दवा या विष के वांछित राशि के साथ मध्यम के 150 μl रखें. नोट: दो मीडिया आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं: 50:50 मिश्रण में अकेले MBIM, या MBIM/M3, बाद अब विकास अवधि के लिए अधिक प्रभावी किया जा रहा है.
      2. एक तूलिका के साथ मीडिया के ड्रॉप करने permeabilized भ्रूण स्थानांतरण. उन्हें छोड़ भीतर झिल्ली पर व्यवस्थित बनाने भ्रूण फैलाने.
      3. ध्यान जिससे मध्यम सपाट खोलने पर एक 25 मिमी परिपत्र coverslip पर लागू करें. तेल के साथ एक मुहर फार्म coverslip की परिधि के साथ धीरे नीचे दबाएँ. नोट: (चरण 4 देखें) तैयार करने के permeabilization और व्यवहार्यता विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें.

4. पहचानpermeabilized व्यवहार्य भ्रूण की दिखाएं

  1. Permeabilized भ्रूण को पहचानें. एक डिजिटल कैमरे से लैस एक खुर्दबीन के साथ epifluorescence के तहत भ्रूण को ध्यान से देखें. तय माइक्रोस्कोप और कैमरा सेटिंग्स का उपयोग कई क्षेत्रों के (प्रोफ़ाइल जर्दी autofluorescence निर्धारित करने के लिए नीले रंग तरंग दैर्ध्य में) छवियों मोल.
  2. रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर भ्रूण की permeabilization निर्धारित करते हैं. टोकरी को समायोजित करने के लिए और भ्रूण के जोड़तोड़ की अनुमति के लिए एक बड़े काम की दूरी के साथ एक stereomicroscope का प्रयोग करें. खुर्दबीन एक प्रोग्राम XYZ मंच, epifluorescence रोशनी और यह एक डिजिटल कैमरा के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए. छवि एक बाद में समय बिंदु पर एक ही भ्रूण का फिर से मूल्यांकन के लिए सक्षम करने के लिए जोखिम और प्रत्येक भ्रूण छवि के मंच स्थिति मापदंडों को दर्ज करने के ख्याल रख रही भ्रूण (चित्रा 3 में प्रतिनिधि परिणाम देखें). नोट: डाई तेज के पैटर्न का इस्तेमाल किया डाई, जोखिम और भ्रूण उम्र की लंबाई के आधार पर अलग अलग होंगे. एक विस्तृत श्रृंखलाएक भी तैयारी भर की डाई तेज खासियत है और permeabilization की डिग्री में भिन्नता को दर्शाता है.
  3. व्यवहार्य भ्रूण को पहचानें. Permeabilized भ्रूण की स्थिति अंकन के बाद कमरे के तापमान या 25 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण विकास के साथ जारी माइक्रोस्कोप को टोकरी या स्लाइड चैम्बर लौटें. नीले चैनल प्रतिदीप्ति के तहत निरीक्षण और की पहचान पहले permeabilized भ्रूण में जर्दी autofluorescence की छवि हासिल. जर्दी वितरण की सामान्य प्रगति के अनुसार व्यवहार्यता का आकलन (रैंड एट अल. 1 और 3 चित्र में प्रतिनिधि परिणाम देखें). नोट: Brightfield माइक्रोस्कोपी के साथ मनाया भ्रूण की अन्य रूपात्मक सुविधाओं व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह व्यवहार्यता के साथ संगत है कि पारगम्यता के स्तर की स्थापना के हर रंग और इस्तेमाल मक्खी के तनाव के साथ अनुभव से निर्धारित किया जा सिफारिश की है.
  4. Permeabilized व्यवहार्य भ्रूण में ड्रग या विष प्रभाव का मूल्यांकन.
  5. संस भ्रूणऊपर प्रोटोकॉल पारंपरिक के एक नंबर के लिए तैयार कर रहे हैं के साथ ssed दवा या विष जोखिम के लिए बाद में विश्लेषण करती है. विश्लेषण के विभिन्न प्रकार के कई नीचे चर्चा में माना जाता है और प्रत्यक्ष लाइव भ्रूण में morphogenesis के अवलोकन के साथ ही पद के निर्धारण immunostaining का विश्लेषण करती है शामिल हैं. इन तरीकों के दोनों जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और सेल वंश और आकृति विज्ञान के प्रोफाइल से पता चलता है कि महत्वपूर्ण रंजक (जैसे, GFP) के प्रयोग से बढ़ा रहे हैं.

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Representative Results

भ्रूण हैंडलिंग उपकरणों ऊपर प्रोटोकॉल में हेरफेर के लिए "घर" बनाया उपकरणों दृश्यमान करने में सहायता करने के लिए चित्र 1 में कल्पना कर रहे हैं. चित्रा 2 में देखा परिणाम विकास की देर चरणों में ईपीएस द्वारा permeabilized जा करने की क्षमता पर 18 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण के पालन के मजबूत प्रभाव को वर्णन. इस हालत प्रोटोकॉल 2.1 चरण में लागू किया जाता है. आम तौर पर ईपीएस इलाज भ्रूण में देखा पारगम्यता के विभिन्न स्तरों प्रकट करने के लिए Cy5 कार्बोक्जिलिक एसिड डाई की प्रभावकारिता 3 चित्र में देखा जाता है. जर्दी में डाई वितरण के विकास गतिशीलता भी व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल एक कसौटी खुलासा, 3 चित्र में देखा जाता है , प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में 4.2 कदम. विष उपचार, formaldehyde के निर्धारण और immunostaining के लिए बाद भ्रूण permeabilization का निर्धारण करने में Cy5 डाई की उपयोगिता चित्रा 4 में परिणाम से यह साफ है.


ईपीएस विधि के लिए चित्रा 1. भ्रूण हैंडलिंग उपकरण. फ्लैट तली टोकरी dechorination में इस्तेमाल किया और जोखिम कदम (ए, ए '), EPS है. विकास टोकरी permeabilized भ्रूण के लंबे समय तक विकास के जोखिम (बी, बी ') के लिए प्रयोग किया जाता है. स्लाइड चैम्बर कम विकासात्मक जोखिम और जीने भ्रूण के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है (सी, सी '. आगे वर्णन के लिए पाठ देखें).

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रभाव देर चरण भ्रूण में ईपीएस प्रभावकारिता पर 18 डिग्री सेल्सियस पर उम्र बढ़ने के. भ्रूण 20 घंटा (पैनलों ए.ए. "के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर उम्र बढ़ने के द्वारा पीछा किया दो घंटे के लिए एकत्र किए गए थे, (पैनल सीसी के लिए"). 18 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण तो dechorionated और दो नमूनों में विभाजित किया गया. पहला नमूना, 5 मिनट के लिए MBIM-टी में 1 मिमी Rhodamine बी डाई के साथ सीधे इलाज धोया और brightfield और नीले और लाल प्रतिदीप्ति चैनल (पैनल ए.ए. ") के तहत कल्पना की गई थी. दूसरा नमूना, ईपीएस (1 मिनट के लिए MBIM में 1:10) के साथ इलाज धोया और फिर 1 मिमी Rhodamine बी के साथ इलाज के 5 मिनट के लिए और दृश्य (पैनल बी ") से पहले धोया था. 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाया भ्रूण dechorionated और ईपीएस (1 मिनट के लिए MBIM में 1:10) के साथ सीधे इलाज, धोया और फिर दृश्य (पैनल सीसी ") से पहले 5 मिनट के लिए 1 मिमी Rhodamine बी के साथ इलाज किया गया. भ्रूण नीले चैनल (पैनल ए ',' बी ',' सी ') में जर्दी autofluorescence द्वारा पता चला पेट में सिलवटों से चरण 14 में होना निर्धारित किया गया. 18 डिग्री सेल्सियस पर उठाया भ्रूण पूर्व ईपीएस treatmen के लिए अभेद्य हैंRhodamine बी तेज (पैनल ए ') के अभाव के रूप में देखा टी. 18 डिग्री सेल्सियस भ्रूण की ईपीएस उपचार Rhodamine बी तेज (पैनल बी ") के रूप में देखा पारगम्यता के एक उच्च डिग्री अर्जित करता है. Rhodamine बी (पैनल सी ") के बहिष्कार से देखा के रूप में 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाया भ्रूण भी ईपीएस उपचार के साथ अभेद्य बने हुए हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. पारगम्य और व्यवहार्य भ्रूण में Cy5 का समावेश. भ्रूण (25 डिग्री सेल्सियस, चरण 12 में 7-9 घंटे भ्रूण के बराबर) 18 डिग्री सेल्सियस पर 14 घंटे के 2 घंटे और वृद्ध के 25 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र किए गए थे. Dechorination के बाद उपचार Cy5 डाई में ऊष्मायन (15 मिनट के लिए MBIM आयकर में 50 माइक्रोन) के बाद (1 मिनट के लिए MBIM में 01:40) किया गया था, EPS. भ्रूण MBIM आयकर में तीन बार धोया और जलाशय में MBIM साथ विकास टोकरी को हस्तांतरित कर रहे थे. विकास पी की अनुमति दी थीकमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए roceed. Cy5 (लाल) की तेज तुरंत डाई उपचार और धोने (एक पैनल) के बाद और 8 घंटा विकास (पैनल बी) के बाद अब तक लाल चैनल में imaged है. जर्दी का वितरण नीले चैनल में autofluorescence से देखा जाता है. डाई तेज, इसलिए पारगम्यता, भ्रूण से भ्रूण को अलग अलग करने में देखा जाता है. Cy5 डाई (लाल) चरण 16 (बैंगनी, पैनल ख) में आंत के लुमेन को केंद्रित हो जाता है जो की जर्दी (नीला), के लिए स्थानीय बनाना देखा जाता है.

