Experimentos de inmunoprecipitación SILAC representan un poderoso medio para descubrir nueva proteína: proteína interacciones. Al permitir la cuantificación relativa precisa de la abundancia de proteínas tanto en el control y las muestras de ensayo, verdaderos interacciones se puede distinguir fácilmente de los contaminantes experimentales, y las interacciones de baja afinidad conservada a través del uso de condiciones de tampón menos estrictos.
Proteómica cuantitativa, junto con la purificación de inmunoafinidad, inmunoprecipitación SILAC, representan un poderoso medio para el descubrimiento de la nueva proteína: proteína interacciones. Al permitir la cuantificación relativa precisa de la abundancia de proteínas tanto en el control y las muestras de ensayo, verdaderos interacciones pueden distinguirse fácilmente de los contaminantes experimentales. Interacciones de baja afinidad se pueden preservar mediante el uso de condiciones de tampón menos estrictos y siguen siendo fácilmente identificable. Este protocolo describe el etiquetado de las células de cultivo de tejidos con isótopos estables etiquetados aminoácidos, la transfección y la inmunoprecipitación de una afinidad etiquetado proteína de interés, seguido de la preparación para la presentación a una instalación de espectrometría de masas. Este protocolo a continuación explica cómo analizar e interpretar los datos devueltos por el espectrómetro de masas con el fin de identificar a los socios celulares que interactúan con una proteína de interés. A modo de ejemplo se aplica esta técnica para identificar proteínas de unión a los factores de iniciación de la traducción eucarióticos: eIF4AI y eIF4AII.
Un paso esencial en la comprensión de la función de proteínas es la identificación de las proteínas que interactúan pertinentes. Cuando tales proteínas son desconocidos hay una serie de técnicas disponibles, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Estos incluyen el sistema de levadura de dos híbridos, menú desplegable ensayos que utilizan proteínas recombinantes, así como la purificación por afinidad en tándem o TAP-etiquetado 1, 2.
Una adición más reciente a estas técnicas es la combinación de la purificación por afinidad de una proteína de interés a partir de una línea celular de mamífero relevante, seguido de espectrometría de masas cuantitativa utilizando el etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) 3. Esto tiene ventajas sobre el enfoque de la levadura de dos híbridos en que la localización celular y modificaciones post-traduccionales no son perturbados, así como las ventajas más tradicional de TAP-de marcado en la que se trata de un enfoque cuantitativo en lugar de cualitativo que permite al usuario REAdily distinguir de forma no específica las proteínas que interactúan y contaminantes, de los factores del huésped que se unen específicamente. Además, como una muestra normalmente se analizó su conjunto, en lugar de las bandas de proteínas como individuales, proteínas de interés no están enmascaradas por la migración de manera similar las proteínas en un gel, ni tampoco suelen necesitar estar presentes en niveles suficientes para ser visibles después de la tinción, lo que lleva a aumento del número de proteínas identificadas con confianza 4.
Para demostrar esta técnica, GFP fusiones del factor de iniciación de la traducción eucariótica estrechamente relacionado eIF4AI y eIF4AII que comparten más de una identidad de aminoácidos del 90% fueron investigados por SILAC-inmunoprecipitación proteómica cuantitativa. EIF4AI humano y II fueron clonados dentro de pEGFP-C1 para formar una proteína de fusión de GFP donde se fusiona con el extremo N-terminal de eIF4A. Para evitar la necesidad de generar líneas celulares estables de transfección transitoria se utilizó para entregar estas construcciones a células 293T de isótopos estables etiquetados.
<p class="Jove_content"> Las células se marcaron primero durante dos semanas en SILAC medios de cultivo celular, seguido de la transfección del plásmido de ADN que codifica una proteína de interés. Las células se lisaron a continuación, la concentración de proteína normalizaron, y cantidades iguales de afinidad de lisado purificaron en agarosa anti-GFP. Igual cantidad de eluido se combinaron después y se sometieron a análisis LC-MS/MS. Los resultados de este análisis se procesan entonces para identificar proteínas de alta confianza: las interacciones proteína (Figura 1).Inmunoprecipitación SILAC permite identificar no sólo las interacciones directas, sino también de baja afinidad o interacciones indirectas con complejos de proteínas 4. Usando este sistema, eIF4AI y II inmunoprecipitaciones permitió la identificación reproducible y seguro de la pareja principal de unión eIF4G (isoformas I / II y III) 5, así como las interacciones indirectas con eIF4E, y numerosos componentes del complejo eIF3.
La estrategia desplegable SILAC descrito aquí representa un medio muy sensibles y de gran alcance de la detección de la proteína novedosa: las interacciones de proteínas, y además permite la discriminación rápida y simple de los patrones alterados de unión entre las muestras estrechamente relacionados de interés. En este ejemplo se utilizó esta técnica para investigar la proteína: proteína interacciones de las proteínas eIF4AI y eIF4AII 6. Para el conocimiento del autor, este es el primer estudio en la literatura explotar la utilidad de la proteómica SILAC para investigar el interactome celular de estas dos isoformas de eIF4A.
