SILAC immunoprecipitatie experimenten vormen een krachtig middel voor het ontdekken van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, waar interacties gemakkelijk kan worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen en lage affiniteit interacties bewaard door het gebruik van minder stringente buffer omstandigheden.
Kwantitatieve proteomics gecombineerd met immuno-affiniteitszuivering, SILAC immunoprecipitatie, vormen een krachtig middel voor de ontdekking van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, kan waar interacties gemakkelijk worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen. Lage affiniteit interacties kunnen worden bewaard door het gebruik van minder stringente bufferomstandigheden en gemakkelijk herkenbaar blijven. Dit protocol beschrijft de kenmerken van weefselkweek cellen met stabiele isotoop gemerkte aminozuren, transfectie en immunoprecipitatie van een affiniteit gelabeld eiwit van belang, gevolgd door de voorbereiding van opname in een massaspectrometrie faciliteit. Dit protocol bespreekt vervolgens hoe u het terug van de massaspectrometer om cellulaire partners interactie met een eiwit van belang vast te stellen gegevens te analyseren en te interpreteren. Als voorbeeld van deze techniek wordt toegepast identiteitTify eiwitten binden aan de eukaryote translatie initiatie factoren: eIF4AI en eIF4AII.
Een essentiële stap in het begrip eiwitfunctie is identificatie van relevante interagerende eiwitten. Wanneer dergelijke eiwitten onbekend zijn er een aantal technieken, elk met hun eigen voor-en nadelen. Deze omvatten de gist twee-hybride systeem, pulldown analyses toepassing van recombinant eiwit en tandem affiniteitszuivering of TAP-tagging 1, 2.
Een recentere Naast deze technieken is de combinatie van affiniteit zuivering van een eiwit van interesse van een relevante zoogdiercellijn, gevolgd door kwantitatieve massaspectrometrie met stabiele isotopen van aminozuren in celcultuur (SILAC) 3. Dit heeft voordelen boven de gist twee-hybride benadering in die cel lokalisatie en post-translationele modificaties zijn niet verstoord, alsmede voordelen boven traditionele TAP tagging doordat het kwantitatieve dan kwalitatieve benadering waardoor de gebruiker reaDily onderscheiden niet-specifiek interagerende eiwitten en verontreinigingen vanuit gastheer factoren die specifiek binden. Verder werd als monster typisch geanalyseerd geheel en niet als afzonderlijke eiwitbanden, eiwitten van belang zijn niet gemaskeerd door soortgelijke migreren eiwitten op een gel, en dat hoeft typisch aanwezig zijn in voldoende hoge niveaus zichtbaar na kleuring, waardoor verhoogde aantallen vol geïdentificeerde eiwitten 4.
Om deze techniek te demonstreren, GFP fusies van de nauw verwante eukaryotische translatie-initiatie factor eIF4AI en eIF4AII dat aandeel meer dan 90% aminozuuridentiteit werden onderzocht door SILAC-immunoprecipitaties kwantitatieve proteomics. Menselijke eIF4AI en II werden gekloneerd in pEGFP-C1 een fusieproteïne waarin GFP gefuseerd aan de N-terminus van eIF4A vormen. Om te voorkomen dat de noodzaak voor het genereren van stabiele cellijnen transiënte transfectie werd gebruikt om deze constructen te leveren aan stabiele isotoop gemerkte 293T cellen.
<p class="Jove_content"> Cellen werden eerst gelabeld voor twee weken SILAC celkweekmedium, gevolgd door transfectie van plasmide DNA dat codeert voor een eiwit van interesse. Cellen werden vervolgens gelyseerd, de eiwitconcentratie genormaliseerd en gelijke hoeveelheden lysaat affiniteit gezuiverd anti-GFP agarose. Gelijke hoeveelheden eluaat werden vervolgens gecombineerd en LC-MS/MS analyse worden aangeboden. De resultaten van deze analyse worden vervolgens naar hoog vertrouwen eiwitten te identificeren: eiwit interacties (figuur 1).SILAC immunoprecipitatie maakt de identificatie van niet alleen rechtstreekse interacties maar ook lage affiniteit of indirecte interacties met eiwitcomplexen 4. Met dit systeem eIF4AI en II immunoprecipitaties toegestaan reproduceerbare en zekere identificatie van de primaire bindingspartner eIF4G (isovormen I / II en III) 5, alsook indirecte interacties met eIF4E en talrijke onderdelen van de eIF3 complex.
De SILAC pulldown strategie die hier beschreven is een zeer gevoelig en krachtig middel voor het opsporen van nieuwe eiwit: eiwit interacties, en bovendien maakt een snelle en eenvoudige discriminatie van veranderde bindingspatronen tussen nauw verwante monsters van belang. In dit voorbeeld werd deze techniek gebruikt om het eiwit te onderzoeken: eiwit interacties van de eIF4AI en eIF4AII eiwitten 6. Voor zover de auteur, dit is de eerste studie in de literatuur benutten het nut van SILAC proteomics de cellulaire interactoom van deze twee isovormen van eIF4A onderzoeken.
De benadering zoals boven beschreven maakt gebruik van een GFP-tag en anti-GFP kralen 9, 10 en derhalve wijzigingen kunnen nodig zijn om deze aanpak te gebruiken voor een bepaalde proteïne van belang, bijvoorbeeld of de markering wordt geplaatst op de N-of C-terminus van een eiwit. Waar mogelijk, western blots of functionele testen moetenworden uitgevoerd om te detecteren binding van een bekende eiwit interactiepartner. Indien een eiwit fusie niet tolereren met een GFP-tag, andere tagging of pulldown strategieën zijn toegepast SILAC pulldown met beide andere tags (FLAG 11, biotine 12, STREP (eigen gegevens, ongepubliceerd)), of met primaire antilichamen tegen een eiwit van belang waar siRNA knock-down van het doelwit eiwit zorgt voor een controle monster 13. Dergelijke experimenten zijn elders beschreven in de literatuur, maar kort, stap 1 en stap 5,4-8 worden zoals hierboven toegepast, met stappen 2-5,3 als geschikt zijn gemodificeerd voor de expressie / pulldown gekozen systeem met gelijke eiwit inputs zoals beschreven in stappen 2,4-2,5. Aangezien de kwantificering fasen mogelijk niet-specifieke binding eiwitgehalte bij de analyse niveau te verwijderen, is het raadzaam om pre-incubatie weglaten controlekorrels of hoge zout wast om een lage-affiniteit proteïne behouden: eiwit interacties met een eiwit van interesse . Een nuclease may worden opgenomen of weggelaten uit dit protocol overeenkomstig de specifieke kenmerken van een bepaald experiment. Bijvoorbeeld: als de eiwitten in deze methode RNA helicases, RNase cocktail werd opgenomen in het protocol indirecte interacties gemedieerd via RNA (stap 3.2) te verwijderen. In sommige gevallen echter, kunnen er profiteren parallel experimenten met en zonder nuclease nucleïnezuur afhankelijke interacties identificeren.
Binnen dit protocol, is de omschakeling van 'medium' en 'zware' monsters in duplo experimenten aangeraden om te controleren voor variatie geïntroduceerd door verschillen in de SILAC media of celgroei. Een alternatief controlesysteem omvat de sequentiële schakeling van alle drie ('light', 'medium' en 'zware') media in replica experimenten. Hoewel deze aanpak is potentieel strengere ofwel verhogen de complexiteit van de analyse, zoals in ten minste een herhaling, een eiwit van interesse worden geproduceerd in 'light' gelabelde cellen en dus is het noodzakelijk onderscheid te maken tussen eiwitten steeds geïdentificeerd light-monsters (milieuverontreinigende stoffen zoals keratine) en die alleen verrijkt "lichte" monsters wanneer gebonden aan een eiwit van belang.
Hoewel het gebruik van kwantitatieve gegevens maakt onderscheid van specifieke van niet-specifieke interacties door het gebruik van een drempel onvermijdelijk enige echte interacties kunnen worden weggegooid. De bovenstaande aanpak is een eenvoudige en snelle wijze te werk om eiwit: eiwit interacties die gemakkelijk kan worden geprobeerd door onderzoekers zonder eerdere ervaring met massaspectrometrie of analyse van grote eiwit: eiwit interactie datasets. Voor de meeste toepassingen is dit meer dan voldoende voor het identificeren van nieuwe eiwitten van belang. Verdere modificaties deze benadering om dit verlies van gegevens te beperken worden elders in de literatuur beschreven en omvatten het gebruik van een protein frequentie bibliotheek waar bekend verontreinigende eiwitten voor een specifieke set van experimentele parameters (cellijn, kraal matrix, buffer voorwaarden) kunnen worden uitgesloten 10, 14. Afhankelijk van de specifieke experimentele parameters noodzakelijk kan zijn om een aantal controle-experimenten uitgevoerd om een kraal proteoom genereren, kan daardoor stijgt zowel de kosten en complexiteit van het experiment. Meer informatie over deze techniek is beschikbaar op de website www.peptracker.co.uk 14.
Voorts zij opgemerkt dat de hierboven beschreven protocol het mengen verschillend gemerkte monsters aan het einde van de immunoprecipitatie werkwijze (aangeduid als een mixing na zuivering – MAP SILAC experiment). Dit gebeurt als eiwit: eiwit interacties optreden bij een bepaalde evenwichtstoestand 15. Opgemerkt moet worden dat andere groepen deze map SILAC benadering in dit protocol beschreven incubatie van de monsters gecombineerdevóór pulldown (Zuivering na mengen – PAM SILAC) gedurende een langere tijd (20 min tot 2 uur zijn in de literatuur) 15, 16. Gebaseerd op hoe snel een eiwitverhouding daalt tot 01:01, is het mogelijk kwalitatief onderzoek bindingsaffiniteiten en eiwitten stabiele of dynamische interagerende eiwitten 15 definiëren.
Samengevat, SILAC pulldowns vertegenwoordigen een zeer krachtig middel ter identificatie van eiwitten die interageren met een bepaald eiwit van belang, in een fysiologisch relevante instelling. De techniek kan gemakkelijk worden aangepast om een aantal verschillende strategieën zuivering, waardoor de toepassing ervan op een bepaalde proteïne van belang. Kwantificering van resultaten sterk vereenvoudigt identificatie van echte interacties en laat relaxatie stringente buffer omstandigheden gebruikt om niet-specifieke binders te verwijderen en daardoor behoudt lage affiniteit interacties. Als maximaal drie monsters kunnen worden vergeleken in de bovenstaandestrategie, de techniek heeft duidelijke troeven bij het vergelijken van de verschillen in eiwit binding tussen verschillende eiwit isovormen, mutante eiwitten, of het effect van farmacologische remmers. Als geheel gelstukjes worden geanalyseerd in plaats van individuele bands die vlek door Coomassie, het aantal eiwitten geïdentificeerd op groot vertrouwen zijn meestal hoger dan die welke in een standaard GST / TAP-pulldown, en experimentator bias bij het selecteren van eiwitten van belang wordt verwijderd. De techniek vergelijkt daarom zeer gunstig af bij andere veelgebruikte technieken die worden gebruikt bij de identificatie van nieuwe proteïne-interacties (gist 2-hybride, GST / Zijn TAP pulldowns).
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Wellcome Trust en BBSRC IG. IG is een Wellcome Senior Fellow.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |