Summary
개발 Drosophila의 배아에 작은 분자의 도입은 신규 화합물, 약물 및 독성 물질의 생물학적 활성의 특성뿐만 아니라 기본적인 발달 경로를 프로빙을위한 큰 잠재력을 제공합니다. 설명하는 방법은 여기에 초파리 배아 모델의 유틸리티를 확대,이 방법 자연 장벽을 극복 단계를 설명합니다.
Abstract
Drosophila의 배아는 긴 개발을 제어하는 분자 유전 메커니즘을 해명하기위한 강력한 실험실 모형이다. 이 모델의 유전 조작의 용이성은 다른 동물 모델 및 세포 기반 분석에서 평범 약물 접근 방식을 대신하게했다. 여기에 우리가 개발 초파리 배아에 작은 분자의 응용 프로그램을 사용할 수있는 프로토콜의 최근의 진보에 대해 설명합니다. 이 방법은 태아의 생존 능력을 유지하면서 껍질의 불 투과성을 극복하는 단계를 자세히 설명합니다. 발달 단계의 넓은 범위에 걸쳐 달걀 껍질 permeabilization 용매 이전에 설명 D-리모넨 배아 permeabilization (1 EPS)의 응용 프로그램과 (18 ° C) 이전 치료에 감소 된 온도에서 노화의 배아에 의해 달성된다. 또한, permeabilization 표시로 원적외선 염료 (CY5)의 사용은 표준 빨간색과 녹색 독감을 포함한 다운 스트림 응용 프로그램과 호환되는, 설명라이브 및 고정 준비에 orescent 염료. 이 프로토콜은 발달 메커니즘을 조사뿐만 아니라 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하기위한 연구에하는 생리 활성 화합물을 사용하여 연구에 적용 할 수있다.
Introduction
Drosophila의 배아 개발 2의 근본적인 메커니즘의 조사를 위해 최고의 모델이되고 있습니다. 이 강력한 모델은 임의의 시점에서 그리고 어떠한 현상 기관 내에 실질적으로 어떤 유전자의 조작을 허용하는 분자 유전 학적 도구의 다양한 배열에 의해지지된다. 초파리 배아의 형태 형성의 작은 크기, 빠른 개발, 다양한 특성은 기본적인 발달 경로에게 3,4를 발견했습니다 많은 것이 유전 스크린에 대한 선택의 모델을 확인합니다. Drosophila의 배아에 많은 표현형이 특징으로 쉽게 해석 할 수 있으며, 종종 비정상적인 특성에 대한 책임을 기본 분자 유전 학적 메커니즘을 식별 할 수있는 수단을 제공하고있다.
역사적으로, 플라이 배아 모델의 단점은 배아 조직에 작은 분자를 도입하는 어려움이있다. 1) 우리 :이 장애물에 대한 제한을 제기했다프로브가 발달 메커니즘을 심문하고 2) 특성화되지 않은 작은 분자의 기형 또는 약리학 적 활성을 평가하는이 설립 모델을 사용하기로 알려진 생리 활성 작은 분자를 주입. 결과적으로, 비행 배아의 스크리닝 전위 저분자 활성의 특성화에 미달되었다.
달걀 껍질의 1) permeabilization 2) 미세 주입 : 플라이 배아에 작은 분자의 배달은 두 가지 방법으로 달성 될 수있다. 이 문서에서는 기존의 초파리 실험의 설정에서 실행하기 쉬운 permeabilization 방법에 대한 발전을 제시한다. 이는 마이크로 유체 기술 마이크로 인젝션 방식에서 최근의 진보는 또한 배아 5,6 화합물에 도입하는 방법에 기여하는 것을 주목해야한다. 배아에 분자를 소개하는 껍질 (7)의 밀랍 층에 의해 방지 할 수있다. 초파리의 알 껍질은 5 개의 층으로 구성되어 있습니다. 부터인사이드 아웃 그들은 : 난황 막, 밀랍 층, 내부 융모막 층, endochorion 및 exochorion 8. 세 가지 외부 융모 층은 희석 표백제에있는 태아의 간단한 출현에 의해 제거 될 수있다, 단계 dechorionation라고도합니다. 그것은 내부 난황 막 쌌다 유지하면서 노출 된 왁시 층은, dechorionated 배아 투과성 렌더링 헵탄 및 옥탄 7,9 같은 유기 용매에의 노출에 의해 손상 될 수있다. 그러나 이러한 용매의 사용은 독성과 태아의 생존 능력 9,10에 뚜렷한 부정적인 영향이 둘 다 자신의 강한 permeabilizing 조치를, 조절에 어려움으로 인한 합병증을 소개합니다.
용매 조성물 칭했다 배아 permeabilization (EPS)를 사용 permeabilization의 방법은 이전에 1을 설명 하였다. 이 용매 miscibl되는 용매를 사용 D-리모넨 및 식물 유래의 계면 활성제로 구성수성 버퍼와 전자. D-리모넨 원하는 농도로 용매를 희석 할 수있는 능력의 낮은 독성이 높은 생존력으로 투과 한 배아를 생성하는 효과적인 방법을 수득했다. 그러나,이 내인성 인자는 애플리케이션에 제한을 가지고 계속했다. 첫째, 배아 관리가 가까운 개발 준비를 유지하기 위해 취해야하는 경우에도, EPS 처리 후 투과성의 이질성을 보여줍니다. 둘째, 약 8 시간보다 오래된 계란 11 누워 후 발생하는 껍질의 경화와 일치, 투과하기 어려운 입증 된 배아.
여기에 설명 된 EPS 방법의 발전은 그 : 1) 고정 및 면역 염색 단계를 실행하고 2)> (늦은 발달 시점에서 8 시간, 단계 배아의 permeabilization을 활성화 한 후에도 거의 동일 permeabilized 배아를 식별하고 분석하는 데 도움이 12 세 이상). 특히, 원적외선 염료의 응용 프로그램,CY5 카르 복실 산을, 개발하는 동안 포름 알데히드 고정 후 배아에서 계속 투과성 표시기 역할이 설명되어 있습니다. 또한, 18 ° C에서 배아를 양육하는 최종 단계의 배아 (단계 12 ~ 16)의 permeabilization을 가능하게 EPS 민감한 상태에서 껍질을 유지 것을 알 수있다.
이러한 진보는 EPS 방법론에 앞서 언급 한 한계를 극복. 이 응용 프로그램은 따라서 생존 능력을 유지하면서 별개의 발달 시점에서 배아의 관심 작은 분자를 소개 할 수있는 방법으로 조사를 제공 할 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 플라이 문화, 솔루션 및 배아의 취급 장치의 제조
- 초파리의 가두리를 준비합니다. 10cm 포도 한천 플레이트 효모 붙여 넣기의 자리가 장착 된 인구 케이지에서 원하는 변형 500 + 짝짓기 파리를 놓습니다. 25 ° C의 습도 조절 배양기에서 문화를 유지한다. 주 : 케이지 문화가 일치 배아 누워 패턴을 얻기 위해 에어컨의 하루 이틀이 필요합니다. 효모 붙여 넣기 포도 플레이트를 조절하는 동안 아침에 한 번 저녁에 한 번 변경됩니다.
- EPS를 준비합니다. 37 ° C에서 계면 활성제 (코카 미드 DEA 및 에톡 시화 알콜)의 따뜻한 솔루션 피펫 작은 교반 막대가 구비 된 유리 신틸레이션 바이알에, D-리모넨 18 밀리리터. 피펫 D-리모넨에 1 ㎖의 두 계면 활성제 (각 5 % 최종 농도)의 각. 철저하게 혼합 및 교반 막대를 제거합니다. 주 : EPS의이 원액은 실온에서 약 2 달을 위해 좋다. 솔루션37 ° C 올라가면 완전히 사용하기 전에 계면 활성제를 용해하는 소용돌이해야합니다. 그들은 시간이 지남에 따라 일부의 플라스틱을 용해하므로 EPS 및 D-리모넨은 유리 용기에 저장되어야한다.
- 배아 dechorionation 솔루션, 배양 매체, 염료 및 약물 솔루션을 준비합니다. 25 ML의 H 2 O와 얕은 접시에 장소 표백제 25 ㎖를 혼합한다. 이전의 레시피 1,12에 따라 수정 기본 배양 배지 (MBIM) 및 MBIM-T를 준비합니다. 방패를 준비하고 (자료 목록을 참조하십시오) 제조 업체의 프로토콜에 따라 M3 세포 배양 배지와 PBS를 불렀다. DMSO에 10 mM의 농도에서 permeabilization 염료의 주식 솔루션을 준비합니다.
- 배아 처리 장치 및 소모품을 조립 :
- dechorionation 및 EPS 처리 바구니 (그림 1A 참조) 준비합니다. 미세 톱니 보았다 일회용 50 ㎖ 폴리 프로필렌의 원심 분리기 / 문화 튜브의 3cm 부분을 잘라. 부착 사포의 튜브 부분을 문질러서 용접 표면 세척을벤치 탑 표면에. 용접 불꽃 위에 튜브 섹션의 림을 용융 유리 접시에 메쉬에 눌러 Nitex 나일론 메쉬 튜브 섹션. 식지 여분의 메쉬를 트림. 참고 : 깎아 지른듯한 측면과 하단은 각각의 단계에서 잔류 표백제 EPS 떨어져 신속하고 완벽한 세척을 위해 수 있습니다. 용접 단계 흄 후드에서 수행되어야한다.
- 개발 바구니를 준비합니다. 뚜껑의 가장자리와 같은 높이가 50 ㎖ 원심 분리기 / 문화 튜브의 상단 부분을 잘라. 제거 및도 1b에 도시 된 바와 같이 림을 따라 중앙 개구부와 노치를 절단하여 캡을 수정한다. 메시에와 차단 튜브 섹션의 스레드 캡 나사 및 여분의 메쉬 트림. 참고 : 캡은 60mm 저수지 접시 (그림 1B ')에 위치 할 때 대량 매체에 확산을 허용하는 테두리에 노치가 포함되어 있습니다.
- 슬라이드 챔버의 구성 요소를 준비합니다. 보다 큰 DO 막 사각형을 잘라슬라이드 챔버 개방. 개구부의 내부 입술에 진공 그리스의 매우 얇은 층을 적용하십시오. 리테이너 링 그리스에 대해 그것을 밀봉 구멍에 DO 막 부착합니다. 가까운 리테이너 링을 다시 절단하여 초과 DO 막 트림. 참고 :. 슬라이드 챔버에 대한 사양 Kiehart 등 13에서 찾을 수 있습니다이 챔버는 상업적으로 사용할 수 없습니다 및 기계 상점에 의해 정의 제조가 필요합니다.
2. 준비, Dechorionation 및 태아의 EPS 치료
- 시간을 재는 수집에 의해 배아를 준비. AM의 비행 문화 케이지에 신선한 포도 / 효모 판을 설정합니다. 배아가 25 ℃에서 1 시간 동안 배치 할 수 이 판을 취소하고 25 ℃에서 2 시간의 후속 배아 누워에 대한 신선한 포도 / 효모 플레이트로 교체 또한 개발 준비를위한 18 ° C의 배양기에서이 판과 장소를 수집합니다. 주 : 25 ° C에서의 개발의 1 시간은 개발의 2 시간과 동일18 ° C에서 최종 단계의 배아에서 EPS의 permeabilization을 유지하는 25 ° C에 비해 18 ° C에서 노화의 효과는 그림 2에서 볼 수 있습니다.
- Dechorionation. 조심스럽게 25 ° C의 수돗물과 붓을 사용하여 메쉬 바구니에 포도 판의 오프 배아를 씻어. 멀리 수돗물의 부드러운 스트림에서 바구니에 배아를 초과하는 효모를 씻어. 2 분 동안 50 %의 표백제에 바구니를 담근다. 철저하게 수돗물의 흐름에 따라 배아를 씻으십시오. 참고 : 부드럽게 간헐적으로 플라스틱 피펫을 사용하여 배아에 표백제 용액을 분출. 2 분 완료 dechorionation 보통 충분하지만,이 배양 시간은 직접 검사에 의해 확인하고 그에 따라 조정되어야한다. 수돗물에 침지 바구니에 dechorionated 배아를 유지하고 EPS 단계로 바로 진행합니다.