El enfoque descrito anteriormente utiliza un GFP-etiqueta y anti-GFP bolas 9, 10 y, por tanto, las modificaciones pueden ser necesarias para que este enfoque que se utilizará para una proteína específica de interés, por ejemplo, si la etiqueta se coloca en el extremo N-o C-terminal de una proteína. Siempre que sea posible, transferencias Western o ensayos funcionales deberíanllevar a cabo para detectar la unión de una pareja de interacción proteína conocida. En caso de una proteína no tolerar la fusión con una etiqueta de las buenas prácticas agrarias, otra de marcado o estrategias desplegables se han aplicado a jalones SILAC utilizando tanto otras etiquetas (FLAG 11, biotina 12, PEIF (datos propios, sin publicar)), o mediante el uso de anticuerpos primarios contra una proteína de interés en la que siRNA desmontables de la proteína diana ofrece una muestra de control 13. Tales experimentos se han descrito en otra parte en la literatura, pero en breve, paso 1 y pasos 5.4-8 se aplica como anteriormente, con los pasos 2-5.3 modificados según sea apropiado para el sistema de expresión / desplegable de selección utilizando las entradas iguales de proteína como se describe en pasos 2.4 a 2.5. Dado que el grado de cuantificación permiten proteínas de unión no específica a ser retirados en el nivel de análisis, se recomienda omitir la pre-incubación con cuentas de control, o lavados elevadas de sal con el fin de preservar las proteínas de baja afinidad: interacciones de proteínas con una proteína de interés . Una ma nucleasay pueden incluir u omitir de este protocolo de acuerdo con las características específicas de una experiencia particular. Por ejemplo: como las proteínas utilizadas en este método son helicasas de ARN, RNasa cóctel se incluyó en el protocolo para eliminar interacciones indirectas mediadas a través de la ARN (paso 3.2). En algunos casos, sin embargo, podría haber un beneficio de llevar a cabo experimentos paralelos con y sin nucleasa para identificar las interacciones dependientes de ácidos nucleicos.
Dentro de este protocolo, se recomienda el cambio de muestras 'pesados' en replicar experimentos "medio" y para controlar la variación introducida por las diferencias en los medios de comunicación SILAC o el crecimiento celular. Un control alternativo incluye la modificación secuencial de los tres ("light", "medio" y "pesado") los medios de comunicación en la réplica de experimentos. Mientras que este enfoque es potencialmente más estrictas, sí aumenta la complejidad del análisis, como en al menos una repetición, una proteína de interés Wenfermo se produce en las células "light" etiquetados y por lo que es necesario distinguir entre las proteínas identificadas consistentemente en las muestras de "light" (contaminantes ambientales, tales como las queratinas), y los que sólo se enriquecen en las muestras "light" cuando se une a una proteína de interés.
Aunque el uso de datos de cuantificación permite la discriminación de-específica de las interacciones no específicas mediante el uso de un umbral, inevitablemente algunas interacciones genuinas puede ser desechada. El enfoque anterior es un método sencillo y rápido para la identificación de proteínas: proteína interacciones que pueden ser fácilmente intentaron por investigadores sin experiencia previa con la espectrometría de masas, o el análisis de grandes conjuntos de datos de proteínas: proteína interacción. Para la mayoría de usos esto es más que suficiente para la identificación de nuevas proteínas de interés. Otras modificaciones a este enfoque para ayudar a reducir esta pérdida de datos se describen en la literatura y en otros lugares incluyen el uso de un PRbiblioteca frecuencia Otein donde conoce proteínas contaminantes para un conjunto específico de parámetros experimentales (línea celular, matriz de grano, las condiciones de tampón) puede ser excluido 10, 14. Sin embargo, dependiendo de los parámetros experimentales particulares puede ser necesario para realizar un número de experimentos de control para generar un proteoma de talón y por lo tanto esto puede aumentar tanto el gasto y la complejidad del experimento. Para más información sobre esta técnica se encuentra disponible en el sitio web www.peptracker.co.uk 14.
También debe tenerse en cuenta que el protocolo descrito anteriormente consiste en mezclar muestras marcadas de manera diferente en el final del proceso de inmunoprecipitación (denominado una mezcla después de la purificación – MAPA SILAC experimento). Esto se hace en forma de proteínas: proteína interacciones se producen en un equilibrio determinado 15. Debe tenerse en cuenta que otros grupos han combinado este enfoque SILAC MAPA se describe en este protocolo con la incubación de las muestrasantes de la desplegable (purificación después de la mezcla – PAM SILAC) para diferentes periodos de tiempo (20 min a 2 horas se han utilizado en la literatura) 15, 16. Sobre la base de la rapidez con gotas de una relación de proteína a 01:01, es posible investigar cualitativamente afinidades de unión y para definir las proteínas como las proteínas que interactúan estables o dinámicos 15.
En resumen, jalones SILAC representan un medio muy poderoso para identificar las proteínas que interactúan con una determinada proteína de interés, en un ambiente fisiológicamente relevante. La técnica se puede adaptar muy fácilmente a un número de diferentes estrategias de purificación, lo que permite su aplicación a cualquier proteína dada de interés. La cuantificación de los resultados simplifica enormemente la identificación de interacciones auténticos, y permite la relajación de las condiciones de tampón estrictas utilizadas para eliminar los aglutinantes no específicos, y por lo tanto preserva las interacciones de baja afinidad. Como hasta tres muestras se pueden comparar en lo anteriorestrategia, la técnica tiene ventajas claras en comparación de las diferencias en la proteína de unión entre las diferentes isoformas de proteínas, las proteínas mutantes, o el efecto de los inhibidores farmacológicos. A medida que se analizaron cortes de gel enteras en lugar de las bandas individuales que mancha por Coomassie, el número de proteínas identificadas en el alto grado de confianza suelen ser mayores que las señaladas en el GST / TAP-menú desplegable estándar y experimentador sesgo en la selección de proteínas de interés se quita. Por tanto, la técnica se compara muy favorablemente con otras técnicas utilizadas comúnmente utilizados en la identificación de nuevas proteínas-las interacciones (levadura de 2 híbridos, GST / His o TAP Pulldowns).
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por becas de la Wellcome Trust y BBSRC a IG. IG es un Wellcome Senior Fellow.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |