Summary
Einführung von kleinen Molekülen in die Entwicklungs Drosophila-Embryo bietet ein großes Potenzial für die Charakterisierung der biologischen Aktivität der neuen Verbindungen, Drogen und Giftstoffe sowie für die Sondierung grundlegenden Entwicklungspfade. Hier beschriebenen Verfahren skizzieren Schritte, die natürlichen Barrieren zu diesem Ansatz zu überwinden, erweitern den Nutzen der Drosophila-Embryo-Modell.
Abstract
Die Drosophila-Embryo ist seit langem ein leistungsfähiges Labormodell für die Aufklärung der molekularen und genetischen Mechanismen, welche die Entwicklung steuern. Die Einfachheit der genetischen Manipulationen mit diesem Modell pharmakologische Ansätze, die in anderen Tiermodellen und Tests auf Zellbasis alltäglich sind verdrängt. Hier beschreiben wir die jüngsten Fortschritte in einem Protokoll, Anwendung von kleinen Molekülen ermöglicht, den Entwicklungsfruchtfliegenembryo. Das Verfahren vor, um die Details Dichtigkeit der Eierschale zu überwinden und gleichzeitig Embryo Lebensfähigkeit. Eierschale Permeabilisierung in einem breiten Spektrum von Entwicklungsstufen wird durch Anwendung eines zuvor beschriebenen d-Limonen Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS 1) und durch Alterung Embryonen bei reduzierter Temperatur (18 ° C) vor der Behandlung erreicht. Darüber hinaus ist die Verwendung eines fernen Rot-Farbstoff (CY5) als Permeabilisierung Indikator beschrieben, die mit stromabwärts Verwendung von handelsüblichen roten und grünen Grippe kompatibel istorescent Farbstoffe in lebenden und fixierten Präparaten. Dieses Protokoll ist auf Studien mit bioaktiven Verbindungen zu Entwicklungsmechanismen für ein Studium an der Bewertung teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized richtet Sonde als auch.
Introduction
Die Drosophila-Embryo weiterhin ein erstklassiges Modell für die Untersuchung grundlegender Mechanismen der Entwicklung 2 sein. Dieses leistungsstarke Modell wird durch eine breite Palette von molekulargenetischen Werkzeugen, die Manipulationen der wesentlichen jedem Gen zu jedem Zeitpunkt und in jeder sich entwickelnden Organ erlauben unterstützt. Die geringe Größe, die schnelle Entwicklung und umfangreiche Charakterisierung der Morphogenese des Drosophila-Embryos machen es zu einem Modell der Wahl für genetische Bildschirme, von denen viele grundlegende Entwicklungswege aufgedeckt 3,4. Zahlreiche Phänotypen in Drosophila-Embryos wurden aus und sind leicht zu interpretieren, die oft ein Mittel, um die molekularen genetischen Mechanismen, die eine abnorme Merkmal verantwortlich zu identifizieren.
Historisch gesehen, ein Mangel des Fliegenembryo Modell war die Schwierigkeit der Einführung kleine Moleküle zu embryonalen Geweben. 1) uns: Dieses Hindernis hat Beschränkungen gestelltten bekannten bioaktiven kleinen Molekülen als Sonden zur Entwicklungsmechanismen zu verhören und 2) mit diesem etablierten Modell teratogene oder pharmakologische Aktivität von kleinen Molekülen uncharacterized beurteilen. Als Folge hat das Screening Potential des Fliegenembryo in Charakterisierung von Kleinmolekül-Aktivität nicht ausgelastet ist.
1) Permeabilisierung der Eierschale und 2) Mikroinjektion: Abgabe kleiner Moleküle Fliegenembryo kann mit zwei Methoden erreicht werden. Dieser Artikel stellt Fortschritte der Methode der Permeabilisierung, die einfach in der Einstellung eines herkömmlichen Drosophila Labor auszuführen sind. Es sei darauf hingewiesen, dass die jüngsten Fortschritte in der Mikroinjektionsverfahren mit Mikrofluidik-Technologie trägt auch auf Verfahren zum Einführen von Verbindungen in den Embryo 5,6 ist. Einführen von Molekülen in den Embryo durch eine Wachsschicht von der Eierschale 7 verhindert. Die Drosophila Eierschale besteht aus fünf Schichten. Ausdie von innen nach außen sind sie: die Dotterhaut, die wachsartige Schicht, die innere Chorion-Schicht, der endochorion und die exochorion 8. Die drei Außen Chorion-Schichten können durch kurze Auftauchen des Embryos in verdünnter Bleichmittel entfernt werden, so wird ein Schritt, um so dechorionation. Die freiliegende Wachsschicht kann dann durch Exposition gegenüber organischen Lösungsmitteln, wie Heptan und Octan 7,9, wodurch die dechorionated Embryo lässigen beeinträchtigt werden, während es noch in der zugrunde liegenden Dottermembran umhüllt. , Verwendung dieser Lösungsmittel führt jedoch Komplikationen aufgrund ihrer Toxizität und der Schwierigkeit bei der Regulierung ihrer starken permeabilisierend Aktion, die beide stark negativen Effekte auf den Embryo Lebensfähigkeit 9,10.
Ein Verfahren zur Permeabilisierung unter Verwendung einer Zusammensetzung bezeichnet Embryo Permeabilisierung Lösungsmittel (EPS) wurde bereits beschrieben 1 gewesen. Diese Lösungsmittel aus d-Limonen und von Pflanzen abgeleitete Tenside, die Lösungsmittel ermöglichen miscibl seine mit wässrigen Puffern. Die niedrige Toxizität von d-Limonen und die Fähigkeit des Lösungsmittels auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen ist eine wirksame Methode zur lässigen Embryonen mit hoher Lebensfähigkeit 1 erzeugen ergab. Jedoch sind zwei endogene Faktoren weiterhin Beschränkungen hinsichtlich der Anwendung zu bringen. Zunächst Embryonen zeigen Heterogenität der Durchlässigkeit nach EPS-Behandlung, auch wenn darauf geachtet wird, schließen Entwicklungs Inszenierung halten. Zweitens Embryonen älter als etwa acht Stunden haben schwer zu permeabilisieren, im Einklang mit einer Verhärtung der Eierschale, die nach der Eiablage 11 tritt bewährt.
Hier beschrieben werden, sind Fortschritte in der EPS-Verfahren, dass: 1) bei der Identifizierung und Analyse von nahezu identisch permeabilisiert Embryonen, auch nach Fixierung und Immunfärbung Schritte ausgeführt worden sind und 2) zu ermöglichen Permeabilisierung der Embryonen im späten Entwicklungszeitpunkten (> 8 h, Bühne 12 und älter). Insbesondere Anwendung eines dunkelroten Farbstoff,CY5 Carbonsäure, beschrieben, die als Durchlässigkeit Anzeige, die während der Entwicklung und nach Formaldehydfixierung im Embryo weiterhin dient. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Aufzucht Embryonen bei 18 ° C hält die Eierschale in eine EPS-sensitiven Zustand, so dass Permeabilisierung der späten Phase Embryonen (Stufen 12-16).
Diese Fortschritte zu überwinden, die zuvor erwähnten Einschränkungen für die EPS-Methodik. Diese Anwendung wird daher stellen die Ermittler mit einem Mittel, um kleine Moleküle von Interesse für den Embryo in unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten einführen und gleichzeitig Rentabilität.
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Protocol
1. Vorbereitung von Fly Kulturen, Lösungen und Embryo Handhabung Devices
- Bereiten Sie einen Käfig Kultur von Drosophila. Zeigen 500 + Paarung fliegt von den gewünschten Stamm in einer Population Käfig mit einem 10 cm Trauben-Agar-Platte und einen Ort der Hefe-Paste ausgestattet. Pflegen Kultur in einem 25 ° C Luftfeuchtigkeit gesteuert Inkubator. Hinweis: Cage Kulturen erfordern ein oder zwei Tage, um konsistente Anlage Embryo Verlegemuster zu erhalten. Grape Platten mit Hefe-Paste werden, einmal morgens und einmal abends während Anlage geändert.
- Bereiten EPS. Warmen Lösungen von Tensiden (Cocamide DEA und ethoxylierter Alkohol) bei 37 ° C. Pipette 18 ml d-Limonen mit einem Szintillations-Glasampulle, die mit einem kleinen Rührstab ausgestattet. Pipette jeder der beiden Tenside (5% Endkonzentration jedes) 1 ml zu der d-Limonen. Gründlich mischen und entfernen Rührstab. HINWEIS: Diese Stammlösung von EPS ist gut für ca. 2 Monate bei Raumtemperatur. Die Lösungsollte bei 37 ° C erwärmt und geschüttelt, um vollständig zu solubilisieren Tenside vor Gebrauch. EPS-und d-Limonen ist in einem Glasbehälter aufbewahrt, da sie einige Kunststoffe mit der Zeit zu lösen.
- Bereiten Embryo dechorionation Lösung, Inkubation Medien-, Farbstoff-und Arzneimittellösungen. Mischen Sie 25 ml Bleichmittel mit 25 ml H 2 O und in flache Schale. Bereiten modifizierten Grund Inkubationsmedium (MBIM) und MBIM-T nach dem Stand der Rezeptur 1,12. Bereiten Shields und Sang M3 Zellkulturmedium und PBS nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialliste). Bereiten Stammlösung von Permeabilisierung Farbstoff bei 10 mM Konzentration in DMSO.
- Montieren Embryo-Handling-Geräte und Zubehör:
- Bereiten dechorionation und EPS Behandlung Korb (siehe Abbildung 1A). Schneiden Sie ein 3 cm Abschnitt einer Wegwerf 50 ml Polypropylen-Zentrifugen / Kulturröhrchen mit einer Feinsäge. Machen Sie den Schweißfläche bündig durch Reiben der Rohrabschnitt auf Sandpapier eingehaltenauf eine Tischfläche. Schweißnaht der Rohrabschnitt um Nitex Nylonnetz durch Schmelzen des Randes der Rohrabschnitt über einer Flamme und Drücken auf das Netz auf einer Glasplatte. Abkühlen lassen und schneiden Sie zusätzliche Mesh. HINWEIS: Die schiere Seiten und der Unterseite ermöglichen eine schnelle und vollständige Abspülen von Restbleichmittel und EPS in den jeweiligen Schritten. Die Schweißschritte sollten unter einem Abzug durchgeführt werden.
- Bereiten Sie eine Entwicklung Korb. Abgeschnittenen oberen Teil einer 50-ml-Zentrifugen / Kulturrohr bündig mit dem Rand der Kappe. Entfernen und ändern Sie die Kappe durch Ausschneiden eines zentralen Öffnung und Kerben am Rand wie in 1B gezeigt. Schrauben Sie die Kappe über dem Netz und auf das Gewinde der abgeschnittenen Rohrabschnitt und trimmen zusätzliche Mesh. HINWEIS: Die Kappe enthält Aussparungen in der Felge, die Diffusion zu ermöglichen, der Groß Medium, wenn in der 60 mm Reservoir Gericht (Abbildung 1B) positioniert.
- Bereiten Komponenten eines Schieberraum. Schneiden Sie ein Quadrat von DO-Membran, die größer ist alsder Schieber Kammeröffnung. Tragen Sie eine sehr dünne Schicht Vakuumfett an der Innenseite Lippe der Öffnung. Befestigen Sie die DO Membran in die Öffnung gegen die Dichtfett mit dem Haltering. Schneiden Sie überschüssige DO Membran, indem sie wieder in der Nähe der Haltering. HINWEIS:. Spezifikationen für die Folie Kammer kann in Kiehart et al 13 zu finden Diese Kammer ist nicht im Handel erhältlich und erfordert kundenspezifische Herstellung von einer Werkstatt.
2. Staging, Dechorionation und EPS Behandlung von Embryonen
- Staging Embryonen durch zeitgesteuerte Sammlung. Stellen Sie eine frische Traube / Hefe Platte zur Fliege Kultur Käfig in der Uhr. Embryonen ermöglichen, für 1 h bei 25 ° C festgelegt werden Entsorgen Sie diesen Platte und ersetzen mit einer frischen Traube / Hefe Platte für eine spätere Embryo Verlegung von 2 h bei 25 ° C Sammeln Sie diese Platte und in 18 ° C-Inkubator für die weitere Entwicklungs Inszenierung. ANMERKUNG: 1 h Entwicklung bei 25 ° C gleich 2 h Entwicklungbei 18 ° C. Die Wirkung der Alterung bei 18 ° C gegenüber 25 ° C auf die Aufrechterhaltung EPS Permeabilisierung im späten Stadium Embryonen können in Fig. 2 gesehen werden.
- Dechorionation. Embryonen vorsichtig abspülen Traubenplatte in Gitterkorb mit 25 ° C Leitungswasser und einem Pinsel. Spülen Sie überschüssige Hefe weg von den Embryonen in den Korb unter einem leichten Strom von Leitungswasser. Tauchen Sie den Korb in 50% Bleichmittel für 2 min. Embryonen gründlich unter fließendem Leitungswasser waschen. HINWEIS: spritzen vorsichtig Bleichmittel-Lösung auf der Embryonen intermittierend mit einer Plastikpipette. Während 2 Minuten ist in der Regel für die komplette dechorionation ausreichend, sollte dieser Inkubationszeit durch direkte Untersuchung überprüft und entsprechend angepasst werden. Pflegen dechorionated Embryonen in den Korb in Leitungswasser getaucht und gehen sofort in die EPS Schritt.
- EPS-Behandlung
- Bereiten Sie sechs 60 mm-Platten mit ca. 10 ml PBS in jedem. Bereiten EPS Verdünnung durch Auflösen von 75 ul EPS in 2.925 ml MBIM (1.40) in einem 50 ml Becherglas mit Verwirbelung. Hinweis: Eine weiße Emulsion bildet aus dieser Mischung.
- Überschüssiges Wasser aus dem Boden der Siebtrommel mit einem Labor zu wischen. Tauchen Warenkorb in verdünnter EPS im Becher und sofort wirbeln Embryonen in der EPS-Lösung in der Boden des Korbes zu verteilen. Weiter Wirbelbewegung für 30 Sekunden. HINWEIS: EPS Verdünnungen und Belichtungszeiten können variiert werden, um Durchlässigkeit zu steuern. Es wird empfohlen, dass eine optimale EPS Verdünnungen und Behandlungszeiten empirisch mit den Stämmen von Fliegen verwendet festgelegt werden. Steigende Belichtungszeit auf 60-90 sec ist günstig für Stufe 12 und älter Embryonen.
- Entfernen Korb, tupfen Sie das überschüssige EPS mit einem Labor zu wischen. Fahren Sie mit sechs aufeinanderfolgenden Waschungen in 10 ml PBS in den 60-mm-Schalen. Mit einem Kunststoff-Pipette vorsichtig spritzen Embryonen mit PBS in jede der sechs Wäschen. Gehen Sie zu färben und Drogenbehandlungsschritte. Hinweis: EPS kann in den Ausguss entsorgt werden.
3. Dye and Drug Behandlung von permeabilisierten Embryonen
- Dye-Behandlung
- Mit 5 &mgr; l 10 mM CY5 Carbonsäurefarbstoff * 1 ml MBIM-T (50 &mgr; M Endkonzentration) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Wirbel zu mischen. HINWEIS: * Wahl der Farbstoff abhängig von Folgeanalyse. CY5 Carbonsäure ist für spätere Analysen mit Fixierung und Immunfärbung. Rhodamin B ist hilfreich für die Analyse von lebenden Embryonen. Die rote Emission von Rhodamin B und der grüne Emission seiner Metaboliten 1 kann einige Komplikationen mit Downstream-Anwendungen unter Verwendung von Fluoreszenz zu präsentieren. Medikament oder Toxin kann zu der Farbstofflösung zugegeben werden, um die Behandlung zu diesem Zeitpunkt zu initiieren, oder Arzneimittel / Toxin-Behandlung auf einen Puls an dieser Stelle zu begrenzen. Es sollte nach MSDS-und Umweltsicherheitsstandards genommen zur Handhabung und Entsorgung von Medikamenten und Giftstoffe werden.
- Übertragen Embryonen aus dem Gitterkorb auf die Farbstofflösung mit einem Pinsel. Das Röhrchen und invertieren wiederholt, um sicherzustellen, dass dieEmbryonen frei schweben in Suspension in der Farbstofflösung. Das Röhrchen auf einem Taumel Wippe für 15 min bei Raumtemperatur.
- Röhrchen aus Nutator und lassen Embryonen zu begleichen. Entfernen Farbstofflösung mit einer feinen Pipette und ersetzen mit 1 ml MBIM-T zu waschen. Kehren Rohr wieder auszusetzen Embryonen vollständig. Lassen Embryonen zu regeln, und wiederholen Sie mit drei weiteren MBIM-T Wäschen. Entfernen Sie alle MBIM-T von Schlussspülung und zur Inkubation Schritt.
- Inkubation für Embryo-Entwicklung
- Transfer-Embryonen mit einer von zwei Kammern: Die Entwicklung Korb oder die Schiebekammer. HINWEIS: Die Entwicklung Korb für längere Entwicklungszeiten bevorzugt, und ist erforderlich, wenn nachfolgende Fixierung und Immunfärbung Schritte auszuführen sind. Die Schieberraum ist optimal für die höhere Auflösung Zeitraffer-Bildgebung und ist am effektivsten für kurze Entwicklungszeiten (zB den frühen embryonalen Ereignisse). Medikament oder Toxin kann zu dem Medium bei verschiedenen Konzentrationen und Embryo d angefügtntwicklung können in Echtzeit mit Live-Embryonen oder an einem Endpunkt mit Standard-Fixierung und Immunfärbung Protokolle überwacht werden.