- EPS 치료
- 각 PBS의 약 10 ㎖로 여섯 60mm 요리를 준비합니다. 2.925 ㎖의 MBI에 75 μL의 EPS를 용해하여 EPS 희석을 준비소용돌이와 함께 50 ㎖ 유리 비이커 M (1시 40분). 참고 :이 혼합물에서 화이트 에멀젼 형태.
- 닦아 실험실과 메쉬 바구니의 바닥에서 여분의 물을 더 럽히. 비커에 희석 EPS에 바구니를 담그고 즉시 바구니의 바닥에있는 EPS 용액에 배아를 분산 소용돌이 친다. 30 초 동안 동작을 소용돌이 계속합니다. NOTE : EPS 희석 및 노출 시간은 투과성을 제어하도록 변할 수있다. 그것은 최적의 EPS 희석 및 처리 시간이 사용중인 파리의 변종으로 경험적으로 확립하는 것이 좋습니다. 60-90 초의 노출 시간을 증가 시키면 스테이지 (12)와 세 배아 유리하다.
- 바구니를 제거 닦아 랩으로 초과 EPS를 멀리 얼룩. 60mm 요리에 PBS 10 ㎖ 여섯 연속 세척을 진행합니다. 부드럽게 여섯 씻어 각 PBS와 배아를 분출하기 위해 플라스틱 피펫을 사용합니다. 염색 진행 및 약물 치료의 단계. 주 : EPS는 싱크대 아래로 배치 될 수있다.
Permeabilized 태아의 3. 염료와 약물 치료
- 염료 치료
- 10 mM의 CY5 카르 복실 산 염료 * 1.5 ML의 microfuge 튜브와 혼합하는 소용돌이에 MBIM-T (50 μM 최종 농도)의 ML 1의 5 μl를 추가합니다. 주 : * 염료의 선택은 다운 스트림 분석에 따라 달라집니다. CY5 카르 복실 산 고정 및 면역 염색을 사용하여 이후의 분석에 효과적입니다. 로다 민 B는 살아있는 배아의 분석에 유용합니다. 로다 민 B의 적색 발광, 그 대사 산물 (1)의 녹색 발광 형광을 사용하여 다운 스트림 응용 프로그램과 몇 가지 합병증을 표시 할 수 있습니다. 약물 또는 독소는이 단계에서 치료를 시작하기 위해, 또는이 단계에서 펄스 약물 / 독소 처리를 제한하는 염료 용액에 첨가 할 수있다. 케어 MSDS 및 환경 안전 표준에 따라 처리하고 약물과 독소를 처리하기 위해주의해야한다.
- 붓을 사용하여 염료 용액에 메쉬 바구니에서 배아를 전송합니다. 튜브 캡을 보장하기 위해 반복적으로 반전배아는 염료 용액에 현탁 자유롭게 떠. 실온에서 15 분 동안 경동 로커에 튜브를 놓습니다.
- nutator에서 튜브를 제거하고 배아가 정착 할 수 있습니다. 미세 피펫 염료 용액을 제거하고 씻어 MBIM-T 1 ㎖로 대체합니다. 완전히 배아를 다시 일시 중단 튜브를 반전. 배아가 정착하자 및 3 개의 MBIM-T 세척으로 반복합니다. 마지막 헹굼에서 모든 MBIM-T를 제거하고 배양 단계로 진행합니다.
- 배아 개발을위한 인큐베이션
- 개발 바구니 또는 슬라이드 실 : 두 개의 챔버 중 하나에 배아를 전송합니다. NOTE : 개발 바스켓 이상 발달 동안 바람직하고, 후속의 고정 및 면역 염색 단계가 실행되는 경우에 필요하다. 슬라이드 챔버는 높은 해상도 시간 경과 이미징을위한 최적 짧은 개발 기간 (예를 들어, 초기 배아 이벤트)에 가장 효과적이다. 약물이나 독소는 다양한 농도와 배아 D에서 배지에 첨가 할 수있다evelopment 표준 고정을 사용하여 프로토콜을 면역 염색 라이브 배아 또는 엔드 포인트에서 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.
- 바구니 개발
- 70 % 에탄올로 분출에 의해 개발 바구니를 청소, 탈 이온수로 깨끗이 씻어 닦아 실험실로 건조시킨다. 약물이나 독소를 원하는 농도로 배양 배지 6 ㎖를 준비합니다. 메쉬베이스에서 60mm 접시 돌보는에 트래핑하지 기포의 매체에 개발 바구니를 놓습니다. 참고 : 두 개의 미디어가 일반적으로 사용되는 : 50:50 혼합물 혼자 MBIM, 또는 MBIM/M3, 후자는 긴 개발 기간 동안 더 효과적.
- 페인트 브러시와 바구니의베이스 표면 메시 permeabilized 배아를 전송합니다. 조심스럽게 주변 저수지에서 미디어와 배아를 분출. 그들은 메시에 단일 층에 있도록 페인트 브러시와 배아를 분산. 주 : 현미경 영상을 진행하고 홍보의 permeabilization과 생존 특성을 평가eparation (단계 4 참조).
- 슬라이드 챔버 개발
- 슬라이드 실 전환 및 개구부의 둘레에 진공 그리스의 작은 구슬을 적용합니다. 오프닝 내 DO 막의 표면에 약물 또는 독소의 원하는 양의 매체 150 μl를 놓습니다. 참고 : 두 개의 미디어가 일반적으로 사용되는 : 50:50 혼합물 혼자 MBIM, 또는 MBIM/M3, 후자는 긴 개발 기간 동안 더 효과적.
- 페인트 브러시와 미디어의 하락 permeabilized 배아를 전송합니다. 그들이 드롭 내 막에 정착하는 배아를 분산.
- 조심스럽게하여 매체를 평평 입구에 25mm 원형 커버 슬립을 적용합니다. 그리스와 인감을 형성하는 커버 슬립의 주변을 따라 부드럽게 누르십시오. 주 : (4 단계 참조) 준비 permeabilization과 생존 특성을 평가하기 위해 영상을 현미경로 이동합니다.
4. IdentiPermeabilized 실행 가능한 태아의 문법을 없애는
- permeabilized 배아를 식별합니다. 디지털 카메라를 탑재하여 표면 형광 현미경 하에서 배아를 관찰한다. 고정 현미경과 카메라 설정을 사용하여 여러 필드 (프로파일 노른자 형광도를 결정하기 위해 파란색 파장) 이미지를 획득.
- 상대 형광 강도에 따라 배아의 permeabilization를 결정합니다. 바구니를 수용하고 배아의 조작을 할 수 있도록 큰 작동 거리와 입체 현미경을 사용합니다. 현미경은 프로그램 XYZ 스테이지, 표면 형광 조명 및 디지털 카메라가 장착되어야한다. 이미지는 나중에 지점에서 동일한 배아의 재평가를 가능하게 노출하고 각 배아 이미지의 무대 위치 매개 변수를 기록 돌보는 배아 (그림 3의 대표적인 결과 참조). 주 : 염료의 흡수 패턴은 사용 된 염료, 노출과 태아 연령의 길이에 따라 달라집니다. 넓은 범위의하나의 준비에서의 염료의 흡수는 전형적인하고 permeabilization의 정도의 변화를 반영한다.
- 가능한 배아를 식별합니다. permeabilized 배아의 위치를 표시 한 후, 실내 온도 25 ℃에서 배아 발달과 함께 계속 현미경 바구니 또는 슬라이드 챔버를 반환합니다. 파랑 채널 형광에서 관찰하고 이전에 확인 된 permeabilized 배아의 노른자 형광도의 이미지를 획득. 노른자 분포의 정상적인 진행에 따라 생존 능력을 평가 (랜드 등. 1과 그림 3의 대표적인 결과 참조). 주 : 명 시야 현미경으로 관찰 배아의 다른 형태의 특징 생존력을 평가하기 위해 사용될 수있다. 그것은 생존과 호환되는 투과성의 수준을 설정하면 각각의 염료 사용 파리의 변형으로 경험적으로 결정하는 것이 좋습니다.
- permeabilized 가능한 배아 약물 또는 독소의 효과를 평가합니다.
- proce 배아위의 프로토콜은 기존의 번호를 태세와 ssed은 약물이나 독소에 노출 이후의 분석. 분석의 여러 유형 중 일부는 아래의 설명에서 고려 직접 라이브 배아의 형태 형성의 관찰뿐만 아니라 사후 고정 면역 염색 분석을 포함한다. 이러한 방법은 모두 유전자 발현 패턴과 세포 계통 및 형태학 프로파일을 계시 중요한 염료 (예를 들면, GFP)을 사용하여 강화된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
배아의 처리 장치는 위의 프로토콜에있는 조작에 대해 "집에서 만든"장치를 시각화 지원하기 위해 그림 1에 있습니다. 그림 2에 보이는 결과 개발 후반 단계에서 EPS로 permeabilized하는 능력에 18 ° C에서 배아를 양육의 강력한 효과를 보여줍니다. 이 조건은 프로토콜 2.1 단계에 적용된다. 일반적으로 EPS 처리 배아에서 볼 투과성의 다양한 수준을 나타 내기 위해 CY5 카르 복실 산 염료의 효과는 그림 3에서 볼 수있다. 노른자에 염료 분포의 발달 역학도 생존 능력을 평가하는 데 사용되는 기준을 공개, 그림 3에서 볼 수있다 , 프로토콜에 설명 된대로 4.2 단계. 독소 처리, 포름 알데히드 고정 및 면역 염색에 후속 배아 permeabilization을 결정 CY5 염료 유틸리티는도 4의 결과에 의해 도시된다.
EPS 방법에 대한 그림 1. 배아의 처리 장치. 바닥이 평평한 바구니는 dechorination 사용 및 노출 단계 (A, A '를) EPS된다. 개발 바구니는 permeabilized 태아의 이상 발달 노출 (B, B ')에 사용됩니다. 슬라이드 챔버는 짧은 개발 노출 라이브 배아의 높은 해상도의 영상에 사용되는 (C, C '. 추가 설명 텍스트를 참조하십시오).
그림 2. 효과 후반 단계의 배아에서 EPS의 효능에 18 ° C에서 노화의. 태아는 20 시간 (패널 AA "에 대해 18 ° C에서 숙성을 두 시간 동안 수집 하였다,
그림 3. 투과 및 실행 가능한 배아 CY5의 설립. 태아는 (25 ° C, 12 단계에서 7-9 시간의 배아에 해당) 18 ° C에서 14 시간 동안 2 시간 숙성을 위해 25 ° C에서 수집되었다. dechorination 후, 치료가 CY5 염료의 배양 (15 분 MBIM-T에서 50 μM) 다음 (1 분 MBIM에 1:40) 이루어졌다 EPS. 배아 MBIM-T로 3 회 세척하고 저장조에 MBIM로 개발 바구니에 옮겼다. 개발은 P 하였다실온에서 8 시간 동안 roceed. CY5 (레드)의 통풍 관은 즉시 염색 처리 및 세척 (패널 A) 후 8 시간 개발 (패널 B) 후 원적외선 채널 이미지가됩니다. 노른자의 분포는 파랑 채널에 형광도에 의해 볼 수 있습니다. 염료의 흡수, 따라서 투자율은 배아에서 배아를 다양하게 볼 수 있습니다. CY5 색소 (빨강)은 스테이지 (16) (보라색, 패널 B)에서 창자의 루멘에 집중되고 노른자 (파란색), 지역화에 볼 수 있습니다.
고정 및 면역 염색 배아 permeabilization 및 메틸 수은 효과의 그림 4. 결정. 배아는 (25 ° C, 12 단계에서 7-9 시간의 배아에 해당) 18 ° C에서 14 시간 동안 2 시간 숙성을 위해 25 ° C에서 수집되었다. dechorination 후, EPS의 치료에서 인큐베이션 (1 분 MBIM에 1:40) 이루어졌다CY5 염료 (15 분 MBIM-T에서 50 μM) 함께 메틸 수은과 (50 μM 메틸 수은, 패널 B) 또는 DMSO 용매 제어 (최종 농도 0.1 %, 패널 A). 태아는 MBIM-T로 세척하고 MBIM와 개발 바구니에 배치했다 : M3의 저수지 중간 실온에서 추가로 8 시간 동안 세. 태아는 다음 표준 프로토콜 (14)에 의해 2 단계 4 % 파라 포름 알데히드-헵탄 준비에 수정되었습니다. 염색은 운동 신경 및 안티 elav 항체 (빨간색, B)의 모든 신경 세포 기관을 레이블에 레이블을 방지 Fasciclin II (A, B에 녹색과 흰색 ', B')를 수행 하였다. CY5 염료는 (CY5는 의사 색 모든 패널에있는 파란색)에 의한 고정으로 인해 감소 된 형광 세기에 확장 노출을 필요로 직접 형광에 의해 드러났습니다. 메틸 수은의 효과는 불규칙한 패턴과 cluste에서 볼 수 있습니다(빨간색으로 표시하고 대 B에 흰색 화살표로 표시 elav 양성) 측면 chordotonal 신경 세포 기관의 반지. 또한, 분절 (SN) (A 고체 녹색 화살표 ')의 특성 분기는 배아 15 메틸 수은의 이전에보고 된 영향과 일치하는 메틸 수은 노출 (B 고체 녹색 화살표 ")와 높은 변수로 볼 수있다. 마디 사이와 자신의 뿌리에 신경 분절의 투사는 메틸 수은의 노출 (B에서 열려 녹색 화살표 ')와 함께 후방으로 변위에 볼 수 있습니다. 참고 : 메틸 수은은 강력한 신경 독소입니다. 케어는 취급시 장갑과 보호 안경을 착용하고주의해야한다. 폐기 제도적 환경 안전 시설과 서비스를 통해 수행해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
위의 방법은 다양한 개발 범위에 걸쳐 작은 분자 치료에 접근 가능한 Drosophila의 배아를 획득 할 수있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 이전에는 초기 단계의 배아에서와 같이 18 ° C에서 배아를 노화 동일한 효능과 최종 단계의 배아의 permeabilization을 가능하게하는 소설과 간단한 발견을 소개합니다. 또, 투과 표시와 같은 원적외선 염료 CY5 카르 복실 산의 사용은 포스트 픽스 애플리케이션에 효과 입증 발달 표현형을 나타 내기 위해 사용할 수있는 종래의 적색 및 녹색 형광 표식을 방해하지 않는다. 이러한 연구 결과는 크게 EPS 방법의 효능과 유틸리티를 진행.
이 방법은 생활과 고정 된 배아의 준비를 모두 분석에 대한 의무입니다. 시야 현미경 및 설정 슬라이드 챔버를 사용하여 배아 발달의 전반에 득점 전형적인 특징은 형태 발생의 움직임이다 등배반 엽, 두부 고랑 형성, germband 신장 및 germband 후퇴 1 cellularization. GFP 또는 RFP 기자들과보다 구체적인 엔드 포인트는, 예를 들어, 초기 분할 패턴과 이후 개발 1의 신경 구조의 형성을 식별 할 수 있습니다. GFP 및 RFP 보고서는 슬라이드 챔버와 개발 바구니 준비에 모두 permeabilized 배아 생활의 발달 이벤트의 관찰을 가능하게합니다. 도포 약물 또는 화학 물질의 총 독성을 결정하는 간단한 방법을 개발 한의 지연 또는 중지를 결정하는 파랑 채널에서 난황 단백질 자동 형광의 패턴을 모니터한다.
EPS 방법은 비 모델 곤충, 달걀 껍질의 유사한 아키텍처를 공유 특히 모기에 대한 조사 도구를 확대에 대한 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 다른 곤충 종의 배아에 작은 분자의 응용 프로그램 investigati의 길을 열 것입니다위치에 기능 연구와 표준 유전 방식은 현재 부족하다. 바구니에 개발 된 배아 따라서 초파리 연구에 사용할 면역 염색 시약의 넓은 배열 분석을 열고, 포름 알데히드 고정 용 처리 할 수 있습니다. 그러나,이 단계는 permeabilization의 사후 수정의 결정이 약물에 접속이 가능했다 배아와 표현형의 상관 관계를 실현하는 것이 필요합니다. CY5 카르 복실 산 염료의 응용 프로그램이 접근 방식에 대한 매우 효과적인 입증되었습니다. CY5 카르 복실 산을 효율적으로 permeabilized 배아 (그림 3A)에서 가져온 것입니다. 개발하는 동안 CY5는 궁극적으로 (그림 3B) 나중에 14에 형성 창자의 루멘에 압수되고 노른자에 집중되어있다. 고정 후, CY5 형광이 현저하게 감소, 아직 확실하게 감지의 용기와 (대표 입술을 참조 효과적으로 초기에 permeabilized 된 그 배아의 마커 역할을한다ULT 그림 4). 이것은이 단계에서 CY5 검출 검출 용 이상 카메라 노출 (예를 들면 1-4 초)을 필요로 주목해야한다. 따라서, 면역 염색 패턴 표현형의 채점은 조직 특이 마커 (예를 들어,도 4에 보이는 신경 특이 항체)와 함께 유사 permeabilized 배아를 확인 CY5 신호를 사용하여 진행할 수있다.
이 방법의 가장 큰 문제는 permeabilization 과정, 긴이 방법 9,10,16을 개발하기 전에 시도를 고민하고있다 뭔가 배아 생존의 감도입니다. permeabilization 이후의 생존 능력은 연령에 따라 굳어이며, 극적으로 증가 이전의 배아는 permeabilization 9시입니다. 우리가 이전에 보여 아직, 투자율은 1 세와 점점 더 어려워진다. 최근의 보고서는 지금 다시 호출 간염에 의해 최종 단계의 배아 (단계 14)을 투과 할 수있는 능력을 보여줍니다D-리모넨 (17)와 함께 용매로 타네. 하나의 약물 효과를 나타내었다 (노 코다 졸) 및 초기 단계의 배아에 응용 프로그램이 17을 설명하지 않은으로 후자의 방법의 광범위한 유틸리티는 명확하지 않다. 또한, 추가 금리 말기 투과성 위에서 설명한 18 ° C 개발 단계의 응용 프로그램과 독성 유기 용매의 사용을 방지 할 수 있습니다. EPS 프로토콜에 대한 새로운 조사는 초기 시도시 permeabilization과 생존 결과에 변화를 경험하게 될 것입니다. 여기에 설명 된 단계를 체계적으로 그들은 자신의 실험실 환경에서 작업하는 초파리의 특정 변종에 대한 조건을 최적화하기 위해 permeabilization 치료 이후 배양 단계의 조건을 변경하는 연구자에게 도구를 제공합니다.
방법에 추가 과제는 배아에서 배아에 볼 화학 흡수의 변화입니다. 이 변화는의 이질성에 반영됩니다CY5 염료의 흡수는 바로 색소 치료 (그림 3A) 후 배아에서 볼. 대조적으로, 로다 민 B 염료는보다 신속하고 균일 배아 조직에 분산 CY5 염료 (도 2B ")보다 길다. 따라서, 일부 배아 - 투 - 배아 변화는 화학 물질, 약물 또는 그 독소의 분포 특성에 숨겨 및 방법에 내재 될 수 있습니다. 투여 량의 정량화가 중요한 경우, 그것은 관심의 약물 또는 독소의 흡수는 다른 분석 방법을 특징으로하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고, 위의 프로토콜의 용이성 및 배아의 수백을 스크린 할 수있는 능력이 고도로 발달 한이있는 특징 약물이나 독소에 강력한 첫 번째 방법에 대한 만들기, 용량 반응을 평가하고 자원의 작은 투자 특성 표현형 점수를 조사 할 수 있습니다 모델 시스템.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
