تمثل التجارب SILAC مناعي وسيلة قوية لاكتشاف البروتين الرواية: تفاعلات البروتين. من خلال السماح للالكمي النسبي دقيقة من وفرة البروتين في كل من السيطرة واختبار العينات، والتفاعلات الحقيقية يمكن تمييزها بسهولة من الملوثات التجريبية، وانخفاض التفاعلات تقارب الحفاظ من خلال استخدام الظروف العازلة أقل صرامة.
البروتيوميات الكمية جنبا إلى جنب مع تنقية المناعية تقارب، SILAC مناعي، تمثل وسيلة قوية لاكتشاف البروتين الرواية: تفاعلات البروتين. من خلال السماح للالكمي النسبي دقيقة من وفرة البروتين في كل من السيطرة واختبار العينات، والتفاعلات الحقيقية يمكن تمييزها بسهولة من الملوثات التجريبية. يمكن الحفاظ على التفاعلات تقارب منخفضة من خلال استخدام الظروف العازلة أقل صرامة ويبقى التعرف عليه بسهولة. يناقش هذا البروتوكول بوضع العلامات على الخلايا زراعة الأنسجة مع النظائر مستقرة الأحماض الأمينية المسمى، وترنسفكأيشن مناعي لتقارب الموسومة البروتين من الفائدة، تليها تمهيدا لرفعها إلى مرفق مطياف الكتلة. ثم يناقش هذا البروتوكول كيفية تحليل وتفسير البيانات التي تم إرجاعها من مطياف الكتلة من أجل تحديد الشركاء الخلوية التفاعل مع بروتين من الفائدة. كمثال يتم تطبيق هذه التقنية لالاتساعtify البروتينات ملزمة للعوامل ترجمة حقيقية النواة بدء: eIF4AI وeIF4AII.
خطوة أساسية في فهم وظيفة البروتين هو تحديد البروتينات المتفاعلة ذات الصلة. حيث مثل البروتينات غير معروفة وهناك عدد من التقنيات المتاحة، ولكل منها مزاياها وسلبياتها. وتشمل هذه الخميرة نظام هجين اثنين، المقايسات المنسدلة باستخدام البروتين المؤتلف، وكذلك تنقية تقارب جنبا إلى جنب أو TAP الجغرافية 1، 2.
وبالإضافة إلى ذلك أكثر حداثة لهذه التقنيات هو مزيج من تنقية تقارب من البروتين من الفائدة من خط خلايا الثدييات ذات الصلة، تليها الكمي باستخدام مطياف الكتلة وضع العلامات النظائر مستقرة من الأحماض الأمينية في الثقافة الخلية (SILAC) 3. هذا لم يتم مضطرب المزايا على نهج الخميرة اثنين الهجين في ذلك توطين الخلية والتعديلات بعد متعدية، فضلا عن المزايا أكثر من التقليدية في أنه هو النهج الكمي النوعي بدلا من السماح للمستخدم الجرمية الجغرافية TAP تميز dily غير وجه التحديد التفاعل البروتينات والملوثات، من العوامل المضيفة التي تربط على وجه التحديد. كذلك، عادة ما يتم تحليل عينة ككل، بدلا من العصابات البروتين الفردية، لا يتم ملثمين البروتينات من الفائدة عن طريق ترحيل بالمثل البروتينات على هلام، كما أنها لا تحتاج عادة ليكون حاضرا في مستويات كافية لتكون واضحة بعد تلطيخ، مما يؤدي إلى الأعداد المتزايدة من البروتينات التي تم تحديدها بثقة 4.
لإثبات هذه التقنية، اندماج GFP من حقيقية النواة عامل بدء ترجمة وثيقة الصلة وتم التحقيق eIF4AI وeIF4AII أن حصة أكثر من 90٪ من الأحماض الأمينية التي كتبها الهوية SILAC مناعي البروتينات الكمي. تم استنساخ eIF4AI الإنسان والثاني في pEGFP-C1 لتشكيل البروتين الانصهار حيث تنصهر GFP إلى N-محطة من eIF4A. لتجنب الحاجة لتوليد خطوط الخلايا مستقرة استخدمت ترنسفكأيشن عابرة لتقديم هذه التركيبات إلى النظائر الخلايا 293T المسمى مستقرة.
<p class="jove_content"> وصفت الخلايا الأولى لمدة أسبوعين في SILAC سائل الإعلام والثقافة الخلية، تليها ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد ترميز البروتين من الفائدة. وبعد ذلك هي lysed الخلايا، وتركيز البروتين تطبيع، وكميات متساوية من المحللة تقارب تنقيته على الاغاروز مكافحة GFP. كميات متساوية من شطافة ثم تم الجمع بين وقدم لتحليل LC-MS/MS. ثم تتم معالجة نتائج هذا التحليل إلى تحديد البروتين ثقة عالية: تفاعلات البروتين (الشكل 1).SILAC مناعي يمكن تحديد ليس فقط التفاعلات المباشرة ولكن أيضا منخفضة تقارب أو التفاعلات غير المباشرة مع المجمعات البروتين 4. باستخدام هذا النظام، والثاني eIF4AI immunoprecipitations يسمح تحديد استنساخه واثقة من الشريك الأساسي ملزمة eIF4G (الأشكال الإسوية I / II و III) 5، وكذلك التفاعلات غير المباشرة مع eIF4E، ومكونات عديدة من مجمع eIF3.
استراتيجية المنسدلة SILAC الموصوفة هنا تمثل وسيلة حساسة للغاية وقوية للكشف عن البروتين الرواية: تفاعلات البروتين، ويسمح علاوة على التمييز السريع والبسيط لأنماط ملزمة تغير بين العينات ترتبط ارتباطا وثيقا من الفائدة. في هذا المثال تم استخدام هذه التقنية لتحقيق البروتين: تفاعلات البروتين من eIF4AI وeIF4AII البروتينات 6. لمعرفة صاحب البلاغ، وهذا هو أول دراسة في الأدب استغلال فائدة البروتينات SILAC للتحقيق في interactome الخلوية من هذه الأشكال الإسوية اثنين من eIF4A.
النهج كما هو موضح أعلاه يستخدم GFP علامة ومكافحة GFP الخرز 9، 10، وبالتالي قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات تمكين هذا النهج لاستخدامها لبروتين معين من الفائدة، على سبيل المثال ما إذا كان يتم وضع علامة على N-أو C-محطة من البروتين. حيثما أمكن، البقع الغربية أو المقايسات الفنية ينبغيأن يؤديها للكشف ملزمة للبروتين شريك التفاعل معروفة. يجب بروتين لن تتسامح مع الانصهار مع علامة GFP، علامات أخرى أو استراتيجيات المنسدلة تم تطبيقها على pulldowns SILAC باستخدام كل العلامات الأخرى (FLAG 11، بيوتين 12، بكتيريا (البيانات الخاصة، غير منشورة))، أو باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد بروتين من الفائدة حيث سيرنا ضربة قاضية للبروتين الهدف يوفر العينة الضابطة 13. وقد وصفت هذه التجارب في أماكن أخرى من الأدب، ولكن باختصار، الخطوة 1 والخطوات 5،4-8 ستطبق على النحو الوارد أعلاه، مع الخطوات 2-5،3 تعديل بما يتناسب مع نظام التعبير / المنسدلة من خيار استخدام مدخلات البروتين متساوية كما هو موضح في الخطوات 2.4-2.5. كما تسمح المراحل الكمي البروتينات غير محددة وملزمة لإزالتها على مستوى التحليل، فمن المستحسن لحذف ما قبل الحضانة مع حبات السيطرة، أو يغسل عالية من الملح من أجل الحفاظ على البروتين منخفضة تقارب: تفاعلات البروتين مع بروتين من الفائدة . أماه نوكليازذ إدراجها أو حذفها من هذا البروتوكول وفقا لخصوصيات تجربة معينة. على سبيل المثال: مثل البروتينات المستخدمة في هذه الطريقة هي helicases الحمض النووي الريبي، أدرج ريبونوكلياز كوكتيل في بروتوكول لإزالة التفاعلات غير المباشرة بوساطة عبر الحمض النووي الريبي (الخطوة 3.2). في بعض الحالات ومع ذلك، يمكن أن يكون هناك استفادة من تجارب تشغيل بالتوازي مع وبدون نوكلياز لتحديد الحمض النووي تعتمد التفاعلات.
في هذا البروتوكول، وأوصى التحول من 'متوسطة' وعينات 'الثقيلة' في التجارب تكرار للسيطرة على الاختلاف الذي عرضته الاختلافات في وسائل الإعلام أو SILAC نمو الخلايا. ينطوي على المكافحة البديلة التبديل التتابعي من كل ثلاثة ('ضوء'، 'المتوسط'، و 'الثقيلة') وسائل الاعلام في التجارب متماثلة. بينما هذا النهج هو يحتمل أن تكون أكثر صرامة، فإنه يزيد من تعقيد التحليل، كما هو الحال في تكرار واحد على الأقل، وهو بروتين من الفائدة ثسوء يتم إنتاجها في "خفيف" الخلايا المسمى ولذا فمن الضروري التمييز بين البروتينات التي تم تحديدها في عينات باستمرار "خفيف" (الملوثات البيئية مثل keratins)، وتلك التي هي المخصب فقط في عينات 'النور' عندما منضما إلى البروتين الفائدة.