चित्रा 4
तय की और immunostained भ्रूण में permeabilization और methylmercury प्रभाव का आंकड़ा 4. निर्धारण. भ्रूण (25 डिग्री सेल्सियस, चरण 12 में 7-9 घंटे भ्रूण के बराबर) 18 डिग्री सेल्सियस पर 14 घंटे के लिए 2 घंटे और आयु वर्ग के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र किए गए थे. Dechorination बाद, ईपीएस उपचार में ऊष्मायन के बाद (1 मिनट के लिए MBIM में 01:40) किया गया थाCy5 डाई (15 मिनट के लिए MBIM-टी में 50 माइक्रोन) एक साथ methylmercury के साथ (50 माइक्रोन MeHg, पैनल बी) या DMSO विलायक नियंत्रण (0.1% अंतिम एकाग्रता, पैनल). भ्रूण MBIM आयकर से धोया और MBIM साथ एक विकास टोकरी में रखा गया: एम 3 जलाशय में मध्यम और कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 8 घंटे के लिए वृद्ध. भ्रूण तो एक मानक प्रोटोकॉल 14 से एक दो चरण 4% paraformaldehyde-हेपटैन तैयारी में तय किया गया. धुंधला मोटर न्यूरॉन्स और विरोधी ELAV एंटीबॉडी (ए में लाल, ख) सभी न्यूरॉन सेल शरीर लेबल करने के लिए लेबल करने के लिए विरोधी Fasciclin द्वितीय (ए, बी में हरे और एक में सफेद ',' बी ') के साथ प्रदर्शन किया गया था. Cy5 डाई (Cy5 छद्म रंग सभी पैनलों में नीला है) के कारण निर्धारण की वजह से कम प्रतिदीप्ति तीव्रता को विस्तारित जोखिम की आवश्यकता है जो प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति, से पता चला है. MeHg के प्रभाव अनियमित patterning और cluste में देखा जाता है(लाल रंग में लेबल और एक बनाम बी में सफेद तीर के साथ चिह्नित ELAV पॉजिटिव,) पार्श्व chordotonal न्यूरॉन सेल शरीर की अंगूठी. इसके अलावा, कमानी (एस एन) (ए में ठोस हरी तीर ') एक विशेषता शाखाओं भ्रूण 15 पर MeHg की पहले से सूचना दी प्रभाव के साथ संगत MeHg जोखिम (बी में ठोस हरी तीर ") के साथ उच्च चर देखा जा रहा है. Intersegmental और अपनी जड़ों पर नसों कमानी का प्रोजेक्शन MeHg जोखिम (बी में खुला हरी तीर ') के साथ पीछे विस्थापित करते हुए देखा गया. नोट: Methylmercury एक शक्तिशाली neurotoxin है. केयर जब संभाल दस्ताने और आँख संरक्षण पहनने लिया जाना चाहिए. निपटान एक संस्थागत पर्यावरण सुरक्षा सुविधा और सेवा के माध्यम से किया जाना चाहिए.

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Discussion

उपरोक्त विधि एक व्यापक विकास रेंज भर में छोटे अणु उपचार के लिए पहुंच रहे हैं कि व्यवहार्य भ्रूण ड्रोसोफिला प्राप्त करने के लिए एक साधन की रूपरेखा. इस पद्धति पहले से ही प्रारंभिक चरण भ्रूण में देखा के रूप में 18 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण उम्र बढ़ने ही प्रभाव के साथ देर चरण भ्रूण की permeabilization सक्षम बनाता है कि उपन्यास और सरल खोज का परिचय. इसके अलावा, एक पारगम्यता संकेत के रूप में दूर तक लाल रंग Cy5 कार्बोक्जिलिक एसिड के उपयोग के बाद तय आवेदनों में प्रभावी साबित हो गया है और विकास phenotypes प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि परंपरागत लाल और हरे रंग का फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. इन निष्कर्षों को काफी ईपीएस विधि की प्रभावकारिता और उपयोगिता अग्रिम.

इस विधि में रहने वाले और निश्चित भ्रूण तैयारी दोनों का विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है. Brightfield माइक्रोस्कोपी और सेट अप स्लाइड कक्ष का उपयोग, भ्रूण विकास की पहली छमाही में स्कोर करने के लिए विशिष्ट सुविधाओं morphogenetic आंदोलन कर रहे हैं इस तरहनिषिक्त, मस्तक कुंड गठन, germband बढ़ाव और germband त्याग 1 की cellularization. GFP या आरएफपी पत्रकारों के साथ अधिक विशिष्ट endpoints, जैसे जल्दी विभाजन पैटर्न और बाद में विकास 1 में तंत्रिका संरचनाओं के गठन discerned किया जा सकता है. GFP और आरएफपी रिपोर्ट भी स्लाइड कक्ष और विकासात्मक टोकरी तैयारी में दोनों permeabilized भ्रूण में रहने वाले विकास संबंधी घटनाओं का अवलोकन सक्षम. एक आवेदन दवा या रसायन के सकल विषाक्तता निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि विकास 1 की देरी या समाप्ति के निर्धारित करने के लिए नीले चैनल में जर्दी प्रोटीन ऑटो प्रतिदीप्ति के पैटर्न पर नजर रखने के लिए है.

ईपीएस कार्यप्रणाली भी गैर मॉडल कीड़े, खोल के एक समान वास्तुकला के शेयरों, जो खास में मच्छर के खोजी उपकरणों को व्यापक बनाने के महान क्षमता है. अन्य कीट प्रजातियों के भ्रूण को छोटे अणुओं के आवेदन investigati का एक अवसर खुलेंगेजहां पर कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए मानक आनुवंशिक दृष्टिकोण वर्तमान में कमी कर रहे हैं. टोकरी में विकसित भ्रूण इसलिए ड्रोसोफिला पढ़ाई के लिए उपलब्ध immunostaining अभिकर्मकों के लिए ठहरने का विश्लेषण करती है खोलने, formaldehyde के निर्धारण के लिए कार्रवाई की जा सकती. हालांकि, इस कदम permeabilization की एक के बाद तय दृढ़ संकल्प दवा के लिए सुलभ बना दिया गया था कि भ्रूण के साथ phenotypes सहसंबंधी संभव होने की आवश्यकता है. Cy5 कार्बोक्जिलिक एसिड डाई का आवेदन इस दृष्टिकोण के लिए अत्यधिक प्रभावी साबित कर दी है. Cy5 कार्बोक्जिलिक एसिड कुशलतापूर्वक permeabilized भ्रूण (चित्रा 3 ए) में लिया जाता है. विकास के दौरान Cy5 अंततः (3B चित्रा) के बाद के स्तर पर 14 बनाने आंत के लुमेन में तनहा और जो जर्दी, में केंद्रित है. निर्धारण के बाद, Cy5 प्रतिदीप्ति स्पष्ट रूप से कमी आई है, फिर भी मज़बूती से पता लगाने योग्य पेट में और (प्रतिनिधि जोड़कर देख प्रभावी ढंग से शुरू में permeabilized थे कि उन भ्रूणों की एक मार्कर के रूप में कार्य करता हैULT चित्रा 4). यह इस स्तर पर Cy5 का पता लगाने का पता लगाने के लिए लंबे समय तक कैमरे के जोखिम (जैसे, 1-4 सेकंड) की आवश्यकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस प्रकार, immunostaining के पैटर्न के साथ phenotypes की स्कोरिंग ऊतक विशिष्ट मार्कर (जैसे, चित्रा 4 में देखा तंत्रिका विशिष्ट एंटीबॉडी) के साथ मिलकर इसी permeabilized भ्रूण पुष्टि करने के लिए Cy5 संकेत का उपयोग कर आगे बढ़ सकते हैं.

इस विधि में सबसे बड़ी चुनौती permeabilization प्रक्रिया, लंबे समय से इस विधि 9,10,16 विकसित करने के लिए पहले प्रयास परेशान किया है कि कुछ करने के लिए भ्रूण व्यवहार्यता की संवेदनशीलता है. Permeabilization के लिए बाद में व्यवहार्यता उम्र पर निर्भर परस्पर विरोधी है, और बढ़ जाती है नाटकीय रूप से पुराने भ्रूण permeabilization 9 पर है. हम पहले से पता चला है के रूप में अभी तक, पारगम्यता उम्र 1 के साथ तेजी से मुश्किल हो जाता है. एक ताजा रिपोर्ट में अब फिर से लागू एचईपी द्वारा देर चरण भ्रूण (चरण 14) permeabilize करने की क्षमता को दर्शाता हैलाइमोनीन 17 के साथ संयोजन के रूप में एक विलायक के रूप में Tane. केवल एक ही दवा प्रभाव विशेषता थी (nocodazole) और पहले चरण भ्रूण को आवेदन 17 से वर्णित नहीं किया गया था के रूप में यह बाद विधि की व्यापक उपयोगिता स्पष्ट नहीं है. इसके अलावा, आगे पैदावार देर से मंच पारगम्यता ऊपर उल्लिखित 18 डिग्री सेल्सियस विकास कदम के आवेदन और विषाक्त कार्बनिक विलायकों के उपयोग से बचा जाता है. ईपीएस प्रोटोकॉल के लिए नया है जो अन्वेषक आरंभिक प्रयास पर permeabilization और व्यवहार्यता परिणामों में परिवर्तनशीलता का अनुभव होगा. यहाँ उल्लिखित चरणों का व्यवस्थित ढंग से वे अपनी प्रयोगशाला की स्थापना में काम कर रहे हैं ड्रोसोफिला की विशिष्ट परिस्थितियों के शर्तों का अनुकूलन करने permeabilization उपचार और बाद में ऊष्मायन कदम की स्थितियां भिन्न करने के अन्वेषक उपकरण दे.

विधि के साथ एक अतिरिक्त चुनौती भ्रूण से भ्रूण को देखा रासायनिक तेज में परिवर्तनशीलता है. इस परिवर्तनशीलता की विविधता में परिलक्षित होता हैCy5 डाई तेज तुरंत डाई उपचार (चित्रा 3) के बाद भ्रूण में देखा. विपरीत, Rhodamine बी डाई और अधिक तेजी से और समान रूप से भ्रूण के ऊतकों भर में छितरी हुई Cy5 डाई (चित्रा 2B ") से है. इस प्रकार कुछ भ्रूण को भ्रूण परिवर्तनशीलता रासायनिक, नशीली दवाओं या ब्याज के विष के वितरण गुणों में harbored और विधि को निहित है हो सकता है. खुराक की मात्रा का ठहराव महत्वपूर्ण कहां है, यह ब्याज की दवा या विष के तेज एक वैकल्पिक विश्लेषणात्मक विधि के माध्यम से की विशेषता है की सिफारिश की है. बहरहाल, ऊपर प्रोटोकॉल में आसानी, और भ्रूण के सैकड़ों स्क्रीन करने के लिए क्षमता, अत्यधिक विकसित इस में निस्र्पक ड्रग्स या विषाक्त पदार्थों को एक शक्तिशाली पहले दृष्टिकोण के लिए बना रही है, खुराक प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन और संसाधनों का कम निवेश के साथ विशेषता phenotypes स्कोर करने के लिए अन्वेषक की अनुमति देता है मॉडल प्रणाली.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fly Cage Flystuff.com 59-101 http://flystuff.com/general.php
Cocamide DEA [Ninol 11-CM]  Stepan Chemical call for special order http://www.stepan.com/
Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7]  Stepan Chemical call for special order http://www.stepan.com/
d-limonene (Ultra high purity grade) Florida Chemical Co.  call for special order http://www.floridachemical.com/
Sodium hypochlorite  Fisher SS290-4 http://www.fishersci.com/
Tween-20  Fisher BP337 http://www.fishersci.com/
PBS powder Sigma 56064C http://www.sigmaaldrich.com/
Rhodamine B Sigma R6626 http://www.sigmaaldrich.com/
CY5 carboxylic acid Lumiprobe #23090 http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid
DMSO Sigma 472310-100 http://www.sigmaaldrich.com/
Shields and Sang M3 medium Sigma S8398 http://www.sigmaaldrich.com/
Nitex Nylon mesh  Flystuff.com 57-102 http://flystuff.com/misc.php
Dissolved oxygen (DO) membrane  YSI #5793 http://www.ysireagents.com/search.php
25 mm circular no.1 cover slip  VWR 48380-080 https://us.vwr.com/
Grape-agar plate mix  Flystuff.com 47-102 http://flystuff.com/media.php
Nutator VWR 82007-202 https://us.vwr.com/

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जैव अभियांत्रिकी अंक 89, भ्रूण विकास viteline झिल्ली लाइमोनीन झिल्ली permeabilization अपरूपजनन Rhodamine बी Cy5 methylmercury
के Permeabilization की एक विधि<em&gt; ड्रोसोफिला</emलघु अणु गतिविधि का Assays के लिए&gt; भ्रूण
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Rand, M. D. A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity. J. Vis. Exp. (89), e51634, doi:10.3791/51634 (2014).

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