- Entwicklung in Körbe
- Reinigen Sie eine Entwicklungs Korb durch Spritzen mit 70% Ethanol gründlich mit entionisiertem Wasser und trocken tupfen mit Labor zu wischen. Bereiten 6 ml Inkubationsmedium mit der gewünschten Konzentration des Wirkstoffs oder Toxin. Legen Sie die Entwicklung Korb in Medium in 60-mm-Schale kümmert nicht Falle Luftblasen unter dem Mesh-Basis. HINWEIS: Zwei Medien werden üblicherweise verwendet: MBIM allein oder MBIM/M3 in einer 50:50-Mischung, wobei letztere für längere Entwicklungszeiten effektiver.
- Übertragen permeabilisiert Embryonen Oberfläche in der Basis der Korb mit einem Pinsel Netz. Sanft spritzen die Embryonen mit Medien aus dem umgebenden Reservoir. Dispergieren der Embryonen mit dem Pinsel, so dass sie in einer Monoschicht auf dem Gitter sind. Hinweis: Fahren Sie mit Mikroskopie und Permeabilisierung und Lebensfähigkeit Eigenschaften des pr bewerteneparation (siehe Schritt 4).
- Entwicklung in der Chamber Slide
- Invertieren Schieberkammer und eine kleine Wulst Vakuumfett auf dem Umfang der Öffnung. Platzieren 150 &mgr; l Medium mit der gewünschten Menge des Arzneimittels oder Toxins an der Oberfläche der DO Membran innerhalb der Öffnung. HINWEIS: Zwei Medien werden üblicherweise verwendet: MBIM allein oder MBIM/M3 in einer 50:50-Mischung, wobei letztere für längere Entwicklungszeiten effektiver.
- Übertragen permeabilisiert Embryonen in die Drop-Medien mit einem Pinsel. Dispersions die Embryonen so dass sie auf der Membran innerhalb des Tropfens zu begleichen.
- Eine kreisförmige Deckglas 25 mm über der Öffnung, wodurch das Medium Abflachung vorsichtig anzuwenden. Andrücken entlang des Umfangs des Deckglases, um eine Dichtung mit dem Fett bilden. Hinweis: Fahren Sie mit Mikroskopie zu Permeabilisierung und Lebensfähigkeit Eigenschaften der Zubereitung zu bewerten (siehe Schritt 4).
4. Identifizierung von permeabilisierten Lebensfähige Embryonen
- Identifizieren permeabilisiert Embryonen. Embryonen beobachten unter Epifluoreszenz mit einem Mikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet. Erwerben Sie Bilder aus mehreren Feldern mit festen Mikroskop-und Kameraeinstellungen (im blauen Wellenlängen, um das Profil Eigelb Autofluoreszenz zu bestimmen).
- Bestimmen Sie Permeabilisierung von Embryonen auf der relativen Fluoreszenzintensität. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit einem großen Arbeitsabstand, um den Korb unterzubringen und Manipulationen der Embryonen zu erlauben. Das Mikroskop ist mit einem programmierbaren XYZ-Bühne, Epifluoreszenz-Beleuchtung und einer Digitalkamera ausgestattet sein. Bild die Embryonen dabei darauf achten, Belichtung und Bühnenpositionsparameter jeder Embryo Bild aufzunehmen, um eine erneute Bewertung der gleichen Embryonen zu einem späteren Zeitpunkt zu ermöglichen (siehe repräsentatives Ergebnis in Abbildung 3). Hinweis: Muster der Farbstoffaufnahme in Abhängigkeit von dem verwendeten Farbstoff, der Expositionsdauer und Embryoalter variieren. Eine breite Paletteder Farbstoffaufnahme in einem einzigen Präparat ist typisch und spiegelt die Variation in dem Grad der Permeabilisierung.
- Identifizieren lebensfähige Embryonen. Nach der Markierung permeabilisiert Position Embryonen weiter mit Embryoentwicklung bei Raumtemperatur oder 25 ° C. Zurück Korb oder Schieberraum zu Mikroskop. Beachten unter blauem Kanal-Fluoreszenz-und Bild Eigelb Autofluoreszenz in permeabilisierten zuvor identifizierten Embryonen zu erwerben. Bewerten Lebensfähigkeit nach den üblichen Fortschreiten der Dotterverteilung (siehe Rand et al. 1 und repräsentatives Ergebnis in Abbildung 3). Hinweis: Andere morphologische Merkmale der mit Hellfeldmikroskopie beobachtet Embryo kann verwendet werden, um die Lebensfähigkeit zu bewerten. Es wird empfohlen, dass die Festlegung der Durchlässigkeit, die mit Lebensfähigkeit kompatibel ist empirisch mit jedem Farbstoff und Belastung von Flug verwendet wird, bestimmt werden.
- Bewerten Droge oder Gift Effekte in permeabilisierten lebensfähige Embryonen.
- Embryonen Verfahmit dem obigen Protokoll sind für eine Reihe von herkömmlichen bereit ssed analysiert anschließend an Medikament oder Toxin-Exposition. Einige der verschiedenen Arten von Analysen werden in der Diskussion unten betrachtet und umfassen die direkte Beobachtung der Morphogenese in Live-Embryonen als auch nach der Fixierung Immunfärbung analysiert. Beide Ansätze werden durch die Verwendung von Vitalfarbstoffen (z. B. GFP), das Gen-Expressionsmuster und die Zelllinie und Morphologie Profile zeigen verbesserte.
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Representative Results
Embryo Handhabungsvorrichtungen sind in Fig. 1 dargestellt, um bei der Visualisierung der "home-made"-Geräte für die Manipulation in den obigen Protokollen unterstützen. Ergebnisse in Abbildung 2 zu sehen veranschaulichen die Wirkung der robuste Aufzucht Embryonen bei 18 ° C auf ihrer Fähigkeit, durch EPS in späten Stadien der Entwicklung durchlässig gemacht werden. Dieser Zustand wird im Schritt 2.1 Protokoll angewendet. Wirksamkeit des CY5 Carbonsäurefarbstoff, um die verschiedenen Niveaus der Durchlässigkeit typischerweise im EPS behandelten Embryonen gesehen zeigen, ist in Fig. 3 zu sehen. Die Entwicklungsdynamik des Farbstoffverteilung im Eigelb ist auch in Fig. 3 zu sehen ist, offenbart ein Kriterium verwendet werden, um die Lebensfähigkeit zu bewerten , wie im Protokoll beschriebenen Schritt 4.2. Die Nützlichkeit von Cy5-Farbstoff bei der Bestimmung Embryo Permeabilisierung anschließend an Toxin Behandlung Formaldehydfixierung und Immunfärbung wird durch das Ergebnis in Fig. 4 dargestellt.
Abbildung 1. Embryo Handhabungsgeräte für die EPS-Methode. Die flachen Korb in dechorination verwendet und EPS-Belichtungsstufen (A, A '). Die Entwicklung Korb ist für längere Entwicklungskredite von permeabilisierten Embryo (B, B ') eingesetzt. Der Schiebekammer für kürzere Entwicklungsengagements und eine höhere Auflösung Bildgebung von lebenden Embryonen verwendet (C, C '. Siehe Text für weitere Beschreibung).
2. Auswirkungen der Alterung bei 18 º C auf EPS Wirksamkeit im späten Stadium Embryonen. Embryonen wurden für zwei Stunden, gefolgt von Alterung bei 18 ° C für 20 h (Panels AA "gesammelt,
3. Einbau von Cy5 durchlässig und in lebensfähiger Embryonen. Die Embryonen wurden bei 25 ° C für 2 Stunden gealtert und für 14 h bei 18 ° C (entspricht 7-9 h Embryonen bei 25 ° C, Stufe 12) gesammelt. Nach dechorination, EPS-Behandlung wurde (für 1 min 1:40 MBIM) gemacht, gefolgt von Inkubation in CY5 Farbstoff (50 uM in MBIM-T für 15 min). Embryonen wurden dreimal in MBIM-T gewaschen und die Entwicklung Korb mit MBIM im Behälter überführt. Die Entwicklung wurde auf p erlaubtfür 8 h bei Raumtemperatur roceed. Die Aufnahme von CY5 (Rot) wird im Fern roten Kanal unmittelbar nach Farbstoff Behandlung und Waschen (Teil A) und nach 8 h Entwicklung (Feld B) abgebildet. Verteilung des Eigelbs durch Autofluoreszenz in dem blauen Kanal zu sehen. Farbstoffaufnahme, damit Durchlässigkeit, ist zu sehen, unterscheiden sich von Embryos Embryos. Cy5-Farbstoff (rot) zu sehen ist, um den Dotter (blau), die eingeengt, um das Lumen des Darms an der Stufe 16 (lila, Tafel B) wird zu lokalisieren.
Abbildung 4. Bestimmung der Permeabilisierung und Methyl Effekte in fest-und immun Embryonen. Embryonen wurden bei 25 ° C für 2 Stunden gealtert und für 14 h bei 18 ° C (entspricht 7-9 h Embryonen bei 25 ° C, Stufe 12) gesammelt. Nach dechorination wurde EPS-Behandlung (1 min 1:40 MBIM) gemacht, gefolgt von der Inkubation inCY5 Farbstoff (50 uM in MBIM-T für 15 min) zusammen mit Methylquecksilber (50 uM MeHg, Feld B) oder Lösungsmittelkontrolle DMSO (0,1% Endkonzentration, Teil A). Embryonen wurden mit MBIM-T gewaschen und in einer Entwicklungs Korb mit MBIM gelegt: M3-Medium in dem Reservoir und gealtert für zusätzliche 8 h bei Raumtemperatur. Embryonen wurden dann in einem Zwei-Phasen 4% Paraformaldehyd-Heptan Herstellung von einem Standardprotokoll 14 befestigt. Die Färbung wurde mit Anti-Fasciclin II (grün in A, B und weiß in A ', B') durchgeführt, um motorischen Neuronen und Anti-elav Antikörper (rot in A, B), um alle Neuronenzellkörper Label Label. CY5 Farbstoff wird durch direkte Fluoreszenz, die verlängerte Exposition durch verminderte Fluoreszenzintensität durch Fixierung (CY5 ist pseudo-blau gefärbt in allen Panels) erfordert enthüllt. Die Auswirkungen von MeHg in unregelmäßigen Mustern und cluste gesehenRing der Seiten chordotonal Neuron Zellkörper (Elav-positiv, in rot markiert und mit weißen Pfeile in B gegenüber A bezeichnet). Darüber hinaus ist eine charakteristische Verzweigung der Segment (SN) (durchgezogene grüne Pfeile in A ') gesehen sehr variabel mit MeHg Exposition (grün Pfeile in B ") im Einklang mit den zuvor berichteten Effekte von MeHg auf den Embryo 15 zu sein. Projektion der intersegmentalen und segmentalen Nerven an ihren Wurzeln sind zu sehen, hinten mit MeHg Exposition (offene grüne Pfeil in B ') verschoben werden. Hinweis: Methylquecksilber ist ein starkes Nervengift. Es ist darauf zu Handschuhen und Augenschutz, wenn zu tragen. Die Entsorgung sollte durch eine institutionelle Umweltsicherheit und Service-Einrichtung durchgeführt werden.
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Discussion
Das oben beschriebene Verfahren beschreibt ein Mittel, um den Erhalt lebensfähiger Drosophila-Embryonen, die zugänglich zu kleines Molekül Behandlungen in einem breiten Entwicklungsbereich sind. Diese Methode stellt die neue und einfache Feststellung, dass das Altern Embryonen bei 18 ° C ermöglicht Permeabilisierung der späten Phase Embryonen mit der gleichen Wirksamkeit wie zuvor nur in frühen Embryonen gesehen. Darüber hinaus hat die Verwendung von fernen Rot Cy5 Carbonsäure als Indikator wirksamen Permeabilität in Postfix-Anwendungen bewährt und nicht mit herkömmlichen roten und grünen fluoreszierenden Markern, die verwendet werden können, um Entwicklungs Phänotypen zeigen stören. Diese Ergebnisse, die Wirksamkeit und der Nutzen der EPS-Verfahren erheblich voranbringen.
Diese Methode ist offen für Analysen der beiden Wohn-und Fest Embryo Zubereitungen. Mit Hellfeldmikroskopie und der Schieberraum einzurichten, der typischen Merkmale, um in der ersten Hälfte der Embryonalentwicklung Tor erzielen, sind morphogenetische Bewegungen wieZellularisierung des Blastoderm, Kopffurchenbildung, germband Dehnung und germband Rückzug ein. Mit GFP oder RFP Reportern spezifischer Endpunkte erkannt werden kann, z. B. frühen Segmentierung Muster und die Bildung von Nervenstrukturen in der späteren Entwicklung ein. GFP und RFP Berichte ermöglichen auch die Beobachtung von Entwicklungs Ereignisse in lebenden Embryonen permeabilisiert sowohl in der Schieberraum und Entwicklungs Warenkorb Zubereitungen. Eine einfache Methode zum Brutto Toxizität eines angelegten Drogen-oder Chemie zu bestimmen, ist das Muster der Dotterprotein Auto-Fluoreszenz im blauen Kanal zu überwachen, um eine Verzögerung oder Einstellung der Entwicklung 1 zu bestimmen.
Die EPS-Methodik hat auch großes Potenzial für die Erweiterung der Ermittlungsinstrumente für Nicht-Modell Insekten, insbesondere Mücken, die eine ähnliche Architektur der Eierschale teilt. Anwendung von kleinen Molekülen, um Embryonen von anderen Insektenarten eröffnen würde eine Allee von investigatiauf denen Standard genetische Ansätze, um funktionelle Studien sind derzeit fehlt. Embryonen in Körben entwickelt für Formaldehydfixierung verarbeitet werden, deshalb eröffnen Analysen an die Vielzahl von Reagenzien für die Immunfärbung Drosophila Studien zur Verfügung. Dieser Schritt erfordert jedoch, dass ein Post-Update Bestimmung Permeabilisierung machbar Phänotypen mit Embryonen, auf den der Drogen gemacht worden korrelieren. Die Anwendung der CY5 Carbonsäure Farbstoff sehr effektiv für diesen Ansatz bewährt. CY5 Carbonsäure effizient in permeabilisierten Embryonen (3A) aufgenommen. Während der Entwicklung Cy5 im Eigelb, die letztlich in dem Lumen des Darms zu bildenden Stufe 14 abgesondert wird und später (3B) eingeengt. Nach der Fixierung wird Cy5-Fluoreszenz deutlich verringert, dennoch zuverlässig nachweisbar im Darm und dient als Marker dieser Embryonen, die effektiv die eingangs permeabilisiert wurden (siehe repräsentative result Abbildung 4). Es sei darauf hingewiesen, dass CY5 Erfassungs in dieser Phase mehr Kamerapositionen (z. B. 1-4 Sekunden), für den Nachweis erfordert werden. Somit kann Scoring von Phänotypen mit Immunfärbung Muster fortzufahren mit Cy5-Signal ähnlich permeabilisiert Embryonen mit gewebespezifischen Marker (zB neural-spezifischen Antikörpern in Fig. 4 zu sehen) zusammen bestätigen.
Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren ist die Empfindlichkeit der Embryo Lebensfähigkeit der Permeabilisierung Prozess, etwas, das lange geplagt hat frühere Versuche, diese Methode zu entwickeln, 9,10,16. Die Lebensfähigkeit Anschluss an Permeabilisierung krass ist altersabhängig und steigt dramatisch die ältere der Embryo nach Permeabilisierung 9. Doch wie wir bereits gezeigt haben, wird Durchlässigkeit immer schwieriger mit dem Alter ein. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigt nun die Möglichkeit, spät Embryonen (Stufe 14) durch Re-Aufrufen hep permeabilisierenPentan als Lösungsmittel in Verbindung mit d-Limonen 17. Die breite Anwendbarkeit dieser letztere Methode ist nicht klar, wie nur ein Medikament Wirkung wurde dadurch (Nocodazol) und Anwendung auf früher Embryonen wurde nicht beschrieben 17. Weiterhin ist die Anwendung der 18 ° C-Entwicklungsschritt über Ausbeuten spät Permeabilität skizziert und vermeidet ferner die Verwendung von toxischen organischen Lösungsmittel. Die Ermittler, die neu in der EPS-Protokoll wird Variabilität in Permeabilisierung und Lebensfähigkeit Ergebnisse auf erste Versuche zu erleben. Die hier beschriebenen Schritte geben die Ermittler die Werkzeuge, um systematisch Bedingungen Permeabilisierung Behandlungen und anschließender Inkubation Schritte variieren, um Bedingungen für spezifische Stämme von Drosophila sie in ihrem eigenen Labor Arbeitseinstellung zu optimieren.
Eine weitere Herausforderung bei dem Verfahren ist die Variabilität der chemischen Aufnahme von Embryos Embryos gesehen. Diese Variabilität in der Heterogenität der reflektiertenCY5 Farbstoffaufnahme sofort nach der Farbstoffbehandlung (3A) in Embryonen gesehen. Im Gegensatz dazu ist Rhodamin B-Farbstoff schneller und gleichmäßiger als Cy5-Farbstoff (2B ") für die embryonale Gewebe dispergiert. Somit können einige Embryo zu Embryo Variabilität der Verteilung der chemischen Eigenschaften, Arzneimittel oder Toxin von Interesse beherbergt und ist inhärent Verfahrens. Wo die Quantifizierung der Dosis kritisch ist, ist es empfehlenswert, dass die Aufnahme des Arzneimittels oder Toxins von Interesse wird durch eine alternative analytische Verfahren charakterisiert. Dennoch ist die Leichtigkeit der obigen Protokoll und die Fähigkeit sind, hunderte von Embryonen erlaubt die Ermittler, um die Dosis-Antworten auswerten und Ergebnis charakteristische Phänotypen mit wenig Investition von Ressourcen, sorgt für einen kräftigen erste Ansatz zur Charakterisierung Medikamente oder Giftstoffe in diesem hoch entwickelten Modellsystem.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
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