في حين أن استخدام البيانات الكمي يسمح التمييز محددة من التفاعلات غير محددة من خلال استخدام عتبة، حتما قد يتم تجاهل بعض التفاعلات حقيقية. النهج المذكور أعلاه هو نهج بسيطة وسريعة لتحديد البروتين: البروتين التفاعلات التي يمكن أن تكون محاولة من قبل الباحثين بسهولة مع عدم وجود خبرة سابقة مع مطياف الكتلة، أو تحليل البروتين كبيرة: البروتين مجموعات البيانات التفاعل. بالنسبة لمعظم الاستخدامات وهذا هو أكثر من كافية لتحديد البروتينات الرواية المثيرة للاهتمام. موصوفة تعديلات إضافية على هذا النهج للمساعدة في تقليل هذه الخسارة البيانات في أي مكان آخر في الأدب وتشمل استخدام العلاقات العامةمكتبة تردد otein حيث يعرف البروتينات الملوثة لمجموعة محددة من المعلمات التجريبية (خط الخلية، وحبة مصفوفة، وظروف العازلة) يجوز استبعاد 10، 14. ومع ذلك، اعتمادا على المعلمات التجريبية معينة قد يكون من الضروري لتشغيل عدد من التجارب تحكم لتوليد بروتيوم حبة، وبالتالي يمكن زيادة كل هذا على حساب وتعقيد التجربة. مزيد من المعلومات عن هذه التقنية هو متاح من موقع www.peptracker.co.uk 14.
وتجدر الإشارة أيضا إلى أن البروتوكول هو موضح أعلاه ينطوي خلط العينات وصفت بشكل مختلف في نهاية عملية مناعي (وهو ما يسمى في خلط بعد تنقية – التجربة SILAC MAP). يتم ذلك كما البروتين: تحدث تفاعلات البروتين في توازن معين 15. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات أخرى تضافرت هذا النهج MAP SILAC الموصوفة في هذا البروتوكول مع الحضانة من العيناتقبل المنسدلة (تنقية بعد خلط – حزب الأصالة والمعاصرة SILAC) لفترات مختلفة من الزمن (وقد استخدمت 20 دقيقة إلى 2 ساعة في الأدب) 15، 16. على أساس مدى سرعة انخفاض نسبة البروتين نحو 1:1، فمن الممكن للتحقيق نوعيا الانتماءات الملزمة وتحديد البروتينات بأنها مستقرة أو ديناميكية التفاعل البروتينات 15.
باختصار، تمثل pulldowns SILAC وسيلة قوية للغاية لتحديد البروتينات التفاعل مع بروتين معين من الفائدة، في جو من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة. تقنية يمكن تكييفها بسهولة للغاية لعدد من الاستراتيجيات تنقية مختلفة، مما يسمح تطبيقه على أي بروتين معين من الفائدة. الكمي لنتائج يبسط إلى حد كبير تحديد التفاعلات حقيقية، ويسمح تخفيف الشروط الصارمة العازلة المستخدمة لإزالة المجلدات غير محددة، وبالتالي يحافظ على انخفاض التفاعلات تقارب. ما يصل الى ثلاث عينات يمكن مقارنة في أعلاهاستراتيجية وتقنية لديه نقاط قوة واضحة في المقارنة بين الاختلافات في بروتين ملزمة بين الأشكال الإسوية مختلفة من البروتين والبروتينات متحولة، أو تأثير مثبطات الدوائية. كما يتم تحليل شرائح هلام كله بدلا من العصابات الفردية التي وصمة عار بواسطة Coomassie، فإن أعداد البروتينات التي تم تحديدها في ثقة عالية وعادة ما تكون أعلى من تلك المحددة في معيار ضريبة المبيعات / TAP-المنسدلة، والمجرب التحيز في اختيار البروتينات ذات الاهتمام تتم إزالة. ولذلك فإن تقنية يقارن ايجابيا جدا مع التقنيات الأخرى المستخدمة استخداما في تحديد رواية البروتين التفاعلات (الخميرة 2 الهجين، ضريبة المبيعات / صاحب أو TAP Pulldowns).
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من ويلكوم ترست وBBSRC لIG. IG هو زميل أقدم يلكوم.